一种双酶偶联合成(r)-香茅醇的方法
阅读说明：本技术 一种双酶偶联合成(r)-香茅醇的方法 (Method for synthesizing (R) -citronellol by double-enzyme coupling ) 是由 应向贤 王崎舟 贾云鹏 汪钊 于 2020-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双酶偶联合成(R)-香茅醇的方法,所述方法以含醇脱氢酶YsADH基因工程菌和含老黄酶OYE2y-HG基因工程菌各自经发酵培养获得的湿菌体混合后作为催化剂,以香叶醇为底物,以NADP～+为辅酶,以pH 6-9缓冲液为反应介质构成反应体系,在25-55℃、0-600rpm条件下反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得(R)-香茅醇。40mM的香叶醇经6h反应后产物(R)-香茅醇的得率高达95％,产物e.e.值>99％。所建立的(R)-香茅醇合成方法绿色温和,原子经济性高,化学选择性和光学选择性优越。(The invention discloses a method for synthesizing (R) -citronellol by coupling double enzymes, which takes wet thalli obtained by fermenting and culturing respectively an alcohol dehydrogenase YsADH gene engineering bacterium and an old yellow enzyme OYE2y-HG gene engineering bacterium as a catalyst, geraniol as a substrate and NADP as a substrate + Using buffer solution with pH 6-9 as reaction medium to form reaction system, reacting at 25-55 deg.C and 0-600rpm, separating and purifying reaction solution to obtain (R) -citronellol. The yield of the product (R) -citronellol after 40mM of geraniol reacts for 6h reaches 95 percent, and the e.e. value of the product>99 percent. Is builtThe synthesis method of the (R) -citronellol is green and mild, has high atom economy, and has excellent chemoselectivity and optical selectivity.)
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种醇脱氢酶与老黄酶双酶偶联的辅酶自循环体系及其在合成(R)-香茅醇中的应用。
(二)背景技术
香茅醇(Citronellol)为无色液体，化学名称：3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇，相对分子质量为156.26，相对密度0.86g/cm3，溶于乙醇，微溶于水。香茅醇是一种重要的香料原料，具有类似于玫瑰花的气味，常用于玫瑰香、柑桔香的香精，也可用作食用香料，用于饮料、烘烤食品、香糖、果冻及布丁等的制作。此外，(R)-香茅醇是合成顺式玫瑰醚的重要前体。天然玫瑰醚以顺式玫瑰醚为主，相比于反式玫瑰醚，顺式玫瑰醚香气细腻，具有青草清香和玫瑰花香。香茅醇和(R)-香茅醇需求量越来越大，开发更具竞争力的合成新工艺具有重大的经济价值。
目前得到香茅醇的方法有以下几种：①从天然植物精油中提取，这类方法原料来源有限，对精馏设备要求较高；②化学法还原香叶醇、香茅醛、柠檬醛等合成香茅醇，这类方法在化学选择性和对映体选择性上仍是挑战；③从二氢月桂烯化学法合成香茅醇，将二氢月桂烯末端双键的碳原子羟基化得到香茅醇，这类方法反应条件较为苛刻。与化学法相比，生物法还原香茅醛、柠檬醛等底物生成(R)-香茅醇，具有优异的化学选择性和对映体选择性，并且条件温和、绿色环保、反应高效。生物法还原香茅醛和柠檬醛需要配置辅酶循环体系，为了驱动辅酶循环，往往需要添加过量的辅底物，因而降低了原子经济性。
为了提高生物合成(R)-香茅醇的原子经济性，我们设计了一种新型的辅酶自循环体系：通过醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联，醇脱氢酶利用NADP+催化香叶醇脱氢生成香叶醛和NADPH，而老黄酶利用NADPH还原香叶醛生成(R)-香茅醛，从而实现辅酶自给自足。在辅酶自循环体系中，不需要额外添加辅底物。所建立的辅酶自循环体系应用于(R)-香茅醇的酶法合成，产物e.e.值>99％，具有严格的化学选择性以及高对映体选择性。目前，尚未见醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联构建辅酶自循环的报道，也未见利用该辅酶自循环体系催化香叶醇合成(R)-香茅醇的报道。
(三)
发明内容
本发明目的是提供一种双酶偶联合成(R)-香茅醇的方法，醇脱氢酶YsADH利用NADP+催化香叶醇脱氢生成香叶醛和NADPH，而老黄酶OYE2y-HG利用NADPH还原香叶醛生成(R)-香茅醛，该过程辅酶自给自足，(R)-香茅醛在醇脱氢酶YsADH催化下进一步还原生成(R)-香茅醇。该方法原子经济性高，化学选择性和对映体选择性优越。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种双酶偶联合成(R)-香茅醇的方法，所述方法为：以含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌和含老黄酶OYE2y-HG基因的工程菌各自经发酵培养获得的湿菌体混合后作为催化剂，以香叶醇为底物，以NADP+为辅酶，以pH 6-9缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、0-600rpm条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-香茅醇。
进一步，所述含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌是将醇脱氢酶YsADH基因导入大肠杆菌构建获得的；具体为：将SEQ ID NO.2所示醇脱氢酶YsADH编码基因插入pET-28b载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET-28b-YsADH；将重组载体pET-28b-YsADH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH。所述醇脱氢酶YsADH基因来源于约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No：M2013099，保藏日期：2013年3月22日，已在专利申请CN201310188883.9中公开。
进一步，所述含老黄酶OYE2y-HG基因的工程菌是将老黄酶OYE2y-HG基因导入大肠杆菌构建获得的；具体为：将SEQ ID NO.4所示老黄酶OYE2y-HG编码基因插入pEASY-Blunt载体的BamH I和Not I限制性酶切位点，得到重组载体pEASY-Blunt-OYE2y-HG；将重组载体pEASY-Blunt-OYE2y-HG导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG。所述老黄酶OYE2y-HG来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae CICC1060)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌的湿菌体与含老黄酶OYE2y-HG基因的工程菌的湿菌体以质量比0.25-6:1(优选4:1)混合。所述催化剂加入量以湿菌体总量计为200g/L。
进一步，所述底物以1M香叶醇乙醇溶液形式加入，底物香叶醇加入终浓度为10-100mM(优选40mM)，所述辅酶加入终浓度为0.4mM。底物香叶醇用乙醇为溶剂预先配成1M香叶醇溶液，再根据反应体系中底物终浓度酌量添加。
进一步，所述反应时间为1-10h，优选反应条件为40℃、400rpm下反应6h。
进一步，所述缓冲液为pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述含醇脱氢酶YsADH基因工程菌的湿菌体按如下方法制备：将含醇脱氢酶YsADH基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH)接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在21℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
进一步，所述含老黄酶OYE2y-HG基因工程菌的湿菌体按如下方法制备：将含老黄酶OYE2y-HG基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG)接种于含有终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，以体积浓度2％的接种量转接于终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0、50mMTris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相，经减压蒸馏去除乙酸乙酯，最终获得(R)-香茅醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联的辅酶自循环体系，在该辅酶自循环体系中，醇脱氢酶YsADH利用NADP+催化香叶醇脱氢生成香叶醛和NADPH，而老黄酶OYE2y-HG利用NADPH还原香叶醛生成(R)-香茅醛，给过程辅酶自给自足(图1)。该辅酶自循环体系应用于合成(R)-香茅醇时，40mM的香叶醇经6h反应后产物(R)-香茅醇的得率高达95％，产物e.e.值>99％。所建立的(R)-香茅醇合成方法绿色温和，原子经济性高，化学选择性和对映体选择性优越。
(四)附图说明
图1为醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联合成(R)-香茅醇的示意图。
图2为SDS-PAGE胶图；从左到右，泳道M，Blue plus II protein marker；泳道1，未经诱导基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH；泳道2，诱导后的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b-YsADH，加粗条带对应为YsADH，其分子量大小为37kDa；泳道3，未经诱导基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG；泳道4，诱导后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG，加粗条带对应为OYE2y-HG，分子量大小为45kDa。
图3为BCA法测蛋白质浓度的标准曲线。
图4为气相色谱图；a，底物香叶醇、可能的中间产物(橙花醛、香叶醛、(S)-香茅醛和(R)-香茅醛)和产物(R)-香茅醇标样；b，醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联合成(R)-香茅醇的空白对照(不加催化剂)；c，醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联催化20mM香叶醇合成(R)-香茅醇的反应液。
图5为双酶偶联合成(R)-香茅醇的最适催化温度。
图6为双酶偶联合成(R)-香茅醇的醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG最适质量比。
图7为双酶偶联合成(R)-香茅醇的最适搅拌速度。
图8为双酶偶联合成(R)-香茅醇的最适催化pH。
图9为双酶偶联合成(R)-香茅醇的最适底物浓度的探索。
图10为醇脱氢酶YsADH和老黄酶OYE2y-HG双酶偶联酶法合成(R)-香茅醇的时间进程。
图11为底物香叶醇的气相-质谱联用(GC-MS)谱图。
图12为产物香茅醇的气相-质谱联用(GC-MS)谱图。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB液体培养基组成(1L)：胰化蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g。用1M的NaOH调节pH值到7.0～7.5，定容至1L。在121℃高压灭菌20min，4℃储存。
实施例1：表达醇脱氢酶YsADH、老黄酶OYE2y-HG的湿菌体、粗酶液制备
1、醇脱氢酶YsADH基因工程菌的构建
人工合成已公开的来源于约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)的醇脱氢酶YsADH编码基因，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH的构建：将SEQ ID NO.2所示醇脱氢酶YsADH编码基因插入pET-28b载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET-28b-YsADH；将重组载体pET-28b-YsADH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH。
2、老黄酶OYE2y-HG基因工程菌的构建
人工合成已公开的来源(S.cerevisiae CICC1060；该菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015)的老黄酶OYE2y-HG的编码基因，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG的构建：将SEQ ID NO.4所示老黄酶OYE2y-HG编码基因插入pEASY-Blunt载体的BamH I和Not I限制性酶切位点，得到重组载体pEASY-Blunt-OYE2y-HG；将重组载体pEASY-Blunt-OYE2y-HG导入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG。
3、表达醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体制备
湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET-28b-YsADH按如下方法制备：将基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b-YsADH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在21℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。同样条件下，以不添加IPTG的培养液为未诱导对照培养液。再将诱导培养液于4℃、8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-80℃条件下保存备用。
湿菌体E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG按如下方法制备：将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-Blunt-OYE2y-HG接种于含有终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，以体积浓度2％的接种量转接于终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。同样条件下，以不添加IPTG的培养液为未诱导对照培养液。再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-80℃条件下保存备用。
SDS-PAGE检测样品的制备：取未诱导对照培养液和诱导培养液各1mL，在12000rpm离心1min，弃去上清，留取菌体。菌体随后各加入100μL超纯水，将菌重悬成菌悬液。之后，各取20μL菌悬液，加入4μL 6x Protein Loading Buffer混匀后，煮沸10min。煮沸结束后，12000rpm离心1min，各取15μL上清液用于SDS-PAGE检测，蛋白质Marker为BluePlusProtein Marker(14-120kDa)。如图2所示，SDS-PAGE检测表明，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG均在大肠杆菌中成功表达。
4、醇脱氢酶YsADH、老黄酶OYE2y-HG的粗酶液制备
将每1g步骤3离心收集的湿菌体中加入20mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，用玻璃棒搅拌成菌悬液，在冰浴(0℃)条件下超声破碎10min，超声工作1s，间歇2s，超声功率250W。经超声破碎后的菌悬液在8000rpm、4℃下离心10min，所得到的上清液即为粗酶液，放在4℃保存备用。
5、醇脱氢酶YsADH、老黄酶OYE2y-HG的体积酶活力测定
醇脱氢酶YsADH的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定NADPH在340nm处吸光值的变化来计算酶活。酶活检测体系为：20mM香叶醇，0.4mM NADP+，50μL粗酶液，加50mM Tris-HCl(pH 8.0)补足1mL。酶活力单位(U)定义：在45℃下，每分钟还原1μmol的NADP+所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。醇脱氢酶(ADH)的体积酶活力计算如公式1。
老黄酶OYE2y-HG的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定NADPH在340nm处吸光值的变化来计算酶活。酶活检测体系为：20mM柠檬醛，0.4mM NADPH，50μL粗酶液，加入KH2PO4缓冲液(pH 7.0)补足1mL。酶活力单位(U)定义：在30℃下，每分钟消耗1μmolNADPH所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。老黄酶体积酶活力计算如公式1。
公式1：
D：稀释倍数，为1；A1：样品吸光度；A2：空白对照吸光度；Vt：反应总体系，为1mL。
e：摩尔吸光系数，为常数6220；Vs：酶液体积，为0.05mL；d：比色皿直径，为1cm。
经酶活力测定，醇脱氢酶YsADH粗酶液体积比酶活为2.9164U/mL；老黄酶OYE2y-HG体积比酶活为1.084U/mL。
6、醇脱氢酶YsADH、老黄酶OYE2y-HG的蛋白浓度测定
根据BCA法蛋白质浓度测定试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示，测得的线性关系公式为y＝0.4478x+0.20925，其中y为562nm处的吸光度值，x为BSA溶液蛋白浓度(mg/mL)，标准偏差为R2＝0.99056。
在利用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测量醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG时，每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。经测定，醇脱氢酶YsADH粗酶液的蛋白质浓度为7.57mg/mL；老黄酶OYE2y-HG粗酶液的蛋白质浓度为8.96mg/mL。
7、比酶活
将体积酶活与蛋白质浓度的比值，即可得出相应的比酶活。经计算醇脱氢酶YsADH粗酶液的比酶活为0.39U/mg，老黄酶OYE2y-HG粗酶液的比酶活为0.12U/mg。
实施例2：醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG双酶偶联的初始反应体系构建
实施例1制备的醇脱氢酶YsADH湿菌体与老黄酶OYE2y-HG湿菌体按一定比例于缓冲液(50mM Tris-HCl)中混合为催化剂，以香叶醇为底物，加入辅酶NADP+，构成5mL的反应总体系。底物香叶醇用乙醇为溶剂预先配成1M溶液，再根据反应体系中底物终浓度酌量添加。初始未进行条件优化的反应体系如下：底物香叶醇终浓度20mM、辅酶NADP+终浓度0.4mM，湿菌体终浓度200g/L(其中醇脱氢酶YsADH湿菌体与老黄酶OYE2y-HG湿菌体按质量比1:1的比例混合)，加入pH 8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，在pH 8.0、200rpm和30℃下反应6h。同样条件下，以不加催化剂为空白对照。
反应结束后取300μL反应液于12000rpm离心3min，取200μL上清加入800μL乙酸乙酯萃取30min。萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相600μL加入0.8g无水硫酸钠，然后在12000rpm下再离心1min，取100μL上清液，补加乙酸乙酯至终体积0.5mL，利用气相色谱法检测样品中的香叶醇和香茅醇的含量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。气相色谱条件如下：气相色谱仪，Agilent 6890N；手性色谱柱，BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器，FID，250℃；载气，N2；载气流量，2.27mL/min；分流比：1:19；进样量：1.0μL；进样口温度：250℃。升温程序：90℃保持25min，以20℃/min升温至160℃，保持2min，随后以20℃/min升温至180℃，保持3min，共34.50min。如图4a所示，底物、中间产物和产物的保留时间分别如下：(S)-香茅醛，21.589min；(R)-香茅醛，22.127min；(R)-香茅醇，27.741min；香叶醇，28.585min；橙花醛，29.037min；香叶醛，30.087min。图4中b和c所示分别为双酶偶联合成(R)-香茅醇的对照和反应液色谱图。
其余反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相。上层有机相经减压蒸馏去除乙酸乙酯，最终获得(R)-香茅醇，产率>85％。
实施例3：酶法合成(R)-香茅醇的最适温度
选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃，其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差，结果如图5所示。
如图5所示，在25℃时催化，产物的转化率为48.75％。随着温度的升高，产物的转化率也随之升高；当催化温度为40℃时，产物的转化率已达到68.24％。当温度升高至45℃和50℃时，产物的转化率也随之降至65.78％和58.92％。由此可知，催化体系的最适温度为40℃。
实施例4：酶法合成(R)-香茅醇的湿菌体质量比
选取醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2和1:3和1:4。反应温度为40℃。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差，结果如图6所示。
辅酶循环是否能高效运转与两个酶之间的活力比值有关。如图6所示，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的比例为6:1时，产物的转化率为57.21％。随着配比由6:1至5:1、4:1时，产物的转化率也由57.21％升高至65.64％，随后将配比调整为3:1、2:1、1:1时，产物的转化率由65.64％降至42.11％。因此，催化体系的最适醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为4:1，即在5mL的体系中，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG按0.8g:0.2g的比例混合加入。
实施例5：酶法合成(R)-香茅醇的最适搅拌速度
选取转速为取0rpm、100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm和600rpm。反应温度为40℃，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为4:1。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图7所示，当反应体系处于静息(0rpm)状态时，产物的转化率为42.15％。当将转速提高到400rpm时，产物的转化率提高到74.02％，随后继续将转速由400rpm逐渐升高至600rpm时，产物的转化率降至51.23％。因此，催化体系的最适转速可为400rpm。
实施例6：酶法合成(R)-香茅醇的最适pH
将反应体系的pH设为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，反应温度为40℃，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为4:1，转速为400rpm。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
结果如图8所示，当pH为6.0时，产物的转化率为76.54％。随着pH的升高，产物的转化率也随之升高，当pH为7.5时，产物的转化率高达90.35％。然而随着反应液的pH值继续升高，产物的转化率出现下降趋势，当pH 9.0和pH 9.5时，产物的转化率分别为60.40％和30.51％。由此可见，最适的反应pH为7.5。
实施例7：底物浓度对酶法合成(R)-香茅醇的影响
底物终浓度分别为0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、8 0mM、90mM和100mM。反应温度为40℃，反应pH为7.5，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为4:1(0.8g:0.2g)，转速为400rpm，辅酶NADP+浓度为0.4mM，反应体系为5mL。其他操作及反应条件同实施例2。
如图9所示，香茅醇的产物得率随底物浓度的增加而减少。当底物浓度为10mM时，转化率达到96.53％；当底物浓度为20mM时，转化率达到95.86％；当底物浓度为30mM时，转化率达到95.29％；当底物浓度为40mM时，转化率达到95.12％。总而言之，就是在40mM的底物浓度下，产物得率都可以达到95％以上。从40mM以后，产物得率就有了非常明显的下降，在50-100mM浓度的香叶醇中，香茅醇的产物得率从80.53％降到了30.54％，这表明底物浓度的增加一定程度上会抑制了酶的催化活力。
实施例8：醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG双酶偶联酶法合成(R)-香茅醇的反应进程
反应体系(5mL)如下：反应温度为40℃，pH为7.5，醇脱氢酶YsADH与老黄酶OYE2y-HG的湿菌体质量比为4:1(0.8g:0.2g)，转速为400rpm，辅酶NADP+浓度为0.4mM，底物香叶醇终浓度为40mM。其他操作及反应条件同实施例2。分别在0、0.5、1、2、3、4、5、6、7和8小时取样检测。
如图10所示，随着反应的进行，底物逐渐被消耗，产物的转化率也随之升高；当催化反应时间为6h时，产物的转化率已达到95.12％，底物完成被消耗，而中间产物香叶醛和(R)-香茅醛维持在极低的水平，香叶醛和(R)-香茅醛得率分别为1.41％和3.28％。由此可知，在40mM的底物浓度下，反应6h，反应基本完全。经气相-质谱联用分析，底物和产物分别确认为香叶醇和香茅醇(图11和12)。质谱检测条件如下：辅助加热器温度，250℃；MS四极杆温度，150℃；离子源温度，230℃；质谱扫描范围，30-500amu；发射电流，200μA；电子能量，70eV。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种双酶偶联合成(R)-香茅醇的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> 约克氏菌(Yokenella sp.)
<400> 1
Met Ser Ile Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Ser Glu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Gly Glu Leu Arg Pro Glu Asp Val Glu
20 25 30
Val Gln Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile
35 40 45
Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu
50 55 60
Val Ile Gly Arg Val Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Glu Lys Gly
65 70 75 80
Val Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys
85 90 95
Gly His Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Leu Glu
100 105 110
Gly Ala Val Ala Thr Ile Leu Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu
115 120 125
Arg Ala Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Ser Ile Asp Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro
145 150 155 160
Leu Leu Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly
165 170 175
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Cys Glu Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ser Lys Glu Gln Glu Val
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Leu Ala Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Asp Ala
210 215 220
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245 250 255
His Phe His Thr Val Gly Ala Val Met Lys Pro Leu Pro Val Pro Ala
260 265 270
Phe Thr Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Ile Ser Gly Ser Ala Thr Gly
275 280 285
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290 295 300
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<212> DNA
<213> 约克氏菌(Yokenella sp.)
<400> 2
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<211> 400
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)
<400> 3
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<211> 1203
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<213> 酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)
<400> 4
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taa 1203
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