阅读说明：本技术 α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药 (α -tocopheryl polyethylene glycol succinate modified cardiac glycoside compound prodrug ) 是由 殷军 韩娜 李怡雯 叶纯 刘志惠 翟健秀 李嗣凯 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)修饰的强心苷类化合物前药及其制备和用途。具体涉及从暗消藤中分离得到的强心苷类化合物的TPGS前药及其制备方法和抗肿瘤用途。所述的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药的结构至少包含以下通式中的一种,其中,R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>如权利要求书和说明书所述。<Image he="300" wi="700" file="DDA0002213903730000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines, and relates to α -Tocopheryl Polyethylene Glycol Succinate (TPGS) -modified cardiac glycoside compound prodrug, preparation and application thereof, in particular to TPGS prodrug of cardiac glycoside compound separated from streptocaulon juventas, a preparation method and anti-tumor application thereof, wherein the structure of the α -tocopheryl polyethylene glycol succinate-modified cardiac glycoside compound prodrug at least comprises one of the following general formulas, wherein R is shown in the specification 1 、R 2 、R 3 、R 4 As described in the claims and specification.)

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)修饰的强心苷类化合物前药及其制备和用途。具体涉及从暗消藤中分离得到的强心苷类化合物的TPGS前药及其制备方法和抗肿瘤用途。

背景技术

本发明涉及的强心苷类化合物是从萝藦科马莲鞍属植物暗消藤中分离得到的。暗消藤[Streptocaulon juventas(Lour.)Merr.]隶属萝藦科(Asclepiadaceae)马莲鞍属(Streptocaulon)植物，主产于东南亚地区，我国主要分布在云南和广西两地，根据《药用植物辞典》中记载，其为一种民间用药，茎少用，根起补肾和强壮作用，根和茎均可以健脾胃，乳汁有去目翳的功效，用于结膜炎的治疗。

在前期研究中，我们从暗消藤中分离得到了一系列具有良好的抗肿瘤活性的强心苷类化合物。但是该系列强心苷类化合物的体内代谢时间过快，水溶性和脂溶性均较低，极大限制了其广泛的临床应用。因此，增强该系列强心苷类化合物水溶性，延长其体内循环时间，进而提高其生物利用度，对促进该系列强心苷类化合物的临床应用具有重要的意义。

高分子前药是将药物分子通过化学键连接到高分子载体链上，高分子载体自身的特性使得高分子前药具有特定的功能性，如增溶、保护、靶向输送、增强细胞摄取、控制释放等，是目前较为先进的药物成药性改良方式之一。目前，应用较为广泛的高分子载体主要包括聚乙二醇(PEG)、α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、羟乙基淀粉等，这些高分子载体可以与强心苷类化合物形成稳定的化学键，从而延长药物的体内半衰期，降低药物在体循环过程中的代谢速率，并且可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)提高其到达病灶部位的比例，进而增强抗肿瘤药效。

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)是一种天然维生素E的PEG化的水溶性高分子载体。TPGS具有两亲性结构，既含有亲脂性的α-生育酚，又含有亲水性的聚乙二醇，故具有表面活性剂的性质，在国内外已广泛应用于制剂研究中的增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂以及脂溶性药物传递系统的载体。同时，有研究表明，以TPGS作为高分子前药的载体，能够增加阿霉素、长春碱、紫杉醇等的细胞毒性，增加药物的细胞摄取率和细胞内分布，提高药物体内半衰期，增强药物的体内抗肿瘤效果。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一系列具有抗肿瘤活性的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药，所述的前药具有抗肿瘤活性。

具体地说，本发明是通过如下的技术方案而实现的：

本发明所述的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药的结构至少包含以下通式中的一种：

其中，

R₁、R₂为H或OH；

R₃为A-X、

或葡萄糖或洋地黄糖或洋地黄毒糖或加拿***糖；

R₄为H或OH或OAc；

R₅为A-X；

A为含有不同分子量聚乙二醇片段的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，所含聚乙二醇的分子量范围是2000-10000，优选2000-8000，可以为2000、4000、8000，最优选4000；

X为连接臂，包括-CH₂CH₂O-CO-或-CH₂CH₂O-CO-aa-，aa为氨基酸，包括甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸和脯氨酸。

具体地，本发明所述的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药，其结构如下：

本发明还提供了α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药的制备方法，先将α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯末端的羟基通过连接臂进行活化，再与强心苷进行化学连接。几类典型的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药的制备方法如下：

A、在α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯的末端羟基引入活性碳酸酯，再与强心苷在有机碱催化作用下进行酯交换反应，合成路线如下：

B、在α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯的末端羟基引入氨基酸，再与强心苷在缩合剂和有机碱催化作用下进行酯化反应，合成路线如下：

其中缩合剂为DCC、DIC、TBTU和EDC，最佳缩合剂为DCC。

有机碱为三乙胺、DMAP和吡啶，优选DMAP。

反应溶剂为吡啶、DMF或DMAO中的一种与二氯甲烷的混合溶剂，最佳混合溶剂为二氯甲烷和DMF。

反应温度为0-40℃，最佳温度为0-25℃；反应时间为1-6天，最佳反应时间为2-3天。

以化合物Ⅰ-Ⅱ(其中，强心苷为acovenosigenin A-β-glucoside以下简称TXA9；化合物Ⅰ为以-CH₂CH₂O-CO-为连接臂的强心苷类化合物前药；化合物Ⅱ为以-CH₂CH₂O-CO-aa-为连接臂的强心苷类化合物前药，aa为甘氨酸)为例进一步说明各α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药的制备方法。

(1)化合物Ⅰ的制备方法

将α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯的末端羟基与对硝基氯甲酸苯酯反应后，再与TXA9在DMAP、DCC催化下和DCM/DMF溶剂中反应，制得化合物Ⅰ。

(2)化合物Ⅱ的制备方法

将α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯与对硝基氯甲酸苯酯反应使其末端为活性碳酸酯，再与甘氨酸在碱性条件下发生酯交换反应使其末端为甘氨酸，最后甘氨酸的末端羧基与强心苷类化合物的活性羟基在EDCI/DMAP的催化作用下和DCM/DMF溶剂中发生酯化反应，制得化合物Ⅱ。

本发明进一步对化合物Ⅰ-Ⅱ的水溶性，按《中国药典》中溶解度实验项下的方法进行考察。测定结果表明，化合物Ⅰ-Ⅱ能够明显增加强心苷类化合物的水溶性，更易于制备成多种药物制剂，结果见表1。

对化合物Ⅰ-Ⅱ进行体外抗肿瘤细胞活性实验，结果显示，该类前药对人***癌PC-3细胞、人***Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721均具有良好的抗肿瘤活性，其中化合物Ⅰ与原药的抑制肿瘤细胞生长活性相当，化合物Ⅱ的抑制作用优于原药，结果见表2。

对化合物Ⅰ-Ⅱ进行体内药代动力学性质的考察。结果显示，与原型药物相比，该类前药均能增加原药的血药浓度，延长其体内半衰期，其中，化合物Ⅱ显示出更长的体内半衰期和更高的药时曲线下面积，更利于增强药物的体内抗肿瘤药效，结果见图1和表3。

由于化合物Ⅱ在以上实验结果中，显示出最强的肿瘤细胞抑制作用和最好的体内药代动力学性质，因此，本发明进一步对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验。实验结果(表3)显示，与TXA9组相比，化合物Ⅱ能够显著提高原药的体内抗肿瘤药效，并且化合物Ⅱ高剂量组的抑瘤率可达52.46％，与阳性对照顺铂的抑瘤率(54.57％)相当，说明化合物Ⅱ对裸鼠接种的人源肺腺癌细胞株A549移植瘤具有良好的抑制肿瘤生长的作用。

本发明还提供了一种药物组合物，包含所述的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药和药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还提供了所述α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药和药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤为肺癌、胃癌、肝癌、子***、急性白血病、结肠癌、乳腺癌、肉瘤、鼻咽癌、卵巢癌、皮肤癌、***癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、肾脏肿瘤、直肠癌、口腔癌、食道癌、胆癌、胆道癌、胆管癌、胰腺癌、骨癌、喉癌、舌癌、胸腺癌、淋巴癌、恶性甲状腺肿瘤、脑肿瘤、中枢神经系统肿瘤、纵膈肿瘤、黑色素瘤。

本发明中，利用α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯能够延长药物体内循环时间的特性，用α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯对系列强心苷类化合物进行结构修饰，同时，采用体内可裂解的碳酸酯键和水溶性较强的氨基酸作为连接臂，设计并合成了系列强心苷类化合物前药。所制备的α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的强心苷类化合物前药能够明显增强原形药物的水溶性，延长其体内半衰期，进而增强其体内抗肿瘤药效。

附图说明

图1为化合物Ⅰ-Ⅱ进行体内药代动力学曲线。

具体实施方式

实施例1：化合物Ⅰ的制备

准确称取TPGS₄₀₀₀(1.20mmol)，对硝基氯甲酸苯酯(5.80mmol)，DMAP(2.40mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入25mL无水二氯甲烷，反应12h。TLC检测反应完全，反应液依次用等体积的10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析纯化产物，得白色粉末状固体，即TPGS₄₀₀₀-pNP，收率58％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.29(d,J＝9.1Hz,2H),7.40(d,J＝9.1Hz,2H),4.47–4.41(m,2H),4.28–4.25(m,2H),3.82–3.81(m,2H),3.77–3.75(m,2H),3.65(br.s),2.93(t,J＝6.8Hz,2H),2.80(t,J＝6.8Hz,2H),2.58(t,J＝6.8Hz,2H),2.08(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),1.81(d,J＝6.7Hz,1H),1.75(d,J＝6.6Hz,1H),1.56–1.49(m,3H),1.38–1.05(m,21H),0.87–0.84(m,12H).

准确称取上述制备的TPGS₄₀₀₀-pNP(0.25mmol)，加入30mL甲苯，搅拌，115℃回流2h，72℃减压蒸干溶剂，用30mL无水二氯甲烷复溶。准确称取TXA9(0.30mmol)于5mL圆底烧瓶中，用1.3mL无水DMF使之溶解，缓慢滴加至反应体系中，另加三乙胺(0.27mmol)，室温反应48h。TLC检测产物不再增加，反应液用蒸馏水萃取5次，10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即化合物Ⅰ，收率77％。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.88(s,1H),4.99(dd,J＝18.2,1.9Hz,1H),4.81(dd,J＝18.1,1.7Hz,1H),4.78(d,J＝9.4Hz,1H),4.71(t,J＝9.5Hz,1H),4.45-4.41(m,8H),4.27-4.26(m,8H),4.04(d,J＝11.1Hz,1H),3.88(dd,J＝11.7,3.6Hz,1H),3.77-3.75(m,8H),3.74-3.71(m,8H),3.65(br.s),2.94(d,J＝6.5Hz,8H),2.79(d,J＝6.6Hz,8H),2.58(t,J＝6.8Hz,8H),2.08(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),0.95-0.92(m,3H),0.87-0.84(m,47H).

实施例2：化合物Ⅱ的制备

准确称取TPGS₄₀₀₀-pNP(0.37mmol)，甘氨酸(2.80mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL 2/3乙腈水，搅拌，待反应物完全溶解后，加入200μl三乙胺(1.40mmol)，25℃反应5h。TLC检测反应完全，用稀盐酸调pH至2，适量水稀释反应液，用等体积***萃取3次，二氯甲烷萃取5次，合并有机层，无水硫酸钠干燥4h，过滤，浓缩至少量，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即TPGS₄₀₀₀-Gly，收率83％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.64(s,1H),4.28-4.25(m,2H),4.23(d,J＝4.9Hz,1H),3.96(d,J＝5.2Hz,1H),3.77-3.75(m,2H),3.71-3.70(m,2H),3.65(br.s),3.11(qd,J＝7.3,4.9Hz,2H),2.93(t,J＝6.8Hz,2H),2.79(t,J＝6.8Hz,2H),2.58(t,J＝6.7Hz,2H),2.08(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),1.80(d,J＝6.8Hz,1H),1.75(d,J＝6.7Hz,1H),1.59-1.50(m,3H),1.38-1.03(m,21H),0.88-0.83(m,12H).

准确称取上述制备的TPGS₄₀₀₀-Gly(0.25mmol)，DCC(0.50mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL无水二氯甲烷，搅拌，溶解后于0℃反应30min。准确称取TXA9(0.31mmol)，用1.3mL无水DMF溶解后，缓慢滴加至反应体系中，另加三乙胺(0.25mmol)，滴加完毕，于25℃反应48h。TLC检测反应完全，反应液用蒸馏水萃取5次，10％柠檬酸水溶液萃取3次，饱和氯化钠水溶液萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，无水***析出产物，抽滤，得白色粉末状固体，即化合物Ⅱ，收率71％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ5.88(s,1H),5.61-5.57(m,2H),5.05-5.02(m,1H),4.99(d,J＝17.2Hz,1H),4.94-4.87(m,1H),4.81(d,J＝17.8Hz,1H),4.50-4.31(m,4H),4.28-4.26(m,2H),4.25-4.23(m,2H),4.07-4.04(m,1H),4.03-3.97(m,2H),3.88(m,1H),3.77-3.75(m,4H),3.71-3.69(m,4H),3.65(br.s),2.93(t,J＝6.8Hz,4H),2.79(t,J＝6.9Hz,4H),2.58(t,J＝6.8Hz,4H),2.08(s,6H),2.01(s,6H),1.97(s,6H),0.93(d,J＝7.5Hz,3H),0.87-0.83(m,32H).

实施例3：化合物Ⅰ-Ⅱ水溶性测定

按《中国药典》中溶解度实验项下的方法，分别精密称取一定量研成细粉的化合物Ⅰ-Ⅱ，于25±2℃分批加入一定量的生理盐水，每隔5min强力振摇30s，观察30min内溶解情况，以目视无可见的溶质颗粒，视为完全溶解。记录使药物细粉完全溶解的生理盐水体积，计算化合物Ⅰ-Ⅱ在水中的溶解度。

TXA9水溶性的测定方法为：取研成细粉的TXA9一定量，置于磨口试管中，加入定量的生理盐水，配成TXA9过饱和溶液，置于37℃恒温振荡器(180转/分钟)内振荡24h，12000rpm离心15min后取上清，过0.45μm水膜，用HPLC检测，记录峰面积，计算TXA9在水中的溶解度。

实验结果见表1。结果表明，与原药TXA9相比，化合物Ⅰ-Ⅱ的水溶性提高了10-19倍，说明化合物Ⅰ-Ⅱ能够明显增加TXA9的水溶性，更易于制备成多种药物制剂。

表1化合物Ⅰ-Ⅱ水溶性测定结果

^*化合物的水溶性与TXA9水溶性的比值

实施例4：化合物Ⅰ-Ⅱ对肿瘤细胞的的生长抑制活性测定

本实验考察了化合物Ⅰ-Ⅱ对人***癌PC-3细胞、人***Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721五种肿瘤细胞的生长抑制作用。选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的培养基配成5×10⁴/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔100μl，37℃，5％CO₂培养24h。实验组更换新的含不同浓度化合物Ⅰ-Ⅱ的培养液，对照组则更换含等体积溶剂的培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％CO₂培养48h。弃去上清液，用PBS小心洗2次，每孔加入100μl新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的培养基，37℃继续培养4h。小心弃去上清，并加入150μl DMSO，用微型振荡器混匀10min后，用酶标仪在492nm处测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

从而求出样品的半数抑制浓度(IC₅₀)。

体外抗肿瘤细胞实验结果见表2，结果表明化合物Ⅰ-Ⅱ具有良好的抑制肿瘤细胞生长的活性，其中化合物Ⅱ对肿瘤细胞的生长抑制作用优于TXA9。

表2化合物Ⅰ-Ⅱ对五种肿瘤细胞的IC₅₀值(nM，TXA9当量)

实施例5：化合物Ⅰ-Ⅱ的体内药代动力学考察

取18只大鼠，随机分为3组，分别通过尾静脉单剂量注射给予TXA9(5mg/kg)，化合物Ⅰ-Ⅱ(5mg/kg TXA9当量)，于给药后5min、15min、30min、1h、1.5h、2h和3h取血0.5mL，血样离心取血浆后，用甲醇沉淀血浆蛋白，离心取上清，用HPLC测定血浆中TXA9含量，绘制药时曲线，结果见图1，用DAS 2.0.软件计算药代动力学参数，结果见表3。实验结果显示，与原形药物TXA9相比，化合物Ⅰ-Ⅱ均能增加TXA9的血药浓度，延长其体内半衰期，其中，化合物Ⅱ显示出更长的体内半衰期和更高的药时曲线下面积，更利于增强药物的体内抗肿瘤药效。

表3化合物TXA9与化合物Ⅰ-Ⅱ的体内药代动力学参数

与化合物TXA9组相比，^*p<0.05,^***p<0.001。

实施例6：化合物Ⅱ的体内抗肿瘤药效学实验

由于化合物Ⅱ在以上实验结果中，显示出更好的水溶性和更强的肿瘤细胞生长抑制作用，因此，对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验。相比于其他细胞系，A549细胞对TXA9及其前药的敏感性最高，故选用此细胞进行体内抗肿瘤实验。

将人肺癌A549细胞按照1×10⁸cells/mL的浓度处理，取50只裸鼠，每只小鼠腋窝皮下接种0.2mL。10天后，肿瘤平均体积大于100mm³，随机分5组：模型组、顺铂阳性药组(4mg/kg)、TXA9组(5mg/kg)、化合物Ⅱ低剂量组(5mg/kg TXA9当量)、化合物Ⅱ高剂量组(10mg/kg TXA9当量)，连续给药28天，观察肿瘤生长情况，计算抑瘤率。

对化合物Ⅱ进行裸鼠的体内抗肿瘤药效实验结果(表3)显示，与原药TXA9(抑瘤率25.26％)相比，化合物Ⅱ的抑瘤率可达43.81％(低剂量组)和52.46％(高剂量组)，说明化合物Ⅱ能够显著提高原药的体内抗肿瘤药效；化合物Ⅱ高剂量组的抑瘤率与顺铂阳性药组(54.57％)相当，说明化合物Ⅱ对裸鼠接种的人源肺腺癌细胞株A549移植瘤具有良好的抑制肿瘤生长作用。

表4化合物Ⅱ的体内抗肿瘤药效实验结果