阅读说明：本技术 一种诱导细菌变形的方法及其应用 (Method for inducing bacterial deformation and application thereof ) 是由 陈力 王蕾 邹琳 于 2018-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明属生物技术领域,涉及改变细菌细胞形态的方法,具体涉及一种恒间隔短回文重复序列相关蛋白2(简称Cas2序列表达蛋白)序列诱导细菌细胞形变的方法及其在用于提高细菌适应性等方面的应用。本发明包括,取编码Cas2蛋白的序列连接到载体上得到重组载体；取重组载体,转化细胞,进行蛋白表达,进而促使杆状细胞发生丝状形变。本发明方法利用源自于细菌的Cas2序列改变了细菌的形态,并且发现Cas2序列能有效增加细菌的适应性,为药物筛选提供了新的分子、条件和方法,具有应用前景。(The invention belongs to the technical field of biology, relates to a method for changing the morphology of bacterial cells, and particularly relates to a method for inducing bacterial cell deformation by a constant interval short palindromic repeat (Cas2) related protein 2 (Cas2 sequence expression protein for short) sequence and application thereof in aspects of improving bacterial adaptability and the like. The method comprises the steps of connecting a Cas2 protein coding sequence to a vector to obtain a recombinant vector; and (3) taking the recombinant vector, transforming the cell, and expressing the protein, thereby promoting the rod-shaped cell to generate filamentous deformation. The method changes the form of the bacteria by using the Cas2 sequence derived from the bacteria, and finds that the Cas2 sequence can effectively increase the adaptability of the bacteria, provides new molecules, conditions and methods for drug screening, and has application prospect.)

一种诱导细菌变形的方法及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及改变细菌细胞形态的方法，具体涉及一种恒间隔短回文重复序列相关蛋白2(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats(CRISPR)associated proteins(Cas)2,简称Cas2序列表达蛋白)序列诱导细菌细胞形变的方法及其在用于提高细菌适应性等方面的用途。

背景技术

资料记载，细菌细胞的基本形态是稳定的，细菌的基本形态是细菌分类和定性的核心特征。研究显示，细菌的基本形态在某些分子存在的条件下会发生改变，这些能够诱导细菌细胞的基本形态发生变化的分子，可称为细胞变形剂。研究报道了细菌细胞变形剂具有很好的应用价值，其中的一部分已成为药物研发的先导化合物，例如，1967年Rosenberg等发现，电场中的顺铂可以诱导杆状细菌发生丝状形变，是细菌细胞变形剂，这一发现，为顺铂成为抗肿瘤药物的研发奠定了基础；还有报道，作用于不同靶点的抗生素药物处理细胞时，被处理的细胞在特定条件下，也会发生细菌变形[Bos,J.,et al.,Emergence ofantibiotic resistance from multinucleated bacterial filaments.Proc Natl AcadSci U S A,2015.112(1):p. 178-83]。

Delumen等于1999年首先报道了多肽类变形剂。该研究团队发现，在细菌中表达植物多肽露那辛(Lunasin)可诱导杆状细菌的丝状形变[Galvez,A.F.and B.O. de Lumen,Asoybean cDNA encoding a chromatin-binding peptide inhibits mitosis ofmammalian cells.Nat Biotechnol,1999.17(5):p.495-500.]，该植物多肽具有潜在的抗肿瘤作用。

Cas2蛋白是细菌成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白，CRISPR -Cas系统是近年发现的控制细菌横向基因转移具有密切关系的一个系统，能够有效地防御基因的水平转移[Barrangou,R.,et al.,CRISPR provides acquired resistanceagainstviruses inprokaryotes.Science,2007.315(5819):p.1709-12. Marraffini,L.A.and E.J.Sontheimer,CRISPRInterference Limits HorizontalGene Transfer inStaphylococci by Targeting DNA.Science,2008.322(5909):p. 1843-1845.]。该系统广泛存在于古生菌及细菌基因组中，为细菌细胞提供了抵抗外源 DNA入侵的机制，有研究表明Cas2在免疫获得过程中起重要作用。

脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingia meningosptica，以下简称Em)是临床上的条件致病菌，可导致新生儿脑膜炎、肺炎、败血症等症状，且在临床上表现为多耐药，有研究在该菌标准的基因组序列中，发现了一个II-C型CRISPR-Cas系统，Cas2Em蛋白来源于Em菌的CRISPR-Cas系统中。有临床研究发现，细菌在体内会发生基本形态的改变，以抵抗免疫系统及药物的攻击。

现有技术中，Cas序列为CRISPR相关基因，不同的Cas序列表达的蛋白功能各不相同，例如核酸酶和整合酶等，现有技术中，对于Cas序列公开的内容集中于在真核细胞基因编辑中的研究，迄今，尚未见有关由细菌基因合成的细菌类变形剂，以及Cas2蛋白的形变作用以及用于增加细菌适应性的研究报道。

基于现有技术的研究现状及基础，本申请的发明人拟提供一种新的改变细菌细胞形态的方法，尤其涉及一种恒间隔短回文重复序列相关蛋白2(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)associated proteins(Cas)2, 简称Cas2序列表达蛋白)序列诱导细菌细胞形变的方法及其在用于提高细菌适应性等方面的用途。

与本发明先关的现有技术有：

1.Rosenberg,B.,et al.,Platinum-induced filamentous growth inEscherichia coli.J Bacteriol,1967.93(2):p.716-21.

2.Bos,J.,et al.,Emergence of antibiotic resistance frommultinucleated bacterial filaments.Proc Natl Acad Sci U S A,2015.112(1):p.178-83.

3.Galvez,A.F.and B.O.de Lumen,A soybean cDNA encoding a chromatin-binding peptide inhibits mitosis of mammalian cells.Nat Biotechnol,1999.17(5):p.495-500.

4.Barrangou,R.,et al.,CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes. Science,2007.315(5819):p.1709-12.

5.Marraffini,L.A.and E.J.Sontheimer,CRISPR Interference LimitsHorizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA.Science,2008.322(5909):p.1843-1845.。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的细菌形变技术的局限性，提供一种新的改变细菌细胞形态的方法，具体涉及一种Cas2序列诱导细菌形变的方法和用途。本发明的Cas2序列不仅诱导细菌形变，还能提高细菌的应变能力，具有广泛的应用前景。

本发明基于临床研究中对未使用抗生素和使用抗生素后细菌的形变观察以及形变与细菌的致病性和耐药性的相关性，作为上述实验思路的延伸，采用Cas2蛋白表达菌作为实验对象，视图筛选针对形变菌抗生素的筛选方案，将抑制剂替换为新型抗生素的候选药物；

本发明经试验表明，在细菌中表达Cas2蛋白及衍生短肽，可诱导细菌发生形变，提高细菌的适应力。与植物多肽类变形剂相比，细菌类变形剂具有种属和结构差异性，可制备新的多肽类细菌变形剂。本发明利用细菌细胞变形剂Cas2Em可以改变细胞的形态并提高其适应性，为新型药物靶标以及抗耐药细菌新药的研发，提供了新的途径，具有广阔的实用性。

本发明通过下述技术方案实现：

取编码Cas2蛋白的序列连接到载体上得到重组载体；取重组载体，转化细胞，进行蛋白表达，进而促使杆状细胞发生丝状形变。本发明利用源自于细菌的Cas2序列改变了细菌的形态，并且发现Cas2序列能有效增加细菌的适应性，为药物筛选提供了新的分子、条件和方法，具有应用前景。

具体的，本发明提供了一种改变细菌细胞形态的方法，尤其是一种Cas2序列诱导改变细菌形态的方法，其包括步骤：

步骤1)，取编码Cas2Em蛋白的DNA序列连接到载体上，得到重组载体；

步骤2)，取获得的重组载体，转染细胞，进行蛋白表达，进而改变细胞的形态。

优选地，编码Cas2蛋白的序列在脑膜炎败血伊丽莎白金菌基因组中分离。

优选地，所述载体为pET-28a(+)。

优选地，所述用于表达重组质粒的细菌为E.coli Top10感受态。

优选地，所述用于表达Cas2Em蛋白的细菌为E.coliBL21(DE3)和E.coliBL21-AI。

本发明中，所述的重组载体包含能编码Cas2Em蛋白C端的30个氨基酸功能域序列；所述的重组载体中的功能域序列为编码Cas2Em蛋白30-101aa的功能域的序列。

本发明中，所述的重组载体通过在编码Cas2蛋白的序列的N端或C端连接其他序列进行构建。

本发明所述的Cas2蛋白导致细菌细胞由杆状变形为丝状。

本发明所述Cas2蛋白为脑膜炎败血伊丽莎白金菌Cas2蛋白(Cas2Em)，Cas基因序列为脑膜炎败血伊丽莎白金菌基因组中分离得到。

本发明所述细菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21-AI等。

优选地，所述细菌为大肠杆菌E.coli。

本发明还提供了由所述方法中的重组载体表达的一种蛋白及衍生蛋白或融合蛋白。

本发明提供了Cas2蛋白及其衍生多肽在制备改变细菌细胞形态制剂中的用途，所述衍生蛋白为如SEQ ID NO.1所示的Cas2蛋白氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸的多肽序列。

优选地，所述用途为Cas2蛋白在诱导正常细菌形变方面的用途。

优选地，所述Cas2蛋白为Cas2Em蛋白。

本发明中，所述Cas2Em蛋白上介于30-101氨基酸之间的任意多肽以及衍生序列。

本发明中，所述的Cas2Em蛋白诱导增加细菌适应性。

本发明经试验显示，Cas2Em在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-AI中诱导表达后，细菌形态由短棒状变为长丝状，经荧光显微镜分析后，Cas2Em在细菌中的表达不影响核酸复制***，但可阻断细胞膜的正常***；对Cas2Em功能结构域进行分析显示，丝状形变可由羧基端(C-段)的30aa的短肽介导；对源自于不同型别CRISPR-Cas系统的Cas2 蛋白的分析显示，由Cas2介导的丝状形变有一定的保守性，为Ⅱ型CRISPR所的Cas2蛋白所特有。

本发明利用在原核细胞中存在Cas2序列，改变细菌的形态有效增加细菌适应性，提示Cas2序列在工业、环境以及新型抗生素和抗肿瘤药物研发领域具有应用前景。与现有技术相比，本发明具有如下特点：本发明利用在脑膜炎败血伊丽莎白金菌中存在的 Cas2序列，改变了细菌细胞形态；利用该方法，可以提高细菌的适应性，在工业及环境微生物及药物研发领域具有广泛的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1：PET28a-Cas2Em表达介导E.coli BL21(DE3)细菌细胞产生长丝状形变；

其中，表达空载(control)和Cas2Em蛋白(Cas2)的光学显微镜结果，IPTG诱导，BL21(DE3)宿主菌标尺25μm；

图2：PET28a-Cas2Em表达介导E.coli BL21-AI细菌细胞产生长丝状形变；

其中，表达空载(control)和Cas2Em蛋白(Cas2)的光学显微镜结果，IPTG诱导，BL21-AI宿主菌标尺25μm；

图3：Cas2Em蛋白的截短突变体介导大肠杆菌细胞产生长丝状形变的结果；

其中显示5个Cas2Em蛋白N端截短突变的表型结果汇总；

图4：来源于不同CRISPR型别的Cas2蛋白介导大肠杆菌细胞产生长丝状形变的结果；

其中，不同型别的Cas2蛋白的表型结果：脑膜炎奈瑟菌(Nm:Neisseriameningitidis)TypeⅡ、脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Em:Elizabethkingia meningoseptica)TypeⅡ、大肠埃希菌(Ec:Escherichia coli)TypeⅠ和结核杆菌 (Tb:Mycobacteriumtuberculosis)TypeⅢ)；

如图1、2所示，PET28a-Cas2Em表达介导E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21-AI 细菌细胞产生长丝状形变；如图3所示截短突变实验表明，Cas2蛋白C末端的30个氨基酸短肽足以介导细菌细胞产生长丝状形变；如图4所示结果证明，诱导细菌长丝状形变的功能为Ⅱ型CRISPR-Cas系统的Cas2蛋白所特有。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1Cas2序列在增加细菌适应性中的用途

本实施例利用Cas2序列分别转染入E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21-AI感受态细胞后，转录翻译的Cas2蛋白介导细胞形变增加细菌适应性中的作用，其中Cas2序列为取自脑膜炎败血伊丽莎白金菌的Cas2序列，E.coli感受态细胞通过公开的市售渠道获得。

本实施例包括如下步骤：

步骤一，重组质粒构建；

先将目的基因进行PCR扩增。目的基因的PCR扩增的反应体系按照表1配制，混匀。

表1 PCR扩增体系

PCR反应程序如下：

目的基因PCR产物的定向克隆：

⑴PCR产物及PET28a载体的双酶切：

PCR产物和pET28a载体用Nco I和Xho I双酶切(举例)，按照表1-3配制酶切体系，混匀后37℃酶切1h。酶切结束后，使用Axygen公司的AxyPrep PCR清洁试剂盒，回收酶切产物，操作步骤按照说明书进行；

表2 质粒DNA的双酶切体系

表3 PCR产物的双酶切体系

⑵目的片段和pET28a载体的连接：

测定酶切纯化后的产物浓度和PET28a的浓度，二者连接体系中的摩尔比分别约为5:1，按照表4配制连接体系，混匀后22℃连接1h；

表4 Cas2基因和PET-28a(+)载体连接体系

⑶连接产物的转化：

将(2)连接产物10μl转化至E.coli Top10感受态细胞，详细步骤如下：

1)从-80℃冰箱中取50μl感受态细胞，于冰上融化，加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰浴放置30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程不要摇动管；

3)向管中加300μl灭菌LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃下200rpm 振荡培养1h，使细菌复苏；

4)将150μl菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上，倒置平板，37℃过夜培养(约12h)；

5)待平板长出菌落后，分散选取6个单菌落在平板底部标记，将每个菌落挑入5mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm振荡培养10h-14h；

⑷重组质粒的抽提：

使用质粒小提试剂盒(Axygen生物公司)提取质粒，步骤如下：

1)将收集4ml菌液，室温12000rpm离心1min，尽量吸去上清，留取沉淀；

2)向上一步的沉淀中加入250μl Buffer A1(确保加入了RNase A)，用移液器或涡流振荡充分悬浮细菌细胞；

3)再向离心管中加入250μlBuffer B1(预先加入RNase A)，温和地上下翻转10 次使菌体混合均匀，然后静置5min至溶液粘稠而澄清；

4)再向离心管中加入350μl Buffer N1，立即温和地上下翻转多次混匀，此时出现白色絮状沉淀；

5)室温12000rpm离心10min，如果上清中还有白色沉淀，可再次离心；

6)小心吸取离心后的上清液，转入带有收集管的DNA柱中，注意避免吸到沉淀，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

7)再向DNA柱中加入500mL Buffer KB，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

8)向离心柱中加500μl DNA wash buffer(确保加入乙醇)，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

9)重复上一步操作；

10)将离心柱放回离心机中，室温12000rpm开盖离心5min，除去残余的乙醇；

11)将离心柱转至新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中央悬空滴加70μl ElutionBuffer，室温放置5min，12000rpm离心1min，将洗脱液重新滴加到吸附膜中央， 12000rpm离心1min，收集含有质粒的洗脱液；

12)质粒提取后，用Nanodrop 2000c检测产物的浓度及纯度；

⑸重组质粒的双酶切鉴定：

对上一步提取的质粒DNA用Xho I和Nco I进行双酶切鉴定，依据测定的质粒浓度，按照表5配制酶切体系，37℃酶切1h，剩余的质粒保存备用；

表5 双酶切鉴定的反应体系

酶切产物分别用相对应浓度的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，DNA Marker使用DL2000和λ-Hind III(使用前60℃加热5min)‘’

步骤二，转染与收样；

1)从-80℃冰箱中取50μl E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21-AI感受态细胞，于冰上融化，加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰浴放置30min。

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程不要摇动管‘’

3)向管中加300μl灭菌LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃下200rpm 振荡培养1h，使细菌复苏。

4)将150μl菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上，倒置平板，37℃过夜培养(约12h)；

5)待平板长出菌落后，分散选取3个单菌落在平板底部标记，将每个菌落挑入5mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm振荡培养10h-14h饱和状态；

6)上述菌液经过稀释后得到10²-10⁵浓度的细菌；

7)分别取100ul上述菌液涂布在对照平板和混有生长抑制剂(如IPTG)平板上。 37℃过夜培养，观察菌落生长情况。

表6和7显示结果，在抑制剂存在的条件下，没有Cas2蛋白表达的BL21(DE3)菌不能生长，Cas2蛋白表达菌可以长出菌落，同样结果在BL21-AI中得到验证(如表8 和9所示)，说明Cas2蛋白能提高细菌的适应性。

表6：28℃下BL21(DE3)菌落生长情况

表7：37℃下BL21(DE3)菌落生长情况

表8：28℃下BL21-AI菌落生长情况

表9：37℃下BL21-AI菌落生长情况

实验结果表明，采用Cas2序列表达得到的蛋白，能够有效改变细菌形态，提高细菌的适应性，具有意想不到的技术效果，实践应用前景十分广阔。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要明确的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种诱导细菌变形的方法及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> Casarea dussumieri

<400> 1

Met Trp Val Leu Val Leu Tyr Asp Leu Pro Thr Glu Thr Lys Glu Asn

1 5 10 15

Met Arg Asp Ala Asn Leu Phe Arg Lys Arg Leu Leu Asp Asp Gly Phe

20 25 30

Ser Leu Phe Gln Phe Ser Met Tyr Ile Arg His Cys Pro Ser Arg Glu

35 40 45

Asn Ala Glu Val His Ile Lys Arg Val Lys Val Met Leu Pro Lys Ala

50 55 60

Gly Lys Val Ala Ile Met Cys Ile Thr Asp Lys Gln Phe Gly Asp Ile

65 70 75 80

Glu Ile Phe Phe Ala Arg Asn Lys Glu Glu Pro Pro Pro Thr Phe Gln

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Phe

100