阅读说明：本技术 红花八角醇曼尼希碱类衍生物及其制备方法和应用 (Safflower octal mannich base derivative and preparation method and application thereof ) 是由 郭勇 柳继锋 姚红 秦上尚 包崇男 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及红花八角醇曼尼希碱类衍生物及其制备方法和应用,有效解决治疗金黄色葡萄球菌和MRSA的药物出现耐药菌株,需要新的抗金黄色葡萄球菌和MRSA感染药物的问题,结构式：<Image he="480" wi="489" file="DDA0002264487590000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>R为：(1)：<Image he="134" wi="203" file="DDA0002264487590000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(2)：<Image he="147" wi="244" file="DDA0002264487590000013.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(3)：<Image he="197" wi="270" file="DDA0002264487590000014.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(4)：<Image he="166" wi="247" file="DDA0002264487590000015.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(5)：<Image he="151" wi="236" file="DDA0002264487590000016.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(6)：<Image he="210" wi="198" file="DDA0002264487590000017.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(7)：<Image he="190" wi="216" file="DDA0002264487590000018.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>中的一种,红花八角醇用甲苯溶解,加入醛和仲胺反应,二氯甲烷溶解,薄层色谱法分离得化合物1-5纯品；化合物1和化合物2纯品用二氯甲烷溶解,加入浓盐酸,减压除去二氯甲烷,得化合物6和7粗品,在乙醇中重结晶得化合物6和7纯品,本发明衍生物对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草杆菌和MRSA表现出抑菌活性。(The invention relates to a safflower octal mannich base derivative, a preparation method and application thereof, which effectively solve the problems that medicines for treating staphylococcus aureus and MRSA have drug-resistant strains and need new medicines for resisting the infection of the staphylococcus aureus and MRSA, and have the following structural formula: r is: (1): (2)： (3)： (4)： (5)： (6)： (7)： one of the compounds is prepared by dissolving octandiol safflower in toluene, adding aldehyde and secondary amine to react, dissolving with dichloromethane, and separating by thin layer chromatography to obtain 1-5 pure compounds; dissolving the pure products of the compound 1 and the compound 2 by using dichloromethane, adding concentrated hydrochloric acid, decompressing and removing the dichloromethane to obtain crude products of the compound 6 and the compound 7, and recrystallizing in ethanol to obtain pure products of the compound 6 and the compound 7.)

红花八角醇曼尼希碱类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别是一种红花八角醇曼尼希碱类衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

当前，细菌耐药已经成为全球公共健康领域的重大挑战，也是各国政府和社会广泛关注的世界性问题。MRSA是临床常见的革兰阳性病原菌，毒力强，可引起败血症、坏死性肺炎、脑膜炎、骨髓炎和心内膜炎等，具有高发病率、高致死率的特点(Vanbelkum A,etal.2009.Infection,Genetics and Evolution,9(1):32)。全国细菌耐药监测网(CARSS)监测数据显示，2017年中国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株全国的平均分离率为32.2％。目前，临床治疗MRSA的药物主要包括万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、达托霉素等，但是细菌的耐药性发展速度非常迅猛，临床上已逐渐出现了上述药物的耐药菌株。因此，开发新的抗MRSA感染药物，已成为临床急需解决的问题。

红花八角醇(dunnianol)是一种天然植物来源的倍半新木脂素类化合物(Sesqui-neolignans)，其结构特点是由三个苯丙烷类化合物聚合而成。红花八角醇首次发现是从红花八角中分离得到的(Kouno I,et al.1991.Chemical and Pharmaceutical Bulletin,39(10):2606)。

然而，对红花八角醇的活性方面鲜有报道，本课题组前期研究虽已发现红花八角醇对金黄色葡萄球菌和MRSA有一定的抗菌效果(柳继锋等.2017.CN 106822068)，但如何开发出新的抗MRSA感染药物，从而得到活性更好的新型抗菌剂，却没有进一步的公布。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种红花八角醇曼尼希碱类衍生物及其制备方法和应用，可有效解决目前治疗金黄色葡萄球菌和MRSA的药物已出现耐药菌株，需要开发新的抗金黄色葡萄球菌和MRSA感染药物的问题。

本发明的技术方案是，红花八角醇曼尼希碱类衍生物，化学结构式为：

其中R为：

中的一种；

上述红花八角醇曼尼希碱类衍生物的制备方法，具体步骤为：将红花八角醇用甲苯溶解，分别再加入醛和仲胺(secondary amine)，进行胺甲基化反应，反应结束后，用二氯甲烷溶解，再用薄层色谱法分离得到化合物1-5纯品，产率为20％-93％；将化合物1纯品用二氯甲烷(dichloromethane)溶解，再逐滴加入浓盐酸，减压除去二氯甲烷，即得化合物6粗品，化合物6粗品在乙醇中重结晶得到化合物6纯品，产率为93％；化合物2纯品用二氯甲烷溶解，再逐滴加入浓盐酸，减压除去二氯甲烷，即得化合物7粗品，化合物7粗品在乙醇中重结晶得到化合物7纯品，产率为60％，化合物1-7纯品均为本发明红花八角醇曼尼希碱类衍生物；

所述的醛为甲醛水溶液；

所述的甲醛水溶液为质量百分比浓度37％甲醛水溶液(formaldehyde)；

所述的仲胺为二甲胺水溶液、四氢吡咯、N-甲基哌嗪、哌啶、吗啉中的任意一种；

所述的二甲胺水溶液为质量百分比浓度40％二甲胺水溶液；

所述的红花八角醇和醛、仲胺的重量比为1-2：1：0.8-1.4；

所述的胺甲基化反应的温度为100-120℃，胺甲基化反应时间为3-9h；

所述的浓盐酸为质量分数为36-38％的浓盐酸；

所述的浓盐酸和化合物1纯品的重量比为2.5-2.9：1；

所述的浓盐酸和化合物2纯品的重量比为2.5-2.9：1；

所述的减压除去二氯甲烷的温度为30-45℃。

本发明制备的部分红花八角醇曼尼希碱类衍生物对金黄色葡萄球菌表现出良好的活性，如化合物3和4对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和枯草杆菌都表现出抑菌活性，最小抑制浓度(MIC)在8-64μg/mL之间。化合物5对临床分离的MRSA也表现出抑菌活性，MIC为>64μg/mL。最为突出的是化合物1,2,6,7对标准金黄色葡萄球菌29213和MRSA的MIC结果都在1-2μg/mL之间。因此，本发明化合物将作为新的抗菌候选药物，从而解决目前全球面临的耐药菌问题。

附图说明

图1为本发明化合物6的红外光谱图(IR)。

图2为本发明化合物6的核磁共振图谱。

图3为本发明化合物6对培养3h的金黄色葡萄球菌的杀菌速度(a)；化合物6对培养2.5h的MRSA 4的杀菌速度(b)；化合物6对培养5h的金黄色葡萄球菌的杀菌速度(c)；化合物6对培养5h的MRSA 4的杀菌速度(d)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

化合物1纯品的制备步骤为：将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，再分别加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和42.4mg的质量百分比浓度40％二甲胺水溶液，于110℃分别反应5h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物1纯品，产率为93％。

或将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，再分别加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和42.4mg的质量百分比浓度40％二甲胺水溶液，于100℃或120℃分别反应3h、4h、6h、7h、8h或9h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物1纯品，产率为93％；

化合物1纯品的化学结构式为：

化合物1纯品的理化性质：

1)、棕色固体，熔点171-172℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3433cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，3074,2923cm^-1分别为不饱和，饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1464cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:7.13(s,2H,-Ar),7.12(s,2H,-Ar),6.80(s,2H,-Ar),5.92-6.08(m,3H,-CH＝CH₂),5.03-5.14(m,6H,-CH＝CH₂),3.71(s,4H,-CH₂-N(CH₃)₂),3.41(d,J＝6.8Hz,2H,-CH₂-CH＝CH₂),3.32(d,J＝6.4Hz,4H,-CH₂-CH＝CH₂),2.33(s,12H,-CH₃)。

实施例2

化合物2纯品的制备步骤为：将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和26.8mg的四氢吡咯，于110℃反应5h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物2纯品，产率为78％。

或将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和26.8mg的四氢吡咯，于100℃或120℃分别反应3h、4h、6h、7h、8h或9h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物2纯品，产率为78％。

化合物2纯品的化学结构式为：

化合物2的理化性质如下：

1)、棕色固体，熔点109-110℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3428cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，3074,2971,2925cm^-1分别为不饱和，饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1462cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:7.19(d,J＝1.6Hz,2H,-Ar),7.17(s,2H,-Ar),6.97(s,2H,-Ar),5.99-6.07(m,1H,-CH＝CH₂),5.92-5.98(m,2H,-CH＝CH₂),5.02-5.13(m,6H,-CH＝CH₂),4.04(s,4H,N-CH₂-),3.41(d,J＝6.4Hz,2H,-CH₂-CH＝CH₂),3.34(d,J＝6.4Hz,4H,-CH₂-CH＝CH₂),2.89(s,8H,pyrrolidine),1.79(s,8H,pyrrolidine)。

实施例3

化合物3纯品的制备步骤为：将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和37.7mg的N-甲基哌嗪，于110℃反应7h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物3纯品，产率为61％。

或将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和37.7mg的N-甲基哌嗪，于100℃或120℃分别反应3h、4h、5h、6h、8h或9h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物3纯品，产率为61％。

化合物3纯品的化学结构式为：

化合物3的理化性质如下：

1)、灰色固体，熔点180-181℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3431cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，2922cm^-1为饱和碳氢伸缩振动吸收，1584cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1444cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:7.13(s,2H,-Ar),7.11(d,J＝1.6Hz,2H,-Ar),6.78(d,J＝1.6Hz,2H,-Ar),5.92-6.09(m,3H,-CH＝CH₂),5.02-5.15(m,6H,-CH＝CH₂),3.71(s,4H,N-CH₂-),3.41(d,J＝6.8Hz,2H,-CH₂-CH＝CH₂),3.32(d,J＝6.4Hz,4H,-CH₂-CH＝CH₂),2.98(t,J＝11.2Hz,8H,piperazine),2.01-2.18(m,8H,piperazine),1.63(s,3H,-CH₃),1.60(s,3H,N-CH₃)。

实施例4

化合物4纯品的制备步骤为：将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和32.1mg的哌啶，于110℃反应7h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物4纯品，产率为46％。

或将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和32.1mg的哌啶，于100℃或120℃分别反应3h、4h、5h、6h、8h或9h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物4纯品，产率为46％。

化合物4纯品的化学结构式为：

化合物4的理化性质如下：

1)、黄色固体，熔点123-124℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3423cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，2921cm^-1为饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1455cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:7.44(d,J＝6.8Hz,4H,-Ar),7.24-7.32(m,6H,-Ar),7.16(s,2H,-Ar),7.09(s,2H,-Ar),6.73(d,J＝1.6Hz,2H,-Ar),6.01-6.12(m,1H,-CH＝CH₂),5.87-5.97(m,2H,-CH＝CH₂),4.98-5.17(m,6H,-CH＝CH₂),4.51(s,1H,N-CH),4.50(s,1H,N-CH),3.44(d,J＝6.8Hz,2H,-CH₂-CH＝CH₂),3.25(d,J＝6.4Hz,4H,-CH₂-CH＝CH₂),2.70-2.73(m,2H,piperazine),2.09(t,J＝10.0Hz,2H,piperazine),1.92(t,J＝11.2Hz,2H,piperazine),1.56-1.64(m,4H,piperazine),1.36-1.41(m,4H,piperazine),1.14-1.20(m,2H,piperazine),0.86(t,J＝6.0Hz,6H,N-CH₃)。

实施例5

化合物5纯品的制备步骤为：将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和32.8mg的吗啉，于110℃反应6h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物5纯品，产率为20％。

或将50.0mg的红花八角醇用2mL甲苯溶解，加入30.6mg的质量百分比浓度37％甲醛水溶液和32.8mg的吗啉，于100℃或120℃分别反应3h、4h、5h、7h、8h或9h，反应结束后，用二氯甲烷溶解，然后用薄层色谱法分离得到化合物5纯品，产率为20％。

化合物5纯品的化学结构式为：

化合物5的理化性质如下：

1)、淡黄色固体，熔点128-129℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3414cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，2922cm^-1为饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1458cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:7.32(d,J＝7.2Hz,4H,-Ar),7.15(s,2H,-Ar),7.08-7.12(m,6H,-Ar),6.72(d,J＝1.6Hz,2H,-Ar),6.01-6.11(m,1H,-CH＝CH₂),5.87-5.97(m,2H,-CH＝CH₂),4.98-5.16(m,6H,-CH＝CH₂),4.49(s,1H,N-CH),4.43(s,1H,N-CH),3.43(d,J＝6.4Hz,2H,-CH₂-CH＝CH₂),3.24(d,J＝6.8Hz,4H,-CH₂-CH＝CH₂),2.72-2.74(m,2H,piperazine),2.31(s,3H,Ar-CH₃),2.30(s,3H,Ar-CH₃),2.09(t,J＝10.0Hz,2H,piperazine),1.91(t,J＝10.8Hz,2H,piperazine),1.56-1.65(m,4H,piperazine),1.36(t,J＝8.4Hz,4H,piperazine),1.14-1.19(m,2H,piperazine),0.86(t,J＝6.0Hz,6H,N-CH₃)。

实施例6

化合物6纯品的制备步骤为：将200.0mg的化合物1纯品(由实施例1制得)用5mL二氯甲烷溶解，再逐滴加入76.9mg的质量分数37％浓盐酸，于40℃减压除去二氯甲烷，即得到化合物6粗品，粗品在乙醇中重结晶得到化合物6纯品，产率为93％。

或将200.1mg的化合物1纯品(由实施例1制得)用5mL二氯甲烷溶解，再逐滴加入80.04mg或69mg的质量分数36％或38％浓盐酸，于30℃或45℃减压除去二氯甲烷，即得到化合物6粗品，化合物6粗品在乙醇中重结晶得到化合物6纯品，产率为93％。

化合物6纯品的化学结构式为：

化合物6的理化性质如下：

1)、白色固体，熔点160-161℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3420cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，2925cm^-1为饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1465cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代DMSO为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:10.23(s,2H,HCl),7.28(d,J＝2.0Hz,2H,-Ar),7.07(d,J＝2.0Hz,2H,-Ar),7.00(s,2H,-Ar),5.93-6.03(m,3H,-CH＝CH₂),5.02-5.15(m,6H,-CH＝CH₂),4.27-4.28(m,4H,-CH₂-N(CH₃)₂),3.30-3.37(m,6H,-CH₂-CH＝CH₂),2.74(s,6H,-CH₃),2.73(s,6H,-CH₃)。

实施例7

化合物7纯品的制备步骤为：将97.6mg的化合物2(化合物2纯品)用3mL二氯甲烷溶解，再逐滴加入34.1mg的质量分数37％浓盐酸，于40℃减压除去二氯甲烷，即得到化合物7粗品，化合物7粗品在乙醇中重结晶得到化合物7纯品，产率为60％。

或将97.6mg的化合物2(化合物2纯品)用3mL二氯甲烷溶解，再逐滴加入39.04mg或34mg的质量分数36％或38％浓盐酸，于30℃或45℃减压除去二氯甲烷，即得到化合物7粗品，化合物7粗品在乙醇中重结晶得到化合物7纯品，产率为60％。

化合物7纯品的化学结构式为：

化合物7的理化性质如下：

1)、白色固体，熔点153-154℃。

2)、该化合物的红外光谱图(IR)特征：

采用溴化钾压片法：3386cm^-1为酚羟基伸缩振动吸收，2974cm^-1为饱和碳氢伸缩振动吸收，1637cm^-1为碳碳双键伸缩振动吸收，1478,1462cm^-1为芳环骨架振动吸收。

3)、该化合物的核磁共振图谱(¹H NMR，400MHz)特征：

以氘代氯仿为溶剂，TMS为内标，其中各峰归属为：δ:11.20(s,2H,HCl),7.30(s,2H,-Ar),7.21(s,2H,-Ar),7.14(s,2H,-Ar),5.94-6.04(m,3H,-CH＝CH₂),5.06-5.15(m,6H,-CH＝CH₂),4.39(s,4H,-CH₂-pyrrolidine),3.63(s,4H,pyrrolidine),3.37-3.42(m,6H,-CH₂-CH＝CH₂),2.97(s,4H,pyrrolidine),1.96-2.05(m,8H,pyrrolidine)。

应用例1：体外抗菌活性测定

1、供试细菌：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)；MRSA 1-10(临床分离株)

2、样品及试剂：

样品为：红花八角醇、万古霉素以及本发明实施例制备的化合物1-7纯品(简称化合物1-7)。

3、测试方法：

根据美国国家临床实验室标准，在96孔板上釆用二倍稀释的方法对化合物红花八角醇及本发明化合物1-7(以下所述的本发明红花八角醇曼尼希碱类衍生物1-7和本发明红花八角醇类衍生物1-7均指本发明化合物1-7)和标准药物万古霉素的体外抗菌活性进行测试，用肉眼观察结合酶标分析仪于600nm测各孔OD值。以肉眼观察完全澄清孔的药物浓度为MIC值。

表一.本发明红花八角醇曼尼希碱类衍生物1-7的体外抑菌活性(μg/mL)

注：Van-万古霉素，MEM-美罗培南；S.aureus:金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)；E.faecalis:粪肠球菌(ATCC 29212)；B.subtilis:枯草杆菌；M.luteus:藤黄微球菌；E.coli:大肠杆菌(ATCC 25922)；S.maltophilia:嗜麦芽窄食单胞菌。

从表一得出，本发明制备的红花八角醇曼尼希碱类衍生物化合物3和4对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和枯草杆菌都表现出一定的抑菌活性，最小抑制浓度(MIC)在8-64μg/mL之间。最为突出的是化合物1,2,6,7对挑选的四株革兰氏阳性菌活性较好，对革兰氏阴性菌大肠杆菌也有一定的活性，体现了潜在的广谱抗菌特性。故本发明制备的红花八角醇曼尼希碱类衍生物可用于制备潜在的天然产物抑菌剂。

表二.本发明红花八角醇类衍生物1-7的抗MRSA活性(μg/mL)

注：Van-万古霉素；MRSA 1-10:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)临床分离株1-10。

从表二得出，本发明制备的红花八角醇曼尼希碱类衍生物3和4对临床分离的MRSA具有较好的抑制活性，MIC值在4-64μg/mL；化合物5对临床分离的MRSA也表现出一定的抑菌活性，MIC为>64μg/mL。表现最好的是化合物1,2,6,7对MRSA的MIC值基本都在1-2μg/mL，与阳性药物万古霉素的效果接近，有较好的抑菌活性。故本发明制备的红花八角醇曼尼希碱类衍生物可用于制备潜在的天然产物抑菌剂。

应用例2：时间杀菌动力学实验：

1、供试细菌：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)；MRSA 4(临床分离株)

2、样品及试剂：

样品为：万古霉素和本发明实施例制备的化合物6。

3、测试方法：

将金黄色葡萄球菌在225rpm，37℃摇床摇过夜后，用MHB培养基稀释10000倍，然后在225rpm，37℃摇2.5h(对数生长初期)和5h(对数生长中期)后，加入待测药物，药物浓度为浓度分别为6μg/mL、8μg/mL，万古霉素用作阳性对照，并设置不加药的空白组。加药后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，每个时间点将各组各取100μL到96孔板中于3500rpm，4℃下离心3min，移除上清，加入100μL的1×PBS溶液重悬后，用1×PBS溶液以十倍的梯度进行稀释，取稀释后的10μL的菌液滴到MH琼脂板上，每个浓度滴三下做平行对照，在37℃恒温培养箱中过夜培养，次日计菌落数，单位log₁₀CFU/mL，绘图，结果见图三。

结果表明，对于对数生长初期的S.aurens和MRSA 4，6μg/mL和8μg/mL的化合物6均能在1h内达到完全的清除作用，效果要明显优于阳性药物万古霉素。化合物6对对数生长中期的MRSA 4展现出了较为优异的杀菌效果，4h内便将细菌完全清除，而万古霉素只能起到一定的抑菌效果。对于对数生长中期的S.aurens，化合物6和万古霉素均未能在8h内将细菌全部杀死，但在相同的浓度下(8μg/mL)，化合物6达到的杀菌效果要优于阳性对照药物万古霉素。故本发明制备的红花八角醇曼尼希碱类衍生物可用于制备潜在的天然产物类抗菌候选药物。