阅读说明：本技术 基于高阶g4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用 (Preparation and application of electrochemical sensor for detecting acetyltransferase activity based on high-order G4 and acetyl antibody ) 是由 胡宇芳 张青青 胡丹丹 詹甜玉 王邃 郭智勇 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用,具体步骤如下：金电极预处理,底物肽溶液涂覆Au电极。将底物肽修饰电极置于HAT p300反应混合物中孵育,滴加DNA探针-乙酰化抗体混合液,加入TdT反应混合液使DNA延长生成随机排布的富G的DNA长链,利用钾离子使其形成N个随机G4结构,然后再加入大量DNAG链使其在镁离子的状态下叠加到随机G4结构上形成高阶G4。然后滴加hemin,使高阶G4具有辣根过氧化物酶活性,通过TMB+H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>实现电化学信号输出,并用来检测乙酰转移酶活性及其抑制剂的筛选。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。(The invention discloses preparation and application of an electrochemical sensor for detecting activity of acetyl transferase based on high-order G4 and acetyl antibody, which comprises the following specific steps: pretreating a gold electrode, and coating an Au electrode with a substrate peptide solution. Placing a substrate peptide modified electrode in an HAT p300 reaction mixture for incubation, dropwise adding a DNA probe-acetylated antibody mixed solution, adding a TdT reaction mixed solution to extend DNA to generate randomly arranged G-rich DNA long chains, forming N random G4 structures by using potassium ions, and then adding a large number of DNAG chains to be superposed on the random G4 structures in a magnesium ion state to form high-order G4. Then hemin was added dropwise to make higher order G4 having horseradish peroxidase activity, through TMB + H 2 O 2 Realizes electrochemical signal output and is used for detecting the activity of the acetyltransferase and screening inhibitors thereof. The method has the advantages of good specificity, high sensitivity, high detection speed, accurate and reliable result and low cost.)

基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感 器制备及应用

技术领域

本发明涉及一种组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及检测方法，尤其是涉及一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

组蛋白修饰是组蛋白蛋白的共价翻译后修饰，在表观遗传调控中至关重要。由于组蛋白改变，可以可控制地进行多种生物学事件，例如转录激活/失活，染色体包装和DNA损伤/修复。特别是赖氨酸残基的可逆乙酰化，是组蛋白修饰的主要机制之一。组蛋白赖氨酸乙酰化的水平由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的拮抗催化活性精确介导。通过乙酰化，HAT减少了组蛋白与其包裹DNA之间的静电相互作用，产生了一种开放的染色质结构，用于调节蛋白的可及性。相比之下，HDAC催化乙酰基的去除并增强组蛋白和基因的连接，从而导致封闭的染色体配置和转录抑制。HAT异常活动，诱导组蛋白乙酰化的干扰，已被证实与许多疾病的病因有关，包括癌症、神经障碍、慢性炎症和艾滋病感染。迄今为止，HAT已成为一类新的药物靶点，HAT靶向抑制剂也正在广泛研究中。为了满足HAT相关分析检测的需求，需要开发简便的HAT活性检测方法，这对于临床诊断的药物开发和药物研究具有重要意义，对于更好地理解表观遗传学相关研究也是必不可少的。

电化学技术因其优异的灵敏度和便于操作等优点而备受关注。如今，核酸纳米结构如DNA四聚体结构、类核酸结构，在翻译后修饰电化学传感领域中显示出显着的应用。最近，G-四链体(G4)的功能性核酸作为通用分子工具包引起了极大的兴趣。通常，G4是独特的四链核酸结构，其通过堆叠Hoogsteen碱基配对的G-四联体形成，并且这种现象在富含G的序列中是普遍的。结合电化学具有操作简单、快速响应、低背景、高灵敏度和低仪器要求的优点，是目前用于生物传感的比较有前途的一种技术。

本发明提出了一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器的制备方法，首先将含巯基的底物多肽修饰至金电极表面，当乙酰化反应发生之后，乙酰辅酶A在乙酰转移酶的作用下将乙酰基转移到底物多肽的特定赖氨酸残基上，得到乙酰化的多肽，利用乙酰基和乙酰基抗体的特异性结合作用，将乙酰基抗体-DNA探针的复合物固化到电极表面，再利用TdT延长扩增作用使得DNA探针形成富G DNA长链，在钾离子存在时随机形成N个G-四联体，随后引入一条含有多个G碱基的DNA G链，在镁离子存在下DNA G链会快速形成G-四联体，并有序堆叠到TdT延伸的G-四联体上，这些G-四联体结构通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶。过氧化氢(H₂O₂)在3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应，产生明显的电化学响应。目前，国内外尚未发现基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器的制备方法及应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，具体步骤如下：

(1)金电极预处理：将金电极(Au)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光0.5～5min，抛光后将电极用二次蒸馏水于超声清洗器中超声清洗0.5～5min。然后用洗耳球吹去金电极表面水珠，用滤纸擦干电极外部，备用。

(2)电极1：用底物肽(P)溶液(20～2000μM，2～12μL)涂覆Au电极并在4℃下保持过夜，然后用磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0，100mM)洗涤。之后，将电极浸入0.05～2mM 1-己硫醇(MCH)溶液中20～70min，然后用PBS缓冲液冲洗表面。HAT p300反应混合物(20～2000μL)包括不同浓度的p300、100～5000μM Ac-CoA和PBS缓冲液。将底物多肽修饰的电极置于HATp300反应混合物中并在25～42℃下孵育20～150min。温育后，用PBS缓冲液洗涤电极以除去过量的试剂，并如前所述在氮气流中干燥。

(3)电极2：在含10～80mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50～100mM 11-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的PBS溶液(100μL)中，用移液枪加入DNA探针(0.05～1μM，2～12μL)和乙酰化抗体(Ab_Ac)(1×10^-4～1×10^-2mg/mL，2～12μL)，并在25～42℃下孵育0.5～1.6h，得乙酰化抗体-DNA探针复合物。取2～12μL该复合物滴到电极1表面，孵育0.1～1h。

(4)电极3：在电极2置于TdT反应混合液【0.5～3μL二次蒸馏水+dATP(1～30mM，0.1～6μL)+dGTP(1～30mM，0.1～6μL)+TdT(1～100U/mL，0.1～5μL)+0.5～5μL 5×TdTbuffer】中，在28～440℃下孵育0.4～1.7h，用PBS缓冲液缓缓冲洗。然后在电极上滴加KCl溶液(0.05～2mM，1～7μL)，常温下孵育20～90min。之后滴加G4链混合液【MgCl₂(0.05～0.5M，1～5μL)+G4(0.5～10μM，1～10μL)】，常温下放置0.6～1.2h，然后滴加hemin(0.05～0.8mM，1～10μL)，常温下放置15～45min，使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-hemin复合物。

如在实验步骤中没有提示，这些修饰电极每步均用PBS缓冲液缓缓冲洗。

底物多肽序列：CRGKGGKGLKGGAKA。

DNA探针：5’-NH₂-ACGGTT-3’。

DNA G链：5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’。

发明原理：利用上述一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，采用金电极Au，通过Au-S键固定底物肽，再通过进行乙酰化反应从Ac-CoA将乙酰基转移到底物多肽的赖氨酸残基上，通过抗原-抗体相互作用，TdT延长扩增多用，G4堆叠作用进而制备传感器，利用传感器对TMB+H₂O₂的电化学响应实现电化学输出。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学发光响应对HAT p300浓度对数值的线性相关方程为y＝＝-11.37lgC_p300-24.58，R²＝0.9947，线性范围为0.01～100nM，检测限为1pM，由此说明传感器对HAT p300可实现高灵敏检测。

(2)高特异性。常见其他相关酶对本检测体系均无干扰。原因在于：本发明是基于HAT p300催化乙酰化反应生成，生成乙酰基的量影响到与信号单元的结合，其他酶无法催化乙酰化反应，故对本检测体系无干扰。

(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。

(4)抑制剂。利用该电化学发光生物传感器对***发光体的电化学响应，实现对HAT p300抑制剂(如漆树酸(Anacardic Acid)、C646)的检测，可以得出传感器的电化学发光响应与HAT p300抑制剂的相关关系。

(5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。

综上所述，本发明制备一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度HAT p300的检测及其小分子抑制剂的筛选，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的不同修饰电极对比的电化学响应；

图2为本发明传感器的可行性实验图；

图3为本发明传感器对不同浓度HAT p300的电化学响应对HAT p300浓度的对数校准曲线图；

图4为本发明传感器的选择性实验图；

图5为本发明传感器的抗干扰实验图；

图6为不同浓度漆树酸对HAT p300活性的抑制作用；

图7为不同浓度C646对HAT p300活性的抑制作用。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1传感器的制备

(1)金电极预处理：将金电极(Au)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2min，抛光后将电极用二次蒸馏水于超声清洗器中超声清洗2min。然后用洗耳球吹去金电极表面水珠，用滤纸擦干电极外部，备用。

(2)电极1：用底物肽(P)溶液(200μM，10μL)涂覆Au电极并在4℃下保持过夜，然后用磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0，100mM)洗涤。之后，将电极浸入0.1mM1-己硫醇(MCH)溶液中30min，然后用PBS缓冲液冲洗表面。HAT p300反应混合物(200μL)包括不同浓度的p300、500μM Ac-CoA和PBS缓冲液。将底物多肽修饰的电极置于HAT p300反应混合物中并在30℃下孵育80min。温育后，用PBS缓冲液洗涤电极以除去过量的试剂，并如前所述在氮气流中干燥。

(3)电极2：在含100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和100mM 11-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的PBS溶液(100μL)中，用移液枪加入DNA探针(0.1μM，2μL)和乙酰化抗体(Ab_Ac)(5×10^-4mg/mL，2μL)，并在25℃下孵育1h，得乙酰化抗体-DNA探针复合物。取5μL该复合物滴到电极1表面，孵育1h。

(4)电极3：在电极2置于TdT反应混合液【2μL二次蒸馏水+dATP(10mM，0.4μL)+dGTP(10mM，0.6μL)+TdT(10U/mL，1μL)+1μL5×TdT buffer】中，在37℃下孵育1h，用PBS缓冲液缓缓冲洗。然后在电极上滴加KCl溶液(0.2mM，2μL)，常温下孵育30min。之后滴加G4链混合液【MgCl₂(0.12M，2μL)+G4(1μM，2μL)】，常温下放置1h，然后滴加hemin(0.2mM，2μL)，常温下放置30min，使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-hemin复合物。

结果如图1，仅电极3对过氧化氢的电化学响应明显，证明传感器制备成功，且对过氧化氢有良好的电催化活性。

实施例2可行性实验

制备传感器的过程中，同具体实施例1，探究乙酰化反应中，存在或不存在p300时，制得的传感器的电化学响应对比，结果如图2，存在p300时，具有明显的电化学响应，证明传感器可用于对HAT p300的酶活检测。

实施例3 HAT p300酶活检测

传感器的制备过程同具体实施例1，在HAT p300酶活检测时，乙酰化反应中，控制HAT p300的终浓度为(0，0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、500nM)，然后用于制备传感器。记录传感器在PBS(100mM，pH 7.0)中的电化学响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度HAT p300对应的电化学响应曲线，建立电化学响应信号大小与HAT p300浓度对数之间的线性关系。实验结果如图3所示，说明随着HAT p300浓度增大，传感器的电化学响应越明显，线性相关方程为y＝-11.37lgC_p300-24.58，R2＝0.9947，线性范围为0.01～100nM，检测限为1pM，说明传感器对HAT p300活性可实现高灵敏检测。

实施例4特异性检测

选择性和抗干扰性实验中HAT p300及其他酶的浓度均为100nM，所用到的其他酶的缩写如下：乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱氧化酶(ChOx)、溶菌酶(LZM)、凝血酶(TB)、木瓜蛋白酶(Papain)、碱性磷酸酶(ALP)。

按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，用其他相同浓度的酶代替HATp300，制备得到传感器。结果如图4所示，与HAT p300对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于HAT p300的检测有很好的选择性。

按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，其他相同浓度的酶与HAT p300同时存在，制备得到传感器。结果如图5所示，其他酶的加入基本没有影响传感器的电化学发光响应，说明传感器对于HAT p300的检测有很好的抗干扰性。

实施例5抑制剂检测

HAT p300抑制剂筛选检测时，按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，HAT p300的终浓度为100nM，控制漆树酸的终浓度为(0、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300、500、1000μM)或C646的终浓度为(0、0.01、0.04、0.1、0.4、1、4、10、40、100、200、500μM)，然后用于制备传感器。记录传感器在PBS(100mM，pH 7.0)中的电化学响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度抑制剂对应的电化学响应曲线，建立电化学响应信号大小与抑制剂浓度对数之间的关系。实验结果如图6和图7所示，漆树酸和C646的半抑制浓度分别为15.0μM和1.6μM。说明两种抑制剂对HAT p300均有良好的抑制效果。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。