阅读说明：本技术 生物转化和产物回收工艺的改进 (Improvements in bioconversion and product recovery processes ) 是由 M·J·H·莫兹利 M·E·马丁 K·F·斯玛特 R·J·布伦茨 于 2018-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种减少生产后物流中产物的生物催化氧化的方法。更特别地,本发明提供了用于减少产物流中的醇的生物催化氧化的方法,所述产物流包含醇产物、溶解的二氧化碳和至少一种能够氧化所述醇的酶。本发明可用于发酵工艺,其中C1固定微生物利用含C1的底物产生发酵产物。(The present invention provides a method for reducing biocatalytic oxidation of products in a post-production stream. More particularly, the present invention provides a process for reducing biocatalytic oxidation of an alcohol in a product stream comprising an alcohol product, dissolved carbon dioxide and at least one enzyme capable of oxidizing said alcohol. The present invention is useful in fermentation processes where a C1 immobilized microorganism utilizes a C1 containing substrate to produce a fermentation product.)

生物转化和产物回收工艺的改进

背景技术

二氧化碳(CO₂)占由人类活动引起的全球温室气体排放的约76％，其中余下的是甲烷(16％)、一氧化二氮(6％)和氟化气体(2％)(美国环境保护局(United StatesEnvironmental Protection Agency))。尽管工业和林业实践也向大气排放CO₂，但大部分CO₂来自产生能量的化石燃料的燃烧。减少温室气体排放，特别是CO₂排放，对于停止全球变暖的进程以及随之而来的气候和天气变化至关重要。

早已认识到，催化工艺(如费托工艺(Fischer-Tropsch process))可用于将含有二氧化碳(CO₂)、一氧化碳(CO)和/或氢气(H₂)的气体，如工业废气或合成气转化成各种燃料和化学品。然而，最近，气体发酵已成为用于对这类气体中的碳进行生物固定的替代平台。具体来说，已证明C1-固定微生物将含有CO₂、CO和/或H₂的气体转化成如乙醇和2,3-丁二醇的产物。

对化石燃料温室气体(GHG)排放的环境关注已导致对可再生能源的日益重视。因此，乙醇在世界范围内迅速成为主要的富氢液体运输燃料。基于欧洲、日本和美国以及一些发展中国家对乙醇生产的日益重视，预计在可预见的将来，燃料乙醇工业的全球市场将持续增长。例如，在美国，乙醇用于生产E10，即10％乙醇在汽油中的混合物。在E10混合物中，乙醇组分作为补氧剂，提高了燃烧效率并减少了空气污染物的产生。在巴西，乙醇既作为混合在汽油中的补氧剂，又作为其本身的纯燃料，满足运输燃料需求的约30％。此外，欧盟(EU)已为其每个成员国规定了消耗可持续运输燃料(如生物质衍生的乙醇)的法定目标。

绝大多数燃料乙醇是通过基于酵母的传统发酵工艺生产的，所述工艺使用农作物衍生的碳水化合物，如从甘蔗中提取的蔗糖或从谷类作物中提取的淀粉作为主要碳源。但是，这些碳水化合物原料的成本受其在竞争用途(即作为人类和动物的食物来源)市场中的价值的影响。另外，用于乙醇生产的生产淀粉或蔗糖的作物的种植在所有地区都不是经济上可持续的，因为这是当地土地价值和气候的共同作用。由于这些原因，开发将低成本和/或更丰富的碳资源转化为燃料乙醇的技术尤为重要。在这方面，一氧化碳(CO)是有机材料(如煤、石油和石油衍生产品)不完全燃烧的主要的、富能量的副产品。富含CO的废气来自多种工业工艺。例如，据报道，澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气排放超过500,000公吨的CO。

最近，以微生物(细菌)为基础的以工业规模从CO生产乙醇的工艺替代方案已成为商业利益和投资的主题。1903年首次发现了以CO为唯一碳源的微生物培养物的生长能力。后来确定此特性在于有机体利用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生化途径(也称为Woods-Ljungdahl途径和一氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合酶(CODH/ACS)途径)。已证明大量厌氧生物，包括一氧化碳营养、光合、产甲烷和产乙酸生物，可以代谢CO。已知厌氧细菌，如来自梭状芽胞杆菌属的那些，可通过乙酰CoA生化途径从CO、CO₂和H₂中产生乙醇。例如，在WO 00/68407；EP 1117309 A1；US 5,173,429；US 5,593,886；US 6,368,819；WO 98/00558；和WO 02/08438中描述了由气体产生乙醇的各种永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)的菌株。还已知细菌自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum sp)会从气体中产生乙醇(Abrini等人,《微生物学档案(Archives of Microbiology)》161:345-351(1994))。

由于生物体的酶有特异性，对某种产物的选择性可能极高(100％)，从而使微生物合成途径比费托(FT)催化能获得更高的产率。相较于FT催化的其它益处包括在接近环境温度和接近大气压力下操作；以及能够使用不同比率的CO、H₂和CO₂。另外，对由反应介质中的杂质造成的催化剂中毒的担忧也减少了。尽管从CO微生物合成乙醇具有这些明显的优势，但就确保生产率具有竞争力而言，这些工艺仍必须与其它技术竞争。当使用CO作为其碳和能量来源时，上述厌氧细菌通过发酵产生乙醇，但是它们也产生至少一种其它代谢物，例如CO₂、甲烷、正丁醇和/或乙酸。这些代谢物中的任何一种的形成都有可能显著影响给定工艺的生产率和总体经济可行性，因为可利用的碳会损失到一种或多种代谢物中，并且所需最终产品的生产效率会受到损害。另外，除非代谢物(例如，乙酸)本身在微生物发酵工艺的时间和地点具有价值，否则它可能造成废物处理问题。在WO2007/117157、WO2008/115080和WO2009/022925中讨论了用于解决在含CO气体的厌氧发酵以制备乙醇中除所需最终产物之外的产物形成的各种建议。

乙醇生产率是决定给定发酵工艺是否具有经济吸引力的关键因素，它在很大程度上取决于管理细菌生长的适当条件。例如，从WO2010/093262得知，必须以导致最佳微生物生长和/或所需代谢物产生的速率将含CO的底物提供给微生物培养物。如果提供的底物不足，则微生物的生长会变慢，并且发酵产物的产率会向乙酸偏移，而乙醇却会损失。如果提供过多的底物，则会导致微生物生长不良和/或细胞死亡。关于这些工艺中的操作参数之间的关系的其它信息可在WO2011/002318中找到。

由CO，并且尤其是含CO的废物流，如工业工艺中排放的气态流出物，来生产乙醇的生物工艺技术，正在不断地寻求提高工艺经济性并因此提高工业竞争力的解决方案。一个感兴趣的领域涉及在产物回收阶段之前在生物反应器下游的发酵液中保持所需产物的产率。在某些条件下，许多能够产生乙醇的C1固定微生物也能够将乙醇氧化为其它产物。使乙醇氧化的条件可以在乙醇生产设备中找到。在回收乙醇产物之前，乙醇的微生物氧化代表所需乙醇产物的损失。

发明内容

本发明的方面涉及生物转化和产物回收工艺的改进。

一方面，本发明提供了一种减少产物流中乙醇的生物催化氧化的方法。在一种实施方式中，产物流包含醇、溶解的二氧化碳(CO₂)和至少一种能够氧化所述醇的酶。在某些实施方式中，产物流从生物反应器流至前产物回收区，并进行处理以减少醇向其相应羧酸的转化。

在一种实施方式中，产物流包含(i)乙醇，(ii)溶解的二氧化碳和(iii)微生物培养物，微生物培养物包含至少一种能够氧化乙醇的微生物。在一种实施方式中，微生物是具有一种或多种能够将乙醇转化为乙酸的酶的C1固定微生物。

在一种实施方式中，处理产物流(即处理步骤)包括向产物流鼓泡惰性气体。鼓泡到产物流中的惰性气体置换了产物流中至少一部分溶解的CO₂。在某些实施方式中，惰性气体置换了产物流中基本上全部溶解的CO₂。合适的惰性气体的实例包括但不限于氮气和甲烷。在优选的实施方式中，惰性气体是氮气。在替代实施方式中，氢气用于从产物流中置换溶解的CO₂。

在一种实施方式中，处理步骤包括提高产物流的温度。在某些实施方式中，将产物流的温度升高至使能够氧化乙醇的酶失活的温度。在一种实施方式中，产物流的温度升高至至少50℃，或至少60℃，或至少70℃，或至少75℃，或至少78℃。在一种实施方式中，产物流的温度在确定的温度之上保持至少10秒，或至少20秒，或至少30秒，或至少1分钟，或至少2分钟，或至少3分钟，或至少5分钟，或至少10分钟。优选地，产物流的温度在确定的温度之上保持10秒至30秒，或10秒至一分钟，或10秒至两分钟。在一种实施方式中，将产物流的温度升高至至少60℃，并在此温度下保持至少1分钟。在一种实施方式中，将产物流的温度升高至至少75℃，并在此温度下保持至少5分钟。

在一种实施方式中，处理步骤包括使产物流减压。在一种或多种实施方式中，生物反应器在压力下操作，从而产生加压的产物流。在一种或多种实施方式中，当生物反应器在压力下操作时，通过减压对产物流进行处理。在一种或多种实施方式中，产物流的减压发生在单独的容器中。在一种实施方式中，减压发生在收集罐中的大气压下。在某些实施方式中，减压提供从产物流中闪蒸出溶解的CO₂，这导致了溶解的CO₂从产物流中的置换。在一种实施方式中，产物流的压力在减压之前为至少0.25巴表压，或至少0.5巴表压，或至少1.0巴表压，或至少1.5巴表压，或至少2.0巴表压，或至少2.5巴表压，或至少3.0巴表压。在一种实施方式中，产物流的压力在减压之前在高于大气压力下保持至少1秒，或至少10秒，或至少15秒，或至少20秒，或至少25秒，或至少30秒。优选地，在减压之前，产物流的压力在高于大气压力下保持1至30秒，或1秒至15秒，或15秒至30秒。在一种实施方式中，在减压之前，产物流的压力为至少2.0巴表压，并且保持在此压力下至少1秒。在一种实施方式中，在减压之前，产物流的压力为至少0.25巴表压，并且保持在此压力下至少30秒。

在一种实施方式中，生物质包含至少一种C1固定微生物。在一种实施方式中，C1固定微生物包含选自由乙醇脱氢酶、醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶组成的组中的至少一种酶。

在一种实施方式中，生物质包含至少一种非C1固定微生物。在一种实施方式中，非C1固定微生物包含选自由醇脱氢酶、醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶组成的组中的至少一种酶。在一种或多种实施方式中，非C1固定微生物是醋杆菌属(Acetobacter)。

在一种实施方式中，本发明包括将含C1的底物进料至生物反应器系统，所述系统包括至少第一生物反应器，所述第一生物反应器包括培养基和C1固定细菌，以代谢含C1的底物中的碳源并产生至少一种发酵产物；从生物反应器系统中取出包括细菌的排放物流，用氮气鼓泡所述排放物流以置换所述排放物流中的CO₂组分，并将贫乏CO₂的物流传至产物回收区以回收至少一种发酵产物。

在替代的实施方式中，本发明包括将含C1的底物进料到生物反应器系统，所述系统包括至少第一生物反应器，所述第一生物反应器包括培养基和细菌以代谢底物中的碳源并产生至少一种发酵产物；从生物反应器系统中取出包含细菌的排放物流，加热所述排放物流以使所述排放物流中所含的一种或多种酶变性并提供经处理的物流，然后将经处理的物流传至产物回收区以回收至少一种发酵产物。

在替代实施方式中，本发明包括将含C1的底物进料到加压的生物反应器中，所述加压的生物反应器包括至少第一生物反应器，所述第一生物反应器包括培养基和细菌以代谢底物中的碳源并产生至少一种发酵产物；从加压的生物反应器系统中取出包含细菌的排放物流，通过闪蒸使排放物流减压以置换排放物流中的CO₂组分，并使贫乏CO₂的物流传至产物回收区以回收至少一种发酵产物。

在一种实施方式中，C1固定细菌选自由梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)和醋酸杆菌属(Acetobacterium)组成的组。在一种实施方式中，C1固定细菌选自由自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)组成的组。

在一种实施方式中，前产物回收区包括一个或多个容器和/或导管，设置在生产区的下游和产物回收区的上游。在一种实施方式中，生产区是生物反应器，且产物回收区是蒸馏区。在一种实施方式中，前产物回收区是储存容器。在一种实施方式中，储存容器是收集罐。前产物回收区还包括一个或多个液体导管，其设置用于将排放物流从生物反应器进料到收集罐，并且从收集罐进料到产物回收模块。在一种实施方式中，将排放物从生物反应器通过导管直接进料至产物回收区。在某些实施方式中，排放物的第一部分被直接提供到产物回收区，并且排放物的第二部分被提供至收集罐。

在第二方面，本发明提供了减少产物流中乙醇的生物催化氧化的方法，其中产物流包含乙醇、CO₂和至少一种能够氧化乙醇的酶，所述方法包括(i)使产物流从生物反应器流动到前产物回收区；以及(ii)处理产物流以减少乙醇向乙酸的转化。在一种实施方式中，产物流是在无细胞系统中产生的。

附图说明

图1描绘了利用两个生物反应器的代表性生物反应器系统。

图2描绘了包括储存区的代表性系统，所述储存区从图1的生物反应器系统接收渗透物流和排放物流，并将流提供给产物回收模块。

图3a、图3b、图3c和图3d描绘了根据各种实施方式的用于从排放物流中置换CO₂的收集罐的各种布置。

图4：当从生物反应器中取出一式三份的细胞并将其置于CO₂顶部空间时，随时间变化的代谢物浓度

图5：当从生物反应器中取出一式三份的细胞并将其置于N₂顶部空间时，随时间变化的代谢物浓度。

图6示出了乙酸和乙醇滴定度随时间的变化，与乙酸收益/乙醇损失相关，以及热处理对乙醇损失的影响。

具体实施方式

在商业规模的生产操作中，通常在将产物流运送到产物回收区之前将其运送到储存装置。发明人已经发现，当在产物流的处理中存在延迟时，可能发生不期望的反应，其可能导致所需最终产物转化为不期望的产物。通过防止这种反应，可以保持所需产物的产率。

发明人已经开发出基本上减少或防止在生产后流中发生不期望的反应的方法，所述反应可能导致所需最终产物转化为不期望的产物。本发明可以应用于发酵技术，特别是使用产乙酸细菌的气体发酵工艺。另外，本发明可以应用于无细胞技术工艺中，以防止无细胞生产工艺中一种或多种酶的逆反应。

尽管以下描述涉及乙醇发酵，但是认为这些教导同样适用于其它伯醇发酵工艺和纯化工艺。此外，尽管所提供的实施方式涉及气体发酵过程，但是认为本发明可适用于产生包含一种或多种发酵产物和一种或多种能够氧化一种或多种发酵产物的酶的发酵液的任何发酵工艺。在一种实施方式中，发酵产物是伯醇，并且一种或多种酶是能够将伯醇转化为其相应的羧酸的酶。示例性的伯醇包括但不限于丁醇、1-丙醇和1-辛醇。此外，尽管本发明适用于由生产菌株产生的发酵产物，但本发明也适用于由可能存在于生物反应器中的任何污染微生物分泌的产物。

术语“渗透物流”是从生物反应器中取出的经过处理以除去生物质组分的液体流。通常，生物质通过过滤除去，然后返回至生物反应器。

术语“排放物流”是指从生物反应器中取出的液体流。通常，排放物流是未过滤的，并且包含生物质、液体产物以及溶解和夹带的气体。

术语“产物流”是指包含至少一种产物例如乙醇的液体流。优选地，产物流是已经离开生产工艺的物流。例如，产物流可以是在被产物回收装置接收之前离开生物反应器的液体流。产物流可以是渗透物流或排放物流。产物流可以是排放物流和渗透物流的组合。

术语“生物催化氧化”是指由于存在一种或多种能够进行此反应的酶而将伯醇(即乙醇)氧化成其相应的酸(即乙酸)的过程。一种或多种酶可以在无细胞系统中提供，或者可以包含在细菌培养物中。

术语“前产物回收区”是指生物反应器下游和产物回收模块上游的区域。前产物回收区接收经由至少一个出口离开生物反应器的排放物流和/或渗透物流中的至少一种，并将所述产物流进料至产物回收装置，如蒸馏装置。前产物回收包括用于将产物流从生物反应器系统传至产物回收模块的至少一个导管，并且可以进一步包含储存容器如收集罐，其用于在将产物流传至产物回收模块之前储存一部分产物流。

术语“溶解的CO₂”是指以溶解气体的形式存在于液体流中的CO₂。溶解的CO₂可以提供于多种液体流中，包括但不限于发酵液、液体营养培养基、排放物流、渗透物流或产物流。

术语“夹带的CO₂”是指将CO₂气泡截留在液体流中。夹带的CO₂可以提供于多种液体流中，包括但不限于发酵液、液体营养培养基、排放物流、渗透物流或产物流。

通常，发酵在生物反应器中进行。术语“生物反应器”包括由一个或多个容器、塔或管道布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适合气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方式中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所用，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长期和产物生物合成期。

培养通常在含有足以允许微生物生长的营养物、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是所属领域中众所周知的。

培养/发酵应该理想地在产生目标产物的适当条件下进行。通常，培养/发酵在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的气体不会变成限制因素的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。具体来说，可以控制底物的引入速率来确保液相中的气体的浓度不会变成限制因素，因为在气体限制条件下培养会消耗产物。

在升高的压力下操作生物反应器可以提高气-液转移速率。因此，在高于大气压力的压力下进行培养/发酵通常是优选的。此外，由于给定的气体转化率在某种程度上随底物保留时间而变并且保留时间指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低培养/发酵设备的建设成本。这又意味着当在升高的压力而不是大气压力下维持生物反应器时，能够缩短保留时间，保留时间被定义为是生物反应器中的液体体积除以输入气体流速。最佳反应条件将部分取决于所用的特定微生物。然而，一般来说，在高于大气压力的压力下进行发酵是优选的。

在某些实施方式中，发酵在没有光的情况下或在不足以满足光合微生物的能量需求的光量存在下进行。在某些实施方式中，本发明的微生物是非光合微生物。

在生物反应器系统的正常运行期间，液体产物的净生成要求优选地连续取出这些产物，以防止它们在每个生物反应器中积累，从而保持稳态条件。如果所有取出的液体都具有与生物反应器中存在的相同的总成分(包括相同浓度的细菌和培养基组分)，则所述生物反应器，尽管关于乙醇和乙酸浓度在稳态下运行，会逐渐耗尽细菌浓度。在这种情况下，相对于细菌的生产率(生长)而言，乙醇的生产率更高将定向地导致来自给定生物反应器的细菌耗尽速率更快。为了通过提供额外的操作自由度来维持细菌浓度，可以从给定的生物反应器中取出液体产物，作为未过滤的物流(即排放物流)或过滤的物流(即渗透物流)。排放物流是未过滤的物流，其具有与生物反应器中存在的发酵液基本相同的总成分，或至少基本相同的细菌浓度。过滤后的物流是从生物反应器中取出并传至过滤装置的物流，其中所述物流被过滤以提供渗余物和渗透物，所述渗余物富集细菌并返回生物反应器以维持其细菌浓度。基本上不含生物质的渗透物流不再循环至生物反应器。然后所述渗透物可以被传至下游生物反应器，或者可以被传至产物回收区。

排放物流和渗透物流的取出都显著改善了整个工艺控制的程度，特别是在以不同的生产率水平管理生物反应器中的细菌浓度方面。随着乙醇生成速率的增加，渗透物流的流量相对于排放物流的流量可以增加，从而可以取出更多过滤后的反应器液体，并更多地保留细菌。因为在这两个取出的物流中均存在乙醇，所以从生物反应器系统，例如从最终阶段的生物反应器(如来自生物反应器系统的第二生物反应器，所述生物反应器系统包括相对于液体流串联运行的第一和第二生物反应器)中最终取出的排放物流和渗透物流通常均进行进一步处理以用于乙醇纯化。排放物流和渗透物流被运送至储存区，这些槽中的流出物随后被运送至下游回收单元。

可使用所属领域中已知的任何方法或方法的组合从来自储存槽的流出物中分离或纯化目标产物，所述方法包括例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气提、相分离和萃取发酵(包括例如液-液萃取)。在某些实施方式中，通过从生物反应器中不断除去培养液的一部分、从培养液分离微生物细胞(宜通过过滤)和从培养液中回收一种或多种目标产物而从发酵液中回收目标产物。可以例如通过蒸馏回收醇类和/或丙酮。可以例如通过吸附于活性炭来回收酸类。优选使分离的微生物细胞返回到生物反应器。同样优选使除去目标产物之后剩余的无细胞渗透物返回到生物反应器。额外营养物(如维生素B)可以添加到无细胞渗透物中以补给培养基，随后使其返回到生物反应器。

在典型的生产设备中，可以在生物反应器的下游和产物回收装置的上游(即在储存区中)发现能够使乙醇氧化的条件。特别地，已经发现，在排放物流中存在活细菌能够影响乙醇目标产物。当排放物流中存在CO₂以及能够氧化乙醇的活细菌时，乙醇产物可被细菌氧化产生乙酸。随着排放物流和渗透物流不断从生物反应器中除去并在产物回收之前被运送至储存区，这表示目标产物(即乙醇)的损失和/或非目标产物(即乙酸)的产生需要分离和或处理。发明人已经确定了减少乙醇转化成乙酸从而维持乙醇产率的方法。

乙醇氧化反应

典型地，在使用Wood-Ljungdahl途径的C1固定微生物中，经由乙酰-CoA、乙酸和乙醛，使用NAD(P)⁺依赖性乙醛和乙醇脱氢酶和还原态的铁氧还蛋白依赖性醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)(Kopke等人)来进行乙醇的利用和生成。乙醇生产通过过量的还原当量而驱动，过量的还原当量从CO和H₂氧化生成。微生物通过形成还原产物(即乙醇)来平衡过量的还原当量。还原等效物包括还原铁氧还蛋白(Fd_red)、NADPH和NADH。

还原当量主要由一氧化碳脱氢酶(CODH)(Fd_red)或氢化酶((Fd_red)、NADH、NAD(P)H或其混合物)在CO氧化反应中形成。由CO氧化反应形成的还原当量可由乙醇形成消耗。乙醇生产有两种途径。第一途径是通过NADPH或NADH依赖性反应，其中，如由下面的化学计量所示，乙酰-CoA经由乙醛被还原成乙醇：

乙酰-CoA+NAD(P)H+H⁺<->乙醛+NAD(P)⁺+CoA

乙醛+NAD(P)H+H⁺<->乙醇+NAD(P)⁺

第二种途径是经由乙酸。由乙酰-CoA生产乙酸涉及磷酸的转移以及ATP的生成步骤，如以下化学计量所示：

乙酰-coA+P<->乙酰-磷酸+CoA

乙酰-磷酸+ADP<->乙酸+ATP

然后将乙酸还原成乙醛，再还原成乙醇。乙醛的形成由还原态的铁氧还蛋白驱动，并且从乙醛形成乙醇是NAD(P)H依赖性的，如由下面的化学计量所示：

乙酸-+Fdred2-+3H+<->乙醛+Fdox+H2O

乙醛+NAD(P)H+H+<->乙醇+NAD(P)+

在没有过量的还原当量的情况下(即，由于可用的底物较少而缺少CO氧化)，产生乙醇的驱动力较小，并且微生物可以消耗乙醇作为底物，将其氧化形成额外的乙酰-CoA和乙酸，从而补充NAD、NADP和Fd_ox。在发酵后的液体流中，如排放物流中，当发酵底物有限或不再可用时，微生物可以利用乙醇并产生乙酸。

提到的每个反应都在两个方向上起作用。许多因素决定了反应进行的方向，包括但不限于动力学、底物可用性、辅因子水平和pH。

CO₂是以下两者的辅因子：一氧化碳脱氢酶(CODH)，一氧化碳脱氢酶是负责以下反应的酶：CO+H₂O+Fd_ox<->CO₂+Fd_red，和丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)，以及负责以下反应的酶：乙酰-CoA+CO₂+Fd_red<->丙酮酸+CoA+Fd_ox。CO₂水平的增加将使CODH的反应平衡远离CO氧化，PFOR的反应平衡趋向于丙酮酸形成。这两个变化均导致较低水平的还原当量Fd_red，从而提供了有利于乙醇氧化的条件。这可以通过减少CO₂的量或从排放物流中除去CO₂来抵消。

不希望受到理论的束缚，发明人认为乙醇氧化反应在发酵工艺中发生，但是在发酵条件下，产生乙醇的反应发生的速率比乙醇的氧化快得多，并且所述反应对产物滴定度的影响很小。当从生物反应器中除去发酵液，并且微生物不再产生乙醇产物时，乙醇氧化反应就成为问题。

发明人已经开发了方法，以在所述方法的发酵阶段之后大幅度减少或防止排放物流中的这些不期望的反应，从而从排放物流离开发酵工艺的时间到将其引入产物回收工艺的时间，保持了排放物流中所需最终产物的浓度。

在一种实施方式中，所述方法涉及从排放物流中除去溶解的、夹带的或悬浮的CO₂。这是通过向排放物流中鼓泡氮气来实现的，这从溶液中置换出了CO₂。由于CO₂对于乙醇转化为乙酸的反应至关重要，因此从排放物流中除去CO₂防止乙醇经由这种机理发生氧化。

为了使这种方法有效，必须鼓泡惰性气体，如氮气，以使排放物流中提供的大部分CO₂被置换出。优选地，置换出了排放物流中基本上所有的CO₂。理想地，排放物流中的大部分CO₂应当在少于5分钟，或少于10分钟，或少于15分钟，或少于20分钟，或少于30分钟内被置换出。

可以将氮气鼓泡入排放物流中，以在收集罐中或在用于将排放物流从生物反应器进料至收集罐的导管中置换CO₂。在一种实施方式中，将氮气连续地进料到收集罐中的顶部空间中，同时不断地从顶部空间中排出气体。向收集罐的顶部空间提供氮气使得能够从与顶部空间气体接触的液体中置换出CO₂。收集罐可以被氮气覆盖，在此过程中，少量的氮气被进料至反应器，导致一些CO₂置换。可替代地，可以在收集罐上进行氮气吹扫，其中将更多量的氮气进料到收集罐中，导致更大水平的CO₂置换。在替代实施方式中，通过设置在收集罐下部的导管将氮气鼓泡入排放物流。氮气在收集罐底部或向收集罐底部的鼓泡会促使CO₂从排放物流中主动置换出。

在一种实施方式中，将氮气进料到收集罐的顶部空间中，并且排放物流经由一个或多个喷嘴被鼓泡通过收集罐的顶部空间。通过将排放物流鼓泡入富氮的顶部空间，随着排放物流的表面积增加，排放物流中的更大部分CO₂被置换。可以调节喷嘴的尺寸以改变喷雾的液滴尺寸。优选地，将排放物流喷雾到顶部空间所需的能量由生物反应器提供。离开生物反应器的液体通常至少为3巴表压或更高，其足以到达储存容器并克服标准喷雾嘴上的压降。

在一种实施方式中，通过设置在管道中的内嵌式鼓泡器将氮气鼓泡入排放物流中，所述管道用于将排放物流从生物反应器进料至收集罐。优选地，内联导管设置在收集罐的近侧。

当排放物流处于或接近环境压力时，优选将氮气(或其它惰性气体)鼓泡入排放物流。CO₂在较高压力下更易溶，因此当在较高压力下将氮气鼓泡入排放物流时，置换CO₂组分的效率较低。

优选地，提供至排放物流的惰性气体是氮气。可替代地，惰性气体是氢气或甲烷。在一种实施方式中，将排放物流用空气鼓泡。在一种实施方式中，鼓泡空气的排放物流在被传至产品回收模块之前经历一个或多个另外的处理阶段。

在一种实施方式中，提供了加热排放物流的方法。在一种实施方式中，所述方法包括将热量施加到含有活细胞的排放物流上，从而发生以下中的至少一种：(i)使乙醇氧化所需的蛋白质变性，(ii)使细菌细胞裂解，以及(iii)细胞代谢被破坏。

优选将排放物流加热至足以使一种或多种能够将乙醇转化为乙酸的酶变性的温度。在一种实施方式中，一种或多种酶选自由NADH依赖性乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1)，NADPH依赖性乙醇脱氢酶(EC1.1.1.2)，醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR，EC1.2.7.5)、乙酸激酶(EC2.1.2.1)和磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)组成的组。

理想地，排出的细胞在离开生物反应器后的短时间段内被加热至所需温度。例如，排放物流在离开生物反应器30分钟内，或离开生物反应器20分钟内，或离开生物反应器10分钟内，或离开生物反应器5分钟内，或离开生物反应器1分钟内被加热到所需温度。

产物流的所需温度增加到至少50℃，或至少60℃，或至少70℃，或至少75℃，或至少78℃。在一种实施方式中，产物流的温度在确定的温度之上保持至少10秒，或至少20秒，或至少30秒，或至少1分钟，或至少2分钟，或至少3分钟，或至少5分钟，或至少10分钟。

排放物流可以通过本领域已知的常规方式加热，包括但不限于板框式热交换器，以及壳管式热交换器。优选通过加热的水流、低压流(例如1.5巴表压或更小)或可替代的低温温和热源来间接加热排放物流。优选地，所需热量的至少一部分来源于设备的整合部分。例如，热量可以来源于蒸馏模块，或者来源于将含C1的底物提供给生物反应器的工业工艺。

优选地，提供给排放物流的热量不是高压热蒸汽。使用高压或其它激进形式的加热可能会导致微生物变性，从而导致生物质的凝集。生物质的凝集可能会导致导管或收集罐内结垢，并损害系统的运行。产物流需要加热以回收产物(即蒸馏工艺)，可以使用工程解决方案将热处理成本最小化。优选地，将排放物流加热至足以使负责使乙醇氧化为乙酸的酶变性的温度，但低于导致生物质凝集的温度。

在一种实施方式中，提供了用于使排放物流减压的方法。在一种实施方式中，通过使排放物流减压来除去排放物流中溶解的、夹带的或悬浮的CO₂。由于需要CO₂将乙醇转化为乙酸，因此从排放物流中除去CO₂防止乙醇通过这种机理发生氧化。

为了使这种方法有效，必须从在足够压力下运行的生物反应器中取出排放物流，然后对其减压，以闪蒸掉排放物流中提供的大部分CO₂。优选地，排放物流中基本上所有的CO₂均被闪蒸掉了。理想地，排放物流中的大多数CO₂应当在少于30秒，或少于20秒，或少于10秒，或少于5秒，或少于3秒，或少于2秒，或少于1秒内被闪蒸掉。

理想地，在减压前使排放物流经受高于大气压力的压力至少1秒，或至少3秒，或至少5秒，或至少10秒，或至少15秒，或至少20秒，或至少25秒，或至少30秒。优选地，在减压之前，排放物流的压力在高于大气压力的压力下保持1至30秒，或1至15秒，或15至30秒。在一种实施方式中，在减压之前，排放物流经受至少2.0巴表压的压力，并保持在此压力下至少1秒。在一种实施方式中，在减压之前，产物流的压力增加到至少0.25巴表压，并保持在此压力下至少30秒。

在特定的实施方式中，当发酵在高于大气压的压力下发生时，排放物流从加压容器传至在大气压下的容器可以提供足够的压降以对CO₂提供足够的闪蒸。在特定的实施方式中，离开生物反应器的液体处于至少0.25巴表压或更高的压力下并且被传至在大气压力下的容器，这种压降足以从液体中除去至少一部分溶解的CO₂。

在一种实施方式中，包含在排放物流中的微生物是C1固定微生物。在特定的实施方式中，C1固定微生物是具有Wood-Ljungdahl途径的产乙酸菌。在一种实施方式中，C1固定微生物选自由自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)组成的组。

在一种实施方式中，微生物将C1碳源固定到天然产生的产物中。在一种实施方式中，天然产生的产物是乙醇。在替代实施方式中，微生物是(i)包含一种或多种外源酶的重组微生物，其产生一种或多种非天然产生的产物；或(ii)重组微生物，其中一种或多种内源酶被过表达；或(iii)重组微生物，其包含破坏一种或多种酶的表达和/或活性的至少一种基因修饰。例如，本发明的微生物可以产生或可以被工程化以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸(WO 2007/117157)、丁醇(WO 2008/115080和WO 2012/053905)、丁酸(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂类(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸(3-HP)(WO 2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)和1-丙醇(WO2014/0369152)。

代谢工程是昂贵且费时的(Keasling,《科学(Science)》,330:1355-1358,2012)。要求完全平衡进出细胞的通量的细胞膜的局限性使得在不考虑整个代谢网络的情况下很难表达生物合成途径。尽管有许多技术可以使工程师更好地操纵细胞，如代谢通量分析、基因组工程等，但细胞的复杂性仍然是限制(Lee,《自然—化学生物学(Nat Chem Biol)》,8:536-546,2012；Yadav,《代谢工程(Metabol Eng)》,14:233-241,2012)。此外，我们确实需要调节转录、翻译和基因组的工具，因此需要许多设计-构建-测试(DBT)周期，从而增加了优化目标生物合成所需的时间和精力(Boyle,《代谢工程》,14:223-232,2012)。尽管当前的DBT周期极其昂贵，但体外系统显示出加速DBT周期的潜力，因为它们通过直接使用细胞内含物，而绕开了许多体内限制(Sun,《美国化学学会合成生物学(ACS Synth Biol)》,3:387-397,2014；You,《生物化学工程进展-生物技术(Adv Biochem Eng Biotechnol)》,131:89-119,2013；Siegal-Gaskins,《美国化学学会合成生物学》,3:416-425,2014)。这些体外系统可包括，例如，使用粗细胞提取物的无细胞代谢工程(Kay,《代谢工程》,20:84-91,2015)或用于酶体外表达的无细胞蛋白质合成(US 2006/0362708)。在本文中，这些类型的系统称为“无细胞系统”。在某些实施方式中，本发明可以应用于无细胞系统，以防止产物不希望的逆反应成为前体。

当用于指代微生物时，术语“非天然存在的”旨在表示微生物具有在所指代的物种的天然存在的菌株中通常未发现的至少一种基因修饰，包括所指代的物种的野生型菌株。

术语“基因修饰”、“基因变异”或“基因工程”广泛地指操纵微生物的基因组或核酸。同样，术语“基因工程化”是指包含操纵后的基因组或核酸的微生物。基因修饰的方法包括例如异源基因表达、基因或启动子***或缺失、核酸突变、改变的基因表达或失活、酶工程化、定向进化、基于知识的设计、随机诱变方法、基因改组和密码子优化。

“重组”表示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰、工程化或重组的产物。通常，术语“重组”是指含有来源于多个来源的遗传物质或由来源于多个来源的遗传物质编码的核酸、蛋白质或微生物，多个来源如两种或更多种不同微生物的菌株或物种。如本文所用，术语“重组”还可以用于描述包含突变核酸或蛋白质的微生物，包括内源性核酸或蛋白质的突变形式。

“野生型”是指自然界中存在的生物体、菌株、基因或特性的典型形式，区别于突变或变异形式。

“内源性”是指在本发明的微生物来源于的野生型或亲本微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。举例来说，内源性基因是天然存在于本发明的微生物来源于的野生型或亲本微生物中的基因。在一种实施方式中，内源性基因的表达可以通过外源性调节元件控制，如外源性启动子。

“外源性”是指不存在于本发明的微生物来源于的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。在一种实施方式中，外源基因或酶可以来源于异源(即，不同的)菌株或物种，并且引入或表达于本发明的微生物中。在另一实施方式中，外源基因或酶可以人工方式或重组方式构建，并且引入或表达于本发明的微生物中。外源性核酸可适合于整合到本发明的微生物的基因组中或在本发明的微生物中保持染色体外状态，例如在质粒中。

“酶活性”或简称“活性”泛指酶促活性，包括但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的有效性。因此，“增加”酶活性包括增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的有效性。类似地，“降低”酶活性包括降低酶的活性、减少酶的量或降低酶催化反应的有效性。

“微生物”是微观生物，尤其是细菌、古细菌、病毒或真菌。本发明的微生物通常是细菌。如本文所用，“微生物”的表述应理解为涵盖“细菌”。

可以基于功能特性进一步分类本发明的微生物。举例来说，本发明微生物可以是或可以来源于C1固定微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、羧基营养菌和/或甲烷氧化菌。表1提供了代表性的微生物列表，并鉴定了它们的功能特性。

¹木醋杆菌(Acetobacterium woodi)可以从果糖中产生乙醇，但不能从气体中产生乙醇。

²尚未研究大梭菌(Clostridium magnum)是否可以依靠CO生长。

³已报道穆尔氏菌属热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)中的一种菌株HUC22-1从气体中产生乙醇。

⁴尚未研究卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)是否能依靠CO生长。

⁵尚未研究森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)是否能依靠CO生长。

⁶尚未研究球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)是否能依靠CO生长。

“C1”是指单碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。“C1含氧物”是指还包含至少一个氧原子的单碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。“C1碳源”是指充当本发明微生物的部分或唯一碳源的单碳分子。举例来说，C1碳源可包含CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂中的一种或多种。优选地，C1碳源包含CO和CO₂中的一种或两种。“C1固定微生物”是具有从C1碳源产生一种或多种产物的能力的微生物。通常，本发明的微生物是C1固定细菌。在优选实施方式中，本发明的微生物来源于表1中所鉴定的C1固定微生物。

“厌氧菌”是生长不需要氧的微生物。如果氧以高于一定阈值存在，那么厌氧菌可能不良地反应或甚至死亡。通常，本发明的微生物是厌氧菌。在优选实施方式中，本发明微生物来源于表1中所鉴定的厌氧菌。

“产乙酸菌”是产生或能够产生乙酸(或醋酸)作为厌氧呼吸的产物的微生物。通常，产乙酸菌为使用Wood-Ljungdahl途径作为其能量守恒和合成乙酰-CoA与乙酰-CoA衍生产物(如乙酸)的主要机制的专性厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学报(BiochimBiophys Acta)》,1784:1873-1898,2008)。产乙酸菌使用乙酰-CoA途径作为(1)从CO₂还原合成乙酰-CoA的机制，(2)末端电子接收、能量守恒过程，(3)在细胞碳的合成中固定(同化)CO₂的机制(Drake,《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》,于:《原核生物(TheProkaryotes)》,第3版,第354页,纽约州纽约(New York,NY),2006)。所有天然存在的产乙酸菌都是C1固定、厌氧性、自养性和非甲烷氧化性的。通常，本发明的微生物是产乙酸菌。在优选实施方式中，本发明的微生物来源于表1中所鉴定的产乙酸菌。

“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本发明的微生物是产乙醇菌。在优选实施方式中，本发明的微生物来源于表1中所鉴定的产乙醇菌。

“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养菌使用无机碳源，如CO和/或CO₂。通常，本发明的微生物是自养菌。在优选实施方式中，本发明的微生物来源于表1中所鉴定的自养菌。

“羧基营养菌”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常，本发明的微生物是羧基营养菌。在优选实施方式中，本发明的微生物来源于表1中所鉴定的羧基营养菌。

“甲烷氧化菌”是能够利用甲烷作为碳和能量的唯一来源的微生物。在某些实施方式中，本发明的微生物是甲烷氧化菌或来源于甲烷氧化菌。在其它实施方式中，本发明的微生物不是甲烷氧化菌或不来源于甲烷氧化菌。

更广泛地，本发明的微生物可以源自表1中鉴定的任何属或种。

在优选实施方式中，本发明的微生物来源于梭状芽胞杆菌(Clostridia)的簇，其包含物种自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)。这些物种最初由Abrini,《微生物学档案(Arch Microbiol)》,161:345-351,1994(自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum))；Tanner,《国际系统细菌学杂志(Int J System Bacteriol)》,43:232-236,1993(永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii))；以及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei))报道和表征。

这三个物种有很多相似之处。具体地说，这些物种都是梭状芽胞杆菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和羧基营养性成员。这些物种具有相似的基因型和表现型以及能量守恒和发酵代谢模式。此外，这些物种簇集于16S rRNA DNA超过99％相同的梭菌属rRNA同源组I中，具有约22-30mol％的DNA G+C含量，是革兰氏阳性的，具有相似形态和大小(对数生长期细胞介于0.5-0.7×3-5μm之间)，是嗜常温的(在30-37℃下生长最佳)，具有约4-7.5的相似pH范围(最佳pH为约5.5-6)，缺乏细胞色素，并且通过Rnf复合体保存能量。另外，在这些物种中已证明羧酸还原为其对应的醇(Perez,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些物种还均示出依靠含CO气体的强自养性生长，产生乙醇和乙酸(或醋酸)作为主要发酵产物，并且在一定条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。

然而，这三种物种也有许多不同之处。这些物种从不同来源分离：来自兔子肠道的自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、来自养鸡场废物的永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)，以及来自淡水沉积物的拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)。这些物种对各种糖(例如，鼠李糖、***糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)以及其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的利用不同。此外，这些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)的营养缺陷型不同。这些物种在Wood-Ljungdahl途径基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列上存在差异，不过已经发现所有物种中的这些基因和蛋白质的一般结构和数量相同(

《生物技术最新观点(Curr Opin Biotechnol)》,22:320-325,2011)。

因此，总的来说，自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)的多种特性并不对这些物种具有特异性，但是梭状芽胞杆菌属的C1固定、厌氧性、产乙酸性、产乙醇性和羧基营养性成员的这一簇的一般特性却对这些物种具有特异性。然而，由于这些物种实际上是不同的，所以这些物种中的一种的基因修饰或操纵在这些物种的另一种中可能不具有相同的作用。举例来说，可观察到生长、性能或产物产生的不同。

本发明的微生物也可以来源于自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)的分离株或突变体。自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的分离株和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物学档案》,161:345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)。永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)的分离株和突变体包括ATCC 49587(Tanner,《国际系统细菌学杂志》,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo，《使用永达尔梭菌从合成气生产生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridiumljungdahlii)》,北卡罗莱纳州立大学博士学位论文(PhD thesis,North Carolina StateUniversity),2010)。拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)的分离株和突变体包括PI 1(ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

“底物”是指本发明微生物的碳源和/或能量来源。通常，底物是气态的并且包含C1碳源，例如CO、CO₂和/或CH₄。优选地，底物包含CO或CO+CO₂的C1碳源。底物可进一步包含其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。

所述底物通常包含至少一定量的CO，如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％的CO。底物可包含一定范围的CO，如约20-80、30-70或40-60mol％的CO。优选地，底物包含约40-70mol％的CO(例如，钢厂或高炉煤气)、约20-30mol％的CO(例如，碱性氧气炉气)或约15-45mol％的CO(例如，合成气)。在一些实施方式中，底物可包含相对较低量的CO，如约1-10或1-20mol％的CO。本发明的微生物通常将底物中的至少一部分CO转化为产物。在一些实施方式中，底物不包含或基本上不包含(<1mol％)CO。

底物可包含一定量的H₂。举例来说，底物可包含约1、2、5、10、15、20或30mol％的H₂。在一些实施方式中，底物可包含相对较高量的H₂，如约60、70、80或90mol％的H₂。在其它实施方式中，底物不包含或基本上不包含(<1mol％)H₂。

底物可包含一定量的CO₂。举例来说，底物可包含约1-80或1-30mol％的CO₂。在一些实施方式中，底物可包含小于约20、15、10或5mol％的CO₂。在另一实施方式中，底物不包含或基本上不包含(<1mol％)CO₂。

尽管底物通常是气态的，但底物也可以替代形式提供。举例来说，可以使用微泡分散发生器将底物溶解在用含CO气体饱和的液体中。借助于其它实例，底物可以吸附到固体载体上。

底物和/或C1碳源可以是作为工业工艺的副产物或从一些其它来源获得的废气，如来自汽车废气或生物质气化。在某些实施方式中，工业工艺选自由以下组成的组：含铁金属产品制造(如钢厂制造)、非含铁产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施方式中，底物和/或C1碳源可在其被排放到大气中之前使用任何适宜方法从工业工艺中捕获。

底物和/或C1碳源可以是合成气，如通过煤炭或精炼残余物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化或天然气的重整而获得的合成气。在另一实施方式中，合成气可以从城市固体废物或工业固体废物的气化中获得。

底物的成分可能对反应的效率和/或成本有显著影响。举例来说，氧气(O₂)的存在可能降低厌氧发酵工艺的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、净化或过滤底物以除去任何不希望的杂质，如毒素、不需要的组分或灰尘颗粒，和/或增加所需组分的浓度。

在某些实施方式中，发酵在不存在碳水化合物底物如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素的情况下进行。

除一种或多种目标产物外，本发明的微生物还可产生一种或多种副产物。例如，除了目标产物外，本发明还可以生产乙酸、2,3-丁二醇、丁醇、丁酸、乳酸、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、异丙醇、脂类、3-羟基丙酸、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇和/或1-丙醇。在某些实施方式中，微生物生物质本身就可以认为是产物或副产物。

“天然产物”是由未经过基因修饰的微生物产生的产物。举例来说，乙醇、乙酸和2,3-丁二醇是自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)的天然产物。“非天然产物”是由基因修饰后的微生物产生的，而不是由基因修饰后的微生物来源于的未经过基因修饰的微生物产生的产物。

“提高效率(increasing the efficiency)”、“提高的效率(increasedefficiency)”等包括但不限于提高生长速率、产物产生速率或体积、消耗每体积底物的产物体积或产物选择性。可以相对于本发明微生物来源于的亲本微生物的性能来测量效率。

图1描绘了包括第一生物反应器10和第二生物反应器20的代表性生物反应器系统。生物反应器系统接收含C1的底物12。含C1的底物分为第一生物反应器气体入口流14和第二生物反应器气体入口流14'，它们通过它们各自的气体入口16、16'分别进料到第一和第二生物反应器10、20。

通过提供由其可以取出液体的过滤部分和未过滤部分的装置，可以将生物反应器10、20的液相区18、18'中的细菌浓度保持在乙醇生产率的不同水平。液体从第一生物反应器10中取出，经由渗透物流28，其由过滤系统25过滤以除去细菌，以及排放物流26，其未经过滤并包含与在第一生物反应器10的连续液相区18中的发酵液中基本相同的浓度的C1固定细菌(生物质)。过滤的细菌经由导管36返回到第一生物反应器10。因此，从第一生物反应器10中取出的液体产物可以包括渗透物流28和排放物流26。以相同的方式，提供了与连续液相区18'连通的第二过滤系统25'，其允许从生物反应器系统的最终生物反应器中取出排放物流40和渗透物流50，其中过滤的细菌36'返回至第二生物反应器20的连续液相区18'。

液体培养基可通过培养基入口34进料到生物反应器系统，特别是第一生物反应器10中，以提供营养物以维持细菌生长并替换从第一生物反应器10中取出的中间液体产物32中的液体体积损失，中间液体产物的全部或一部分可以传至第二生物反应器20。任选地，液体培养基可以通过培养基入口34'进料到第二生物反应器20。任选地，可以从生物反应器系统中取出一部分排放物流26和/或渗透物流28(例如，用于工艺监测和分析)，而不传至第二生物反应器20。

气体出口流38、38'可以从与生物反应器顶部空间22、22'流体连通的导管中取出。气体出口流38、38'可以从生物反应器系统分开地取出，或合并，然后由气态产物出口24取出。

因此，图1描绘了生物反应器系统，其中可以将气态含C1的底物12平行进料至第一和第二生物反应器10、20，而可以包含C1固定细菌(生物质)的液体产物可以从第一生物反应器10依次进料到第二生物反应器20。在图1的实施方式中，从生物反应器系统100中取出排放物流40和渗透物流50的最终生物反应器即是第二生物反应器20。在具有生物反应器系统的替代实施方式中，所述生物反应器系统具有额外的生物反应器(例如，三个或四个生物反应器)，特别是在第一生物反应器下游和最终生物反应器上游的一个或多个中间生物反应器，可以以类似的方式将气态和液态进料引入到这种中间生物反应器中，并且可以以类似的方式从这种中间生物反应器中取出气态和液态产物。液态产物流，包括排放物流和渗透物流，可以以类似的方式进出连续的生物反应器。

通常，生物反应器系统100的一种或多种代谢产物(例如，乙醇)是从于最终生物反应器中取出的排放物流和渗透物流或其部分中回收的，如在图1的实施方式中，从第二生物反应器20中取出的排放物流40和渗透物流50。任选地，这种代谢产物还可以是从除最终生物反应器之外的一个或多个生物反应器中取出的排放物流和/或渗透物流，或其部分中回收的。

如图2所示，将来自生物反应器的渗透物流50和排放物流40进料至储存区。渗透物流被进料到渗透物收集罐62。渗透物在经由导管64传至渗透物产物回收模块66之前，可能要经受一个或多个处理步骤，如澄清步骤。将排放物流进料到排放物收集罐72，其中排放物流经受一个或多个处理步骤，以防止排放物流中乙醇转化成乙酸。处理步骤可包括加热排放物流，减压排放物流或从排放物流中置换出CO₂。处理后的物流的加热既可以在收集罐中进行，也可以在生物反应器与收集罐之间设置的导管中进行。优选地，用于加热排放物流的能量源自与生物反应器系统相邻的工业工艺。然后将处理后的物流42进料至排放物产物回收模块90，并且从处理后的物流中回收乙醇。任选地，渗透物流50和排放物流40被合并，并且储存区接收进料到单个收集罐的合并的物流。(未示出)。

图3a描绘了根据本发明一方面的排放物收集罐72。排放物流40被进料至排放物收集罐72。在一种实施方式中，惰性气体80如氮气可以连续地鼓泡入排放物收集罐72的顶部空间76中，而顶部空间的一部分则通过排气孔(未示出)连续地排出。

图3b示出了替代系统，其中氮气80通过设置在排放物收集罐78的液体部分78中的入口82进料至排放物流。

图3c示出了实施方式，其中排放物流40通过一个或多个喷嘴84鼓泡入排放物收集罐72的含氮顶部空间76中。

图3d示出了实施方式，其中氮气80在设置于收集罐72上游的内联鼓泡器86中鼓泡入排放物流。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)DSM23693(DSM10061的衍生物)从DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection of Microorganisms and CellCultures),Inhoffenstraβe 7B,38124布伦瑞克(Braunschweig)，德国(Germany))获得。使用严格的厌氧条件和技术在37℃进行生长(Hungate,《微生物学方法(Meth Microbiol)》,3B:117-132,1969；Wolfe,《微生物生理学进展(Adv Microb Physiol)》,6:107-146,1971)。使用不含酵母提取物的化学成分确定的PETC培养基。30psi的含CO的气体混合物(44％CO、32％N₂、22％CO₂、2％H₂)作为碳和能量的唯一来源。

实施例1：置换CO₂以防止乙醇氧化

在1.5L生物反应器中，于37℃进行自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)DSM23693的发酵。为了实现厌氧性，用氮气鼓泡反应器容器。在接种之前，将气体转换为连续供料至反应器的纯气体。(42％CO、1.5％CO₂、11％N₂、42％H₂)，pH用氢氧化铵(5M)调节至5.0。气体流量最初设置为59毫升/分钟/升，在中指数阶段增加到118毫升/分钟/升，同时搅拌从200rpm增加到800rpm。将Na₂S(0.5M)以0.2毫升/小时的剂量注入生物反应器。OD600达到1.1后，将生物反应器以1.95d-1的稀释率和1.0d-1的细菌稀释率切换到连续模式。在连续模式期间，气体和搅拌分别调节至267毫升/分钟/升和950rpm，细菌稀释率调节下降至0.35d-1。将Na₂S增加到0.5毫升/小时。取培养基样品以测量生物质和代谢物，并定期进行进出气体的顶部空间分析。到第16.0天，发酵代谢物和生物质稳定，其中乙醇和乙酸的浓度为26.5g/L和4.75g/L，CO的吸收量为5.9mol/L/d，且H₂的吸收量为3.45mol/L/d。

在第16.95天，一式三份取发酵液样品(25mL)，并放置在模拟的收集罐(厌氧血清瓶)中，交换血清瓶的顶部空间并用CO₂或N₂加压。注意确保在此工艺中不引入O₂。然后经3小时时间段采集代谢物样品，并在HPLC上进行测量。

图4和5示出了在两种条件下乙醇和乙酸的变化。在使用CO₂顶部空间的实施例中(图4)，乙酸从5.5g/L增加到10.67g/L，并且乙醇从26.4g/L降低到23.8g/L。这表明乙醇明显氧化。

图5示出了将相同的细胞放置在N₂顶部空间时，代谢物浓度没有显著变化，也没有乙醇氧化。代谢物浓度与发酵中所测的保持相同。

实施例2：热处理以防止乙醇氧化

从CSTR实验中收集单个样品，所述样品在与实施例1中描述的实验相似的条件下进行操作，并分成子样品。在产物回收之前，将子样品在代表发酵后含有生物质的产物流的条件下储存。在这些条件下，预期乙醇转化为乙酸。

以0-240分钟的不同时间间隔独立地对子样品进行热处理。热处理涉及将样品在80℃下保持5分钟。

热处理后通过HPLC测量乙酸和乙醇的滴定度，并与相应的时间零点热处理的样品进行比较。

图6示出了在不同时间点进行热处理的子样品之间的比较。如果未立即对子样品进行热处理，则曲线上的实线示出乙醇随时间的各自的损失。任何两个数据点之间的差值表示在所述时间段内发生的转换量。时间零点和时间240之间的差值估计了热处理的绝对益处。如图所示，在60分钟到240分钟之间，几乎没有进一步的转化，因此，超过240分钟，几乎不会发生进一步的转化。

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本发明的优选实施方式描述于本文中。在阅读前文描述之后，那些优选实施方式的变化对于本领域普通技术人员可变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这些变化，并且本发明人打算以与本文中具体描述不同的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。并且，除非在本文中另外指出或明显与内容相矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能的变化的任何组合。