一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法
阅读说明：本技术 一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法 (Method for continuously preparing methanol by utilizing microorganisms with multi-substrate metabolic characteristics ) 是由 孙梦婷 王飞 宋副彭 于 2020-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于甲醇制备技术领域,涉及一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法,其使用兼养型甲烷氧化菌制备甲醇,制备时,向兼养型甲烷氧化菌提供两种底物：甲烷无菌混合气和多碳化合物,甲烷无菌混合气中的甲烷进入微生物细胞内,被甲烷单加氧酶转化为甲醇,多碳化合物进入微生物细胞内,被多碳代谢途径同化以维持兼养型甲烷氧化菌细胞正常生长代谢和生物质合成,对菌液OD值和甲醇产量进行测试的结果显示：甲烷无菌混合气和乙酸作双底物时,细菌生长速度显著提高,甲醇产量显著提高,原因是在乙酸存在的条件下,细菌既能够在MDH抑制剂作用下氧化甲烷生产甲醇,又能够利用乙酸维持细菌细胞的正常生长代谢,使得细菌能够连续生产甲醇。(The invention belongs to the technical field of methanol preparation, and relates to a method for continuously preparing methanol by utilizing multi-substrate metabolic characteristic microorganisms, wherein the methanol is prepared by using mixotrophic methane-oxidizing bacteria, and two substrates are provided for the mixotrophic methane-oxidizing bacteria during preparation: the methane in the methane sterile mixed gas enters microbial cells and is converted into methanol by methane monooxygenase, the polycarbon compound enters the microbial cells and is assimilated by a polycarbon metabolic pathway to maintain the normal growth metabolism and biomass synthesis of the mixotrophic methane oxidizing bacteria cells, and the test results of the OD value of the bacterial liquid and the yield of the methanol show that: when the methane sterile mixed gas and the acetic acid are used as double substrates, the growth speed of the bacteria is obviously improved, and the yield of the methanol is obviously improved, because the bacteria can oxidize the methane to produce the methanol under the action of the MDH inhibitor and can maintain the normal growth and metabolism of bacterial cells by utilizing the acetic acid in the presence of the acetic acid, so that the bacteria can continuously produce the methanol.)
技术领域：
本发明属于甲醇制备技术领域，具体涉及一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法，多底物代谢特性微生物在利用多碳化合物进行生长代谢的同时，对甲烷进行高效催化实现甲醇的连续制备。
背景技术：
甲醇(Methanol)：结构最为简单的饱和一元醇，又称羟基甲烷，是一种有机化合物，属于重要的化工原料和优质燃料，应用广泛，用于制造氯甲烷、甲胺和硫酸二甲酯等多种有机产品，生产甲醛、醋酸，制造甲酸甲酯、甲胺和生长促进剂，合成碳酸二甲酯、乙二醇和甲醇蛋白，用作清洗去油剂、分析试剂，溶解无机盐，掺入汽油作替代燃料，生产二甲醚等。工业上，通常采用一氧化碳加压催化加氢制备甲醇，但是，其反应条件苛刻、工序繁复、成本较高。除此之外，利用甲烷氧化菌制备甲醇也是行之有效的办法，其在实验室条件下可以得到较为理想的甲醇产量。甲烷氧化菌是一类利用甲烷作碳源和能源进行生长的微生物，当甲烷进入细菌细胞内，甲烷单加氧酶利用分子氧催化甲烷转化为甲醇，甲醇进一步在甲醇脱氢酶(MDH)的作用下转化为甲醛，甲醛再进入后续代谢途径被转化为生物质或二氧化碳。在此过程中，甲醇是甲烷氧化菌生长代谢的中间产物，通过添加MDH抑制剂(MgCl2、NaCl、EDTA、磷酸等)可以阻断MDH对甲醇的进一步氧化，使甲醇得到积累。与传统的化学物质制备方法相比，微生物制备化学物质具备反应条件温和、简单易行、成本低、环境友好等优势，应用前景良好。例如：中国专利201910333029.4公开的一种生产2,5-呋喃二甲醇的方法，包括：利用阴沟肠杆菌对5-羟甲基糠醛进行生物催化处理，以便获得2,5-呋喃二甲醇，利用所述阴沟肠杆菌对含有5-羟甲基糠醛的培养基进行发酵培养，所述培养基中5-羟甲基糠醛的含量为5～10g/L，所述生物催化处理包括：将所述阴沟肠杆菌接种于培养基中，进行预培养，以便获得预培养液；以及向所述预培养液中加入5-羟甲基糠醛，继续进行培养，以便获得2,5-呋喃二甲醇，所述培养基中含有10～30g/L的葡萄糖，所述阴沟肠杆菌预先经过活化处理，以便获得种子液，将所述种子液以3～6体积％接种于所述培养基中；任选地，所述预培养的时间为4～8小时；任选地，所述预培养和培养分别独立地在30～40℃的温度及100～200rpm的转速下进行；任选地，所述培养基包括：1～5g/L的(NH4)2SO4，0.5～1g/L的K2HPO4，0.1～0.5g/L的KH2PO4，0.5～2g/L的酵母浸粉，0.1～0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.5～1.5mL/L的微量元素，1～5mL/L的FeSO4溶液，pH6.5，进行所述培养过程中，补加5-羟甲基糠醛，进行所述培养过程中，流加5-羟甲基糠醛至培养液中5-羟甲基糠醛终浓度维持在0～3g/L；或者进行所述培养过程中，当培养液中5-羟甲基糠醛的浓度为0～3g/L时，补加终浓度为5～6g/L的5-羟甲基糠醛溶液；中国专利201110419992.8公开的一种利用微生物催化制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，步骤如下：(1)湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：葡萄糖5－50，酵母膏3－30，磷酸二氢钾1－10，七水合硫酸镁0.2－2，pH4－9，发酵培养1－5天，发酵液过滤获得湿菌体；(2)配置反应体系：以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0.5－20g/L，葡萄糖浓度10－100g/L；(3)酶转化反应：在反应体系中加入CCTCC NO：M2011385湿菌体50-250g/L，于25-45℃进行酶反应，反应时间为3-72h；(4)转化液后处理：用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂，采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇；中国专利200710046918.X公开的一种浊点系统中微生物转化合成L－苯基乙酰基甲醇的方法，包括以下步骤：第一步，在培养基中利用微生物发酵获得具有生物活性的微生物细胞作为微生物转化的生物催化剂；第二步，利用第一步得到的微生物细胞构建浊点系统，并设置浊点系统中微生物转化的操作参数，包括乙醛、底物苯甲醛、微生物细胞和葡萄糖的量以及pH值，然后在设置的操作条件下实现浊点系统中的微生物转化，得到L－苯基乙酰基甲醇；所述浊点系统，是非离子表面活性剂TritonX－114和TritonX－45按照体积比1：0.1－0.4混合，然后与水溶液混合成浊点系统，其中混合表面活性剂所占的体积分率为10-14％；或者是表面活性剂TritonX－100与聚乙二醇混合后与100ml水溶液形成浊点系统，其中表面活性剂与聚乙二醇所占的体积分率为10-20％；所述水溶液，其100ml中含有：蛋白胨2g、酵母粉2g、乙醛0.4－1ml、微生物细胞2-11g、苯甲醛0.3-1.2ml、葡萄糖1.2-6g，pH控制在4-6之间。在现有技术中，微生物制备甲醇的技术仅在实验室条件下可以开展批次试验，但是，在实际生产中，并不能实现大规模连续化制备，原因在于：甲醇生产和微生物细胞同化共用了一条途径，MDH抑制剂在抑制MDH活性时，在短时间内能够使中间产物甲醇得到积累，但是，同时也极大地干扰了微生物对甲醇的进一步同化，使其无法完成后续代谢途径，影响微生物的生长代谢，以至于无法长期、稳定和持续生产甲醇，大大限制了微生物制备甲醇技术的大规模工业化应用。
近年来，兼养型甲烷氧化菌被发现和熟知，颠覆了甲烷氧化菌仅能利用甲烷作唯一碳源的观念。与专养型甲烷氧化菌相比，兼养型甲烷氧化菌具有更为广泛的底物范围，除能利用甲烷外，还能够利用多碳化合物(乙酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和乙醇等)作碳源和能源。由于兼养型甲烷氧化菌具备利用多种底物的能力，虽然MDH抑制剂会抑制甲烷氧化通路，但是，多碳化合物利用通路不会受影响，使得微生物氧化甲烷制备甲醇的同时，还能够利用多碳化合物维持正常生长代谢，有望兼顾甲醇制备和细胞生长。目前，利用兼养型甲烷氧化菌制备甲醇的研究还未见报道，深入挖掘兼养型甲烷氧化菌的多底物利用特性在制备甲醇过程中的潜在应用价值，以实现利用微生物稳定、连续制备甲醇，有利推动微生物制备甲醇技术的大规模工业化应用，具有很高的经济效益和环保意义。
发明内容
：本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法，利用微生物一边通过氧化甲烷制备甲醇，一边通过多碳化合物维持细胞生长，实现稳定、连续制备甲醇的目的。
为了实现上述目的，本发明涉及的利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法的具体工艺过程包括以下步骤：
一、为兼养型甲烷氧化菌提供两种底物：甲烷无菌混合气和多碳化合物，并加入MDH抑制剂，采用NMS(硝酸矿物盐nitrate mineralsalt)培养液进行培养，得到菌液；
二、甲烷无菌混合气中的甲烷进入兼养型甲烷氧化菌的细胞后，被甲烷单加氧酶转化为甲醇，甲醇的MDH活性受到抑制，不能被进一步氧化，从而得到积累；同时，多碳化合物在兼养型甲烷氧化菌的细胞内进入多碳代谢途径被氧化利用，以维持兼养型甲烷氧化菌细胞的正常生长代谢和生物质合成；
三、在兼养型甲烷氧化菌培养的初始阶段，每日检测菌液中甲醇的质量百分比浓度，当甲醇的质量百分比浓度值连续三天上升，认定兼养型甲烷氧化菌细胞开始积累甲醇，之后，每日进行进出料操作：取出菌液总体积的15～20％后，加入相同体积的NMS培养液，当菌液中甲醇的质量百分比浓度值不再上升，且进、出气口处的甲烷的浓度值不变时，认定发酵周期结束；
四、分离纯化甲醇。
本发明涉及的兼养型甲烷氧化菌具备多底物代谢特性，能够利用甲烷制备甲醇的同时，利用多碳化合物维持细胞生长。
本发明涉及的甲烷无菌混合气为甲烷与空气按照1:4的体积比混合而成的无菌混合气。
为本发明涉及的多碳化合物的摩尔浓度为5-50mmol L-1，能够为兼养型甲烷氧化菌提供碳源和能源，维持细胞生长代谢，包括：乙酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和乙醇。
本发明涉及的MDH抑制剂的摩尔浓度为10-100mmol L-1，包括MgCl2、NaCl、EDTA和磷酸，能够抑制兼养型甲烷氧化菌细胞内的甲醇脱氢酶活性，使得甲醇难以进一步被细胞同化，从而使甲醇得到积累。
本发明涉及的NMS培养液为蒸馏水、MgSO4x7H2O、CaCl2x6H2O、Fe(III)NH4-EDTA、NaNO3、微量元素溶液、磷酸缓冲液、KH2PO4和Na2HPO4x12H2O组成的混合溶液。
本发明与现有技术相比，使用兼养型甲烷氧化菌制备甲醇，制备时，向兼养型甲烷氧化菌提供两种底物：甲烷无菌混合气和多碳化合物，甲烷无菌混合气中的甲烷进入微生物细胞内，被甲烷单加氧酶转化为甲醇；多碳化合物进入微生物细胞内，被多碳代谢途径同化以维持兼养型甲烷氧化菌细胞正常生长代谢和生物质合成，解决了专养型甲烷氧化菌制备甲醇时存在的细胞生长受抑制、无法连续制备的难题，对微生物制备甲醇技术的大规模工业化应用具有很高的经济效益和环保意义。
附图说明：
图1为本发明涉及的菌液OD值随时间变化的曲线示意图。
图2为本发明涉及的菌液甲醇浓度随时间变化的曲线示意图。
具体实施方式
：
下面通过实施实例并结合附图对本发明做进一步描述。
实施例1：
本实施例涉及的利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法的具体工艺过程为：
一、为兼养型甲烷氧化菌提供两种底物：甲烷无菌混合气和多碳化合物，并加入MDH抑制剂，采用NMS培养液进行培养，得到菌液；
1)选用购买自德国DSMZ网站的Methylocella silvestris BL2作为兼养型甲烷氧化菌；
2)配置NMS培养液：在1000mL蒸馏水中依次溶解0.2g MgSO4x7H2O、0.006gCaCl2x6H2O、4mg Fe(III)NH4-EDTA、0.2g NaNO3、0.5mL微量元素溶液、5mL磷酸缓冲液、0.272g KH2PO4、0.717g Na2HPO4x12H2O，完成NMS培养液的配置；
其中，微量元素溶液为在1000mL蒸馏水中依次溶解10mg ZnSO4x7H2O、3mgMnCl2x4H2O、30mg H3BO3、1mg CuCl2x6H2O、20mg CaCl2x2H2O、3mg Na2MoO4x2H2O配置而成；磷酸缓冲液为在1000mL蒸馏水中依次溶解28.71g NaH2PO4x2H2O、5.73g Na2HPO4x12H2O配置而成的pH值为5.8的溶液；
3)预培养：在250mL发酵瓶中装入50mL无菌的NMS培养液，注入无菌混合气，将5mLMethylocella silvestris BL2菌液(干细胞重量为2-3g L-1)接种至培养瓶中，放入摇床，在140rpm、25℃下培养一周，得到预培养的菌液；
4)接种：将50mL步骤3)预培养的菌液接种至500mL含有MDH抑制剂(摩尔浓度为20mmol L-1的MgCl2)和多碳化合物(摩尔浓度为10mmol L-1的乙酸)的NMS培养液中，持续通入无菌混合气，在25℃条件下培养；
二、甲烷无菌混合气中的甲烷进入Methylocella silvestris BL2细胞后，被甲烷单加氧酶转化为甲醇，甲醇的MDH活性受到抑制，不能被进一步氧化，从而得到积累；同时，多碳化合物在Methylocella silvestris BL2细胞内进入多碳代谢途径被氧化利用，以维持Methylocella silvestris BL2细胞正常生长代谢和生物质合成；
三、在Methylocella silvestris BL2培养的初始阶段，每日检测菌液中甲醇的质量百分比浓度，当甲醇的质量百分比浓度值连续三天上升，认定兼养型甲烷氧化菌细胞开始积累甲醇，之后，每日进行进出料操作：取出菌液总体积的15～20％后，加入相同体积的培养液，当菌液中甲醇的质量百分比浓度值不再上升，且进出气口处的甲烷的体积百分比浓度值不变时，认定发酵周期结束；
四、分离纯化甲醇。
实施例2：
本实施例涉及利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇时菌液OD值和甲醇产量进行测试：
使用250mL发酵瓶将5mL实施例1步骤3)中预培养的菌液(干细胞重量为2-3g L-1)接种至45mL含有MDH抑制剂(摩尔浓度为20mmol L-1的MgCl2)的NMS培养液中，一组在上空只添加200mL甲烷无菌混合气作为底物，另一组在上空添加200mL甲烷无菌混合气，在NMS培养液中添加摩尔浓度为10mmol L-1的乙酸作为双底物，密封发酵瓶，放入摇床，在140rpm和25℃的条件下培养，每组设置三个平行；
采用紫外-可见光分光光度计，在600nm下对菌液OD(光密度optical density)值进行监测，得到如图1所示的菌液OD值随时间变化的曲线图，由图可知，甲烷无菌混合气作单一底物时，细菌生长速率慢，菌液OD值变化曲线很快曲平，原因是MDH抑制剂对MDH酶活的抑制作用，阻断了细菌对甲烷的代谢通路，使细菌生长受到了不利影响；甲烷无菌混合气和乙酸作双底物时，细菌生长速度显著提高，原因是当有乙酸存在时，MDH抑制剂不会阻断细菌对乙酸的代谢通路，使得细菌细胞的正常生长代谢得以维持；
每日取出1mL菌液，使用配备氢火焰检测器的气相色谱(Agilent 6890N)检测菌液中的甲醇的质量百分比浓度，得到如图2所示的菌液甲醇浓度随时间变化的曲线图，由图可知，甲烷无菌混合气作单一底物时，甲醇产量极低，原因是MDH抑制剂严重抑制了细菌的正常生长代谢，使得细菌不能持续生产甲醇；甲烷无菌混合气和乙酸作双底物时，甲醇产量显著提高，原因是在乙酸存在的条件下，细菌既能够在MDH抑制剂作用下氧化甲烷生产甲醇，又能够利用乙酸维持细菌细胞的正常生长代谢，使得细菌能够连续生产甲醇。
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