阅读说明：本技术 一种利用σ54依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法 (Method for realizing stable production of biofuel by using sigma 54 -dependent promoter ) 是由 霍毅欣 马晓焉 马炼杰 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种利用σ~(54)启动子实现将生物废料稳定转化为生物燃料的方法。本发明所提供的方法是按照包括以下步骤进行：首先确定要生产的生物燃料的合成途径,以及选择要使用的σ~(54)依赖型启动子。通过PCR基因片段,人工组装构建出σ~(54)依赖型启动子调控的特定生物燃料生产途径,与发酵菌株(ΔglnAΔgdhA)组合,构建出能高效、持续、稳定生产的细胞工厂。本发明所提供的方法可以用于不同种类的生物燃料生产。相对于传统细胞工厂,其发酵过程的有效期能延长到稳定期,不需要外源添加各种诱导物,且抗胁迫能力显著增强,所利用的氮源可以从精制氮扩展到蛋白废料,具有相当的实用价值何发展前景。(The method provided by the invention comprises the following steps of firstly determining the synthesis path of the biofuel to be produced, selecting a sigma 54 -dependent promoter to be used, manually assembling and constructing a specific biofuel production path regulated by the sigma 54 -dependent promoter through a PCR gene fragment, and combining the specific biofuel production path with a fermentation strain (delta glnA delta gdhA) to construct a cell factory capable of efficiently, continuously and stably producing.)

一种利用σ54依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法

技术领域

本发明涉及利用σ⁵⁴依赖型启动子实现将生物废料稳定转化为生物燃料的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物燃料作为一种由生物质转化而来，可以取代石油等不可再生资源的新兴燃料，是可再生能源开发利用的重要方向。在原料和产业上都具有相当的多样性，在储藏和运输方面也具有相当的便利性。最突出的优点在于其环保性，生物燃料的全部物质在使用过程中都能直接进入地球的生物质循环，真正实现零排放。

以其中一种重要的有机合成原料，异丁醇为例。一个理想的异丁醇微生物细胞工厂应该具有相当高的原料转化效率，同时做到持续表达相关的功能基因。然而，在实际生产中，产量和产率往往会远低于理论水平，主要原因有以下几点：第一，由于长期以来细胞进化形成的鲁棒性，传统细胞工厂使用的σ⁷⁰依赖型启动子的活性由于σ因子竞争，会在发酵进入稳定期后显著降低，直接影响下游酶基因的表达量，细胞工厂几乎停止运转。第二，工厂在生产目标产物的过程中会产生各种废物，这些废物的累积不仅会打破培养环境各种平衡，还会对细胞本身产生毒害作用，影响产量的提升。

本发明从与氮源供应量呈现负响应关系的σ⁵⁴依赖型启动子出发，该类启动子会在氮源不足(发酵后期)的条件下表现出更强的转录活性，同时还能抵抗发酵条件中的胁迫环境。利用它来解决传统细胞工厂面临的各类问题，实现异丁醇等生物燃料的稳定生产。

最终稿在实际的生产过程中，σ⁵⁴依赖型启动子glnAp2、argTp表现出相对于传统σ⁷⁰依赖型启动子rrnB等明显的优势，同时与目前用于异丁醇生产的活性最强的σ⁷⁰启动子P_LlacO₁产量持平，甚至在胁迫条件下产量相对于P_LlacO₁更高，如附图1所示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现将废料蛋白稳定转化为异丁醇等生物燃料的方法。使用能够响应环境中氮源有效性的σ⁵⁴启动子控制目的产物生产途径的表达。利用该类启动子抗胁迫条件，且表达活性与氮源供应量呈现负响应关系的特性，结合敲除氨同化基因glnA及gdhA的发酵菌株，成功构建出摆脱生产周期的影响，能持续工作到到发酵稳定期的细胞工厂。成功实现异丁醇等生物燃料的稳定生产。

按照本发明提供的技术方案，一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现异丁醇等生物燃料稳定生产的方法，采用以下方法步骤：

1.确定要使用的σ⁵⁴依赖型启动子，确定要使用的生物燃料的生产途径。

2.使用PCR方法得到对应的基因序列，并将启动子与生产途径所在进行连接构建新的重组质粒。

3.将步骤二所得连接产物化转至大肠杆菌中，经过菌落PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到连接成功的重组质粒。

4.制备用于发酵的菌株(ΔglnAΔgdhA)的感受态，将步骤3中得到的质粒使用电转至发酵菌株感受态中，涂布于平板上培养。

5.将步骤4中转化得到的单菌落逐个转接发酵培养基中，试管培养24小时。

6.将步骤5所得种子液进行转接，进一步在发酵培养基中进行发酵培养。

发酵培养基组成为：40g/L酵母提取物，1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,10^–4％维生素B1,氨苄青霉素(100μg ml^–1)和硫酸卡那霉素(50μg ml^–1)。

7.将步骤5所得的种子液进行转接，用经过碱处理，高温处理以及蛋白酶处理之后的废弃蛋白作为氮源进行发酵培养。

附图说明

图1不同启动子在理想发酵条件与胁迫条件(200mM NaCl)下的产量对比图

图2glnAp₂驱动的异丁醇生产系统

图3以glnAp₂为启动子的异丁醇细胞工厂发酵产量对比图

图4argTp驱动的异丁醇生产系统

图5以argTp为启动子的异丁醇细胞工厂发酵产量对比图

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、利用σ⁵⁴依赖型启动子glnAp₂实现生物燃料异丁醇的稳定生产

以glnAp₂为选用σ⁵⁴依赖型启动子来生产异丁醇，在大肠杆菌的基因组中负责驱动谷氨酰胺合成酶基因glnA的转录，能够响应环境中氮源有效性的变化，其转录起始需要一定的能量，能量则由其上游的NRI-P结构域提供。

采用Gibson组装的方法，将原始的异丁醇生产途径(由基因alsS,ilvC,ilvD,avtA,leuDH,kivD,yqhD组成)所使用的σ⁷⁰依赖型启动子全部替换为glnAp₂。

Gibson组装的连接体系为：1.5μL PCR扩增产物、1μL载体片段，7.5μL GibsonMaster Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μL DH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。取200μL菌液涂于含有抗生素的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体中***了启动子glnAp₂，得到两个新的重组质粒，新表达系统如附图2所示。

将质粒电转化进入发酵菌株(ΔglnAΔgdhA)：首先在冰上解冻感受态细胞，添加1ul质粒，随后将DNA/细胞混合物转移至冷却后的电穿孔容器中，准备好LB培养基，对电穿孔容器进行脉冲电击(2.5KV，200欧姆，25uF，BioRad电转化仪，0.2电转化杯)之后迅速加入保温的LB培养基。将混合液吸出，转移到1.5ml的离心管中，37℃，200rpm震荡培养，40分钟后涂布。37℃，静置培养12小时。

第二天从平板上挑取单克隆，转接至含有3mL LB培养基的试管中，37℃、200rpm培养12－24小时后，测定菌体OD₆₀₀，并以1％的接菌量转移至20mL培养基的250mL带螺旋盖锥形瓶中(三个重复样)，转接后保持30℃，转速250rpm发酵10天。为及时萃取异丁醇并且给整个反应一个正向引导，同时减弱异丁醇对菌体的毒害作用，可以进行油醇萃取，加入等体积的油醇到锥形瓶中。每次间隔12h进行取样，每次取1.5ml水相和1.5ml有机相，实验结果见附图3精制氮源发酵。

发酵使用的培养基组成为：40g/L酵母提取物，1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,10^–4％维生素B1,氨苄青霉素(100μg ml^–1)和硫酸卡那霉素(50μg ml^–1)。

收集废物蛋白，并用小型研磨器处理1min或者热的0.5N NaOH处理30min来释放其中的蛋白质，可通过Bradford法蛋白定量测定其中的蛋白质含量。之后可以进一步通过60℃加热或者80-100℃水浴加热10-20min，并在50℃下借助蛋白酶水解剩余蛋白。加入的蛋白酶的含量为生物量干重的1-3％(0.3-0.9mg/ml)。水解完成后用宁氢试剂盒(sigma)测定蛋白酶处理前后游离胺基的浓度。最后过滤处理所有蛋白酶处理后的废物蛋白，通过气相色谱-质谱(GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)和高效液相色谱(HPLC)对底物和产物都进行分析对比。

以水解后的蛋白废物为N源，1％的接菌量进行发酵实验，30℃，转速250rpm发酵10天，实验结果见附图3蛋白废料发酵。

实施例2、利用σ⁵⁴依赖型启动子argTp实现生物燃料异丁醇的稳定生产

以argTp为选用σ⁵⁴依赖型启动子来生产异丁醇。采用Gibson组装的方法，将原始的异丁醇生产途径(由基因alsS,ilvC,ilvD,avtA,leuDH,kivD,yqhD组成)所使用的σ⁷⁰依赖型启动子全部替换为argTp。

Gibson组装的连接体系为：1.5μL PCR扩增产物、1μL载体片段，7.5μL GibsonMaster Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μL DH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。取200μL菌液涂于含有抗生素的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体中***了启动子argTp，得到两个新的重组质粒，新表达系统如附图4所示。

将质粒电转化进入发酵菌株：首先在冰上解冻感受态细胞，添加1ul质粒，随后将DNA/细胞混合物转移至冷却后的电穿孔容器中，准备好LB培养基，对电穿孔容器进行脉冲电击(2.5KV，200欧姆，25uF，BioRad电转化仪，0.2电转化杯)之后迅速加入保温的LB培养基。将混合液吸出，转移到1.5ml的离心管中，37℃，200rpm震荡培养，40分钟后涂布。37℃，静置培养12小时。

第二天从平板上挑取单克隆，转接至含有3mL LB培养基的试管中，37℃、200rpm培养12－24小时后，测定菌体OD₆₀₀，并以1％的接菌量转移至20mL培养基的250mL带螺旋盖锥形瓶中(三个重复样)，转接后保持30℃，转速250rpm发酵10天。为及时萃取异丁醇并且给整个反应一个正向引导，同时减弱异丁醇对菌体的毒害作用，可以进行油醇萃取，加入等体积的油醇到锥形瓶中。每次间隔12h进行取样，每次取1.5ml水相和1.5ml有机相，实验结果见附图5精制氮源发酵。

发酵使用的发酵培养基组成为：40g/L酵母提取物，1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,维生素B1,氨苄青霉素(100μg ml^–1)和硫酸卡那霉素(50μg ml^–1)。

收集废物蛋白，并用小型研磨器处理1min或者热的0.5N NaOH处理30min来释放其中的蛋白质，可通过Bradford法蛋白定量测定其中的蛋白质含量。之后可以进一步通过60℃加热或者80-100℃水浴加热10-20min，并在50℃下借助蛋白酶水解剩余蛋白。加入的蛋白酶的含量为生物量干重的1-3％(0.3-0.9mg/ml)。水解完成后用宁氢试剂盒(sigma)测定蛋白酶处理前后游离胺基的浓度。最后过滤处理所有蛋白酶处理后的废物蛋白，通过气相色谱-质谱(GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)和高效液相色谱(HPLC)对底物和产物都进行分析对比。

以水解后的蛋白废物为N源，1％的接菌量进行发酵实验，30℃，转速250rpm发酵10天，实验结果见附图5蛋白废料发酵。