阅读说明：本技术 一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其制备方法和应用 (Fluorescent probe for detecting mitochondrial membrane potential and preparation method and application thereof ) 是由 林伟英 郭丁一 田明刚 孙洁 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析化学技术领域,提供了一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其制备方法和应用。该线粒体膜电位荧光探针结构式为：<Image he="101" wi="462" file="DEST_PATH_IMAGE002.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>,能够以4-氟苯甲醛和哌嗪的反应产物与1,2-二甲基-喹啉碘盐反应获得。本发明提供的荧光探针具有低生物毒性、膜通透性好、合成方法简单、纯化步骤简便的特点,该探针能够应用于细胞成像,检测、标记或显示线粒体膜电位变化。(The invention belongs to the technical field of analytical chemistry, and provides a fluorescent probe for detecting mitochondrial membrane potential and a preparation method and application thereof. The structure formula of the mitochondrial membrane potential fluorescent probe is as follows: can be obtained by reacting the reaction product of 4-fluorobenzaldehyde and piperazine with 1, 2-dimethyl-quinoline iodonium salt. The fluorescent probe provided by the invention has the characteristics of low biological toxicity, good membrane permeability, simple synthesis method and simple and convenient purification steps, and can be applied to cell imaging and detecting, marking or displaying mitochondrial membrane potential change.)

一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其应用。

背景技术

线粒体三羧酸循环过程中，会将线粒体内部的质子主动运输到线粒体外，从而形成了达-160mV~ -180mV的内负外正的线粒体膜电位。线粒体膜电位为有氧呼吸过程提供能量，催化其分解具有高稳定性的化合物。此外，线粒体膜电位与细胞状态息息相关，线粒体膜电位的水平可以精确反映细胞的健康状态。因此，实时观测线粒体膜电位的变化具有重要的生理学、病理学和药理学意义。

到目前为止，荧光成像是研究线粒体膜电位变化的最重要工具。线粒体体积微小，难以精准的嵌入电极，这限制了电化学方法在检测线粒体膜电位上的应用。相比之下，荧光成像法具有对生物样本低损伤、可进行原位、动态观测等优点，是用于研究线粒体膜电位的理想工具。目前，TMRM和JC-1是常用于研究线粒体膜电位的荧光探针。TMRM常用于计算线粒体膜电位的大小，然而计算过程繁琐，限制了其在生物研究中的应用。JC-1在高膜电位的线粒体中呈现J-聚集态，发射橘红色荧光；在低膜电位的线粒体中呈现单体态，发射黄色荧光；因此JC-1可以通过荧光颜色的变化反映线粒体膜电位的状态，是常用于生物研究的线粒体膜电位探针。然而该探针对膜电位响应的荧光波长位移仅70 nm，这限制了其在细胞成像中的应用。近年来，人们在JC-1结构的基础上改造了数例线粒体膜电位探针，然而由于母体限制，荧光波长位移并无太大改变。发展一种可以实现亚细胞器迁移的线粒体膜电位荧光探针非常需要。

发明内容

针对现有技术中线粒体膜电位探针种类单一，且不能实现在线粒体膜电位变化时实现亚细胞器迁移的问题，本发明提供一种线粒体膜电位探针，该探针选择性好、灵敏度高，具有红发射，可以实现亚细胞器迁移。。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测线粒体膜电位的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测线粒体膜电位的荧光探针，其化学名称为为2,2'-(((1E,1'E)-(哌嗪-1,4-二基双(4,1-亚苯基)双（乙烯-2,1-二基））双（1-甲基喹啉-1-鎓）碘盐，简称BJI，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）2-甲基喹啉与碘甲烷在乙醇中加热反应，反应后分离得到1,2-二甲基-喹啉碘盐（化合物1）：

；

（2）4-氟苯甲醛与哌嗪溶于水和2-甲氧基乙醇的混合溶剂中，将混合物加热至回流，然后加入4-氟苯甲醛的2-甲氧基乙醇溶液，将混合物继续回流，反应结束后冷却至室温后，将混合物倒入水中，得到淡黄色沉淀，沉淀过滤、干燥后得到4,4’-（哌嗪-1,4-二基）二苯甲醛（化合物2）：

；

（3）1,2-二甲基-喹啉碘盐和4,4’-（哌嗪-1,4-二基）二苯甲醛溶于乙醇中，在吡咯烷存在下室温搅拌，有固体析出，过滤得粗产物，提纯后得产物，即线粒体膜电位荧光探针（BJI）：

。

步骤（1）中，2-甲基喹啉中与碘甲烷的摩尔比为1:1.2。

步骤（2）中，4-氟苯甲醛与哌嗪的摩尔比为1:2。

步骤（3）中，1,2-二甲基-喹啉碘盐与4,4’-（哌嗪-1,4-二基）二苯甲醛的摩尔比为2:1；1,2-二甲基-喹啉碘盐与吡咯烷的摩尔比为1:1-9

步骤（1）中，反应温度为90℃，反应时间为24-48小时。

步骤（2）中，反应温度为100℃，反应时间为24-48h。

步骤（3）中，反应温度为室温，反应时间为12-24h，提纯方法为重结晶。

一种上述荧光探针在检测、标记或显示线粒体膜电位变化中的应用。可采用波长为488nm的单光子激发，检测波段为红光波段550-650 nm。

本发明的荧光探针工作原理如下：

本发明所述荧光探针为阳离子盐型化合物，合适大小的共轭结构以及强的吸电子基团保证了红光发射，另外该探针特定的结构赋予其可以与RNA沟槽区域相嵌合从而识别RNA。当线粒体膜电位较高时，探针优先富集在线粒体上；而线粒体膜电位降低时，探针从线粒体上脱落，迁移到RNA。

本发明具有以下优点：

本发明提供的荧光探针具有低生物毒性、膜通透性好、合成方法简单、纯化步骤简便的特点，该探针成功应用于细胞成像，可以分辨线粒体膜电位的变化。

附图说明

图1为荧光探针BJI的¹H NMR谱；

图2为荧光探针BJI的¹³C NMR谱；

图3为探针BJI用CCCP处理的膜电位降低活细胞的荧光图片；

图4为探针BJI的选择性光谱测试图谱；

图5为探针BJI与探针MTDR的共定位荧光图像活细胞成像图片；

图6为探针BJI细胞毒性测试结果；

图7荧光探针BJI对固定细胞的荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）1,2-二甲基-喹啉碘盐（化合物1）的合成：

向圆底烧瓶中加入10 mL乙醇，然后加入1.1 mL的2-甲基喹啉，加入0.5 mL的碘甲烷，加热至60℃反应30小时，反应完毕后将反应体系冷却至室温，有固体析出，过滤并使用乙醇洗涤可得到1,2-二甲基-喹啉碘盐（化合物2），产率为92%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.12 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.41 (dd, J = 8.2, 1.6Hz, 1H), 8.24 (ddd, J = 8.8, 7.0, 1.6 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.00(t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.45 (s, 3H), 3.09 (s, 3H)。

（2）4,4’-（哌嗪-1,4-二基）二苯甲醛（化合物2）的合成：

将哌嗪（1.0 g，11.62 mmol）溶解于H₂O（18 mL）和2-甲氧基乙醇（20 mL）中。将混合物加热至回流，然后加入溶于2-甲氧基乙醇（5 mL）的4-氟苯甲醛（0.63 mL，5.81 mmol）的溶液。然后混合物继续回流12小时。冷却至室温后，将混合物倒入H₂O（50 mL）中，得到浅黄色沉淀。将沉淀物过滤并干燥，得到黄色固体2，产率为93%。¹H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ9.74(s, 2H)，7.75 (d, J = 8.9 Hz, 4H)，7.08 (d，J = 8.9 Hz, 4H)，3.61 (s, 8H)。

（3）探针BJI的合成：

向具有5mL乙醇的底部烧瓶中，加入0.5g（1.75mmol）的化合物1和0.26g（0.875mmol）的化合物2。然后将混合物搅拌5分钟，然后加入400μL吡咯烷。将体系在室温下搅拌24小时以完成反应，并沉淀出深褐色固体。通过过滤获得最终产物，并通过在乙醇中重结晶来纯化，产率为56％。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.90 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 8.52 (dd, J =26.5, 9.0 Hz, 4H), 8.27 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 8.11 (s, 2H), 7.88 (d, J = 7.4Hz, 6H), 7.69 (d, J = 15.5 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.50 (s, 6H),3.65 (s, 8H). ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆) δ (ppm): 164.64, 147.88, 144.19,143.14, 129.44, 124.63, 123.24, 116.96, 114.20, 112.13, 106.39, 51.28, 45.67,27.29, 13.82, 8.83。¹H NMR和¹³C NMR谱图如图1和图2所示。

实施例2 荧光探针对不同膜电位的响应

将密度为3 × 10⁵ 个/mL的HeLa细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）培养12小时以上使细胞贴壁。然后配制浓度为1 mM的实施例1中获得的探针HJI的DMSO溶液为母液，向细胞培养皿中加入母液，使其终浓度均为5 μM，继续培养20 min，然后将细胞培养液吸走，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，加入1 mL新鲜培养基，然后加入10 μM的CCCP（属于氧化磷酸化解偶联剂，能够降低线粒体膜电位）立即进行成像，每隔0.5分钟，记录不同时间下的成像图片。

细胞成像实验中，激发波长为488 nm，检测波段为红光波段550-650 nm。得到荧光图片如图3所示。探针HJI着色高膜电位的健康细胞时染色线粒体，随着膜电位的降低探针从线粒体迁移至核仁区。

实施例3 荧光探针对不同离子的选择性

配置实施案例1中制备的荧光探针的DMSO母液，浓度为5 mM，配制不同氨基酸（Ile、Arg、Ser、Asn、Gln、Glu、His、Ala、Hcy、N-Ace、Val、GSH）及NaCl、KNO₃、H₂O₂的PBS母液，浓度为100 mM。然后分别取5 μL探针母液加入5 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入10μL不同分析物，最后用PBS缓冲溶液定容到5 mL。然后进行荧光检测（激发波长500 nm）。以波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图4。由图可以看出，加入不同分析物后，对探针荧光没有影响。

实施例4 荧光探针与商业探针的共定位

共定位实验中，先用200 nM的MTDR染色细胞30 min，再加入4 μM的BJI染色细胞30min，然后将细胞培养液吸走，用培养基冲洗细胞3次，进行细胞成像：用488 nm为激发波长，收集665-735 nm的荧光来采集BJI的荧光信号；用647 nm为激发波长，收集665-735 nm的荧光来采集MTDR的荧光信号。得到荧光图片如图5所示。两种染料的复染率为89%，说明探针在活细胞中染色线粒体。

实施例5 荧光探针对细胞的毒性

将细胞密度为8000个/mL的HeLa细胞接种到96孔板的部分孔内，剩余孔则用PBS缓冲液填充，按照下述条件在CO₂培养箱中孵育细胞：实验组为用含5 μM的BHI的培养基孵育2小时、24小时和36小时后的细胞样品，对照组为不加染料的含细胞样品，空白组为PBS缓冲液样品。待孵育完成后，用新鲜的培养基换掉细胞培养液，并在每个培养孔中加入10 μL的MTT，再孵育细胞4小时。孵育完成后，移除培养基，每孔加入200 μL的DMSO，并用摇床晃动其10 min以溶解甲瓒。使用酶标仪测试每个孔在570 nm处的吸光度，细胞的存活率（Survivalrate）可通过下述公式计算得到：

其中，A_sample为实验组吸光度，A_c为对照组吸光度，A_b为空白组的吸光度。以探针孵育时间为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图6：染色36 h后细胞存活率仍高达90%，说明探针对活细胞的毒性很低。

实施例6 荧光探针对固定细胞中的成像应用

配制实施例1中制备的荧光探针DMSO母液，浓度为1 mM。再取20 μL用l mL培养基稀释，得终浓度为20 μM的探针稀释液。将接种好的细胞用l mL多聚甲醛处理30 min后用PBS洗3次，然后用0.5 mL 5%的Triton^TM X-100处理3 min，最后在探针稀释液中室温孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像(激发波长488 nm，发射波段550-650 nm)，结果如图7所示：荧光探针BJI能够染色固定细胞的细胞质和核仁，发出红色荧光。