一种固相合成dna的氨解预处理液及氨解方法
阅读说明：本技术 一种固相合成dna的氨解预处理液及氨解方法 (Ammonolysis pretreatment solution and ammonolysis method for solid-phase synthesis of DNA ) 是由 张钦 樊梓龙 刘俊 赵梦婷 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种固相合成DNA的氨解预处理液及氨解方法,所述DNA氨解预处理液由水与有机溶剂构成；其中,有机体积百分比为70％～80％,所述有机溶剂选自乙腈、乙醇或甲醇中的一种或多种。与现有技术相比,本发明的有益效果在于：通过配制水与乙腈合理比例配制的DNA氨解预处理液,在保证可以提高氨解效率的同时又能进一步提高产率。(The invention provides an ammonolysis pretreatment liquid and an ammonolysis method for synthesizing DNA by a solid phase, wherein the DNA ammonolysis pretreatment liquid consists of water and an organic solvent; wherein the organic volume percentage is 70-80%, and the organic solvent is selected from one or more of acetonitrile, ethanol or methanol. Compared with the prior art, the invention has the beneficial effects that: the DNA ammonolysis pretreatment liquid prepared by reasonable proportion of water and acetonitrile can further improve the yield while ensuring that the ammonolysis efficiency can be improved.)
技术领域
本发明为固相DNA合成领域，具体涉及一种固相合成DNA的氨解预处理液及氨解方法。
背景技术
固相亚磷酰胺三酯法为现在合成DNA的常用方法，其反应的基本原理是溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成3’-5’磷酸二酯键，连接到固相载体上，并依次延伸，直到序列的最后一个5’碱基连接上合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个循环按脱保护、活化、偶合、盖帽及氧化五个步骤依次完成。
在DNA合成仪完成了对DNA的合成步骤后，其产物会连接在固相载体上。接下来会用氨解将产物从固相载体上进行脱离，纯化后得到产物。在现有的氨解方法中，有采用直接进行氨水氨解的，有采用氨气加水蒸气混合氨解的，但是其氨解的效率均不高，导致后续的DNA合成产率受到影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种固相合成DNA的氨解预处理液及氨解方法。
具体技术方案为：
一种DNA氨解预处理液，其不同之处在于，所述DNA氨解预处理液由水与有机溶剂构成；其中，所述有机溶剂的体积百分比为70％～80％，所述有机溶剂选自乙腈、乙醇或甲醇中的一种或多种。
进一步，所述有机溶剂为乙腈。
一种固相合成DNA的氨解方法，其不同之处在于，包括如下步骤：
步骤S1:向用于装有合成DNA片段的固相载体的合成柱内加入上述的DNA氨解预处理液进行润湿；
步骤S2：采用氨气与水蒸气的混合气体进行氨解，然后采用洗脱液进行脱附，得到DNA产物。
进一步，所述步骤S2中，氨解时间为90min，氨解温度为90℃。
进一步，所述步骤S2中，经过氨解处理后，再用洗涤液洗去无机盐，再用洗脱液进行脱附，所述洗脱液为水。
进一步，所述洗涤液为乙腈。
进一步，所述步骤S1中，加入所述氨解预处理液的体积大于所述合成柱的体积。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了用于氨解的预处理液，通过配制水与有机溶剂的合理比例配制的DNA氨解预处理液，在保证可以提高氨解效率的同时又能进一步提高产率。
(2)选取乙腈作为有机溶剂，乙腈无毒，极性大，性质稳定，不与粗产品中的不稳定的试剂发生反应，相较于其余有机溶剂，选其作为氨解预处理液的组分，有利于进一步提高氨解效率与产物产率，且价格低廉，有利于进一步的降低成本。
(3)与现有技术相比，本发明的氨解方法采用DNA氨解预处理液先进行润湿，然后再进行气相氨解，提高了氨解效率，提高了DNA产物的收率。
(4)本发明氨解方法加入氨解柱时，不需要严格控制氨解预处理液的加入含量，操作简便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例涉及原料说明如下：
固相合成DNA的粗品由Mermade192E DNA合成仪进行合成：选择T10mers(TTTTTTTT TT(5’-3’))做为寡核苷酸的序列，合成柱为50nmol通用合成柱(参数：合成柱载量78nmol；CV值：9.1％；气阻值18～22mmHg；CPG Frits体积：50.20ul，品牌：深逗点生物技术有限公司)。
实施例1
本实施例提供一种固相合成DNA的氨解预处理液，具体成分如下：
水：30％(v/v)；乙腈：70％(v/v)。
本实施例还提供一种利用上述DNA氨解预处理液进行氨解的方法，具体操作如下：
(1)将氨解预处理液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至氨解预处理液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用无水乙腈洗去无机盐成分的杂质，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸。
实施例2
本实施例提供一种固相合成DNA的氨解预处理液，具体成分如下：
水：20％(v/v)；乙腈：80％(v/v)。
本实施例还提供一种利用上述DNA氨解预处理液进行氨解的方法，具体操作如下：
(1)将氨解预处理液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至氨解预处理液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用无水乙腈洗去无机盐成分的杂质，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸。
对比例1
本对比例提供一种固相合成DNA的氨解预处理液，具体成分如下：
水：90％(v/v)；乙腈：10％(v/v)。
本对比例还提供一种利用上述DNA氨解预处理液进行氨解的方法，具体操作如下：
(1)将氨解预处理液加入合成柱中，加入体积与实施例3加入的体积相同；并对合成柱进行抽真空处理，直至氨解预处理液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用无水乙腈洗去无机盐成分的杂质，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸。
对比例2
本对比例提供一种固相合成DNA的氨解预处理液，具体成分如下：
水：50％(v/v)；乙腈：50％(v/v)。
本实施例还提供一种利用上述DNA氨解预处理液进行氨解的方法，具体操作如下：
(1)将氨解预处理液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至氨解预处理液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用无水乙腈洗去无机盐成分的杂质，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸。
对比例3
本对比例提供一种固相合成DNA的氨解预处理液，具体成分如下：
水：100％(v/v)。
本对比例还提供一种利用上述DNA氨解预处理液进行氨解的方法，具体操作如下：
(1)将氨解预处理液加入合成柱中，加入体积与实施例3加入的体积相同；并对合成柱进行抽真空处理，直至氨解预处理液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用无水乙腈洗去无机盐成分的杂质，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸。
对比例4
本对比例提供一种DNA氨解方法，具体操作方法与实施例2大体相同，不同的是，无步骤(1)中的氨解预处理液润湿处理。
采用分光光度计来检测将实施例1～实施例2以及对比例1～4的寡核苷酸含量进行检测，加测结果如表1所示。
表1实施例1～2及对比例1～4的寡核苷酸含量测试结果
氨解方法
寡核苷酸含量(A260)
实施例1
16.795
实施例2
17.899
对比例1
4.337
对比例2
10.906
对比例3
4.538
对比例4
15.429
表1中，A260表示寡核苷酸在260nm紫外光的吸收值。
从表1看出，实施例1～2与对比例1～对比例2相比，有机溶剂的体积百分比为70％～80％，其寡核苷酸含量为在16以上；
实施例1～2与对比例3相比，加入了有机溶剂，相较于纯水进行润湿，其产量大幅提高。
实施例1～2与对比例4相比，在氨解前采用了氨解预处理液进行了润湿处理，其产量提高。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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