阅读说明：本技术 多肽及其应用和dpp-ⅳ抑制剂或降血糖药物或保健品 (Polypeptide and application thereof, and DPP-IV inhibitor or hypoglycemic drug or health product ) 是由 靳艳 叶明亮 晏嘉泽 于 2018-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抑制二肽基肽酶(DPP-Ⅳ,dipeptidyl peptidaseⅣ)活性及降血糖的一种多肽化合物Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala,它的氨基酸序列为Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala。多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala具有DPP-Ⅳ抑制活性及降血糖活性,作为降血糖以及治疗II型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。(The invention relates to a polypeptide compound Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala for inhibiting the activity of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) and reducing blood sugar, and the amino acid sequence of the polypeptide compound is Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala. The polypeptide Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala has DPP-IV inhibitory activity and hypoglycemic activity, and has good application prospect as a health product and a medicine lead compound for reducing blood sugar and treating type II diabetes.)

多肽及其应用和DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物或保健品

技术领域

本发明涉及多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala在制备抑制二肽基肽酶(DPP-Ⅳ，dipeptidyl peptidaseⅣ)及降血糖药物及保健品中的应用。

背景技术

糖尿病是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的葡萄糖、蛋白质、脂代谢紊乱的综合症。目前,糖尿病已经成为全球性流行病。根据世界卫生组织统计,糖尿病的发病率每年都以一定的幅度在递增。2016年我国糖尿病流行率为9.6％，且随着生活水平的提高，这一数字仍在急剧上升。

二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ，dipeptidyl peptidaseⅣ)是一种丝氨酸蛋白酶，该酶的底物包括N端第二位是脯氨酸或丙氨酸残基的多肽。它能从肽链N端水解两个氨基酸残基，能快速有效降解胰高血糖素样肽1(GLP-1,glucagon-like peptide-1),GLP-1是胰岛素生成和分泌最有效的刺激剂之一,因此抑制DPP-Ⅳ能增强内源性GLP-1的作用,从而提高血液中胰岛素的水平,进而降低并维持糖尿病人的血糖水平(Bioorg Med Chem.2007,15(7):2715-2735)。并且，GLP-1调节胰岛素分泌具有严格的血糖浓度依赖性，只有在高血糖条件下GLP-1才会提高胰岛素的分泌水平，故DPP-Ⅳ抑制剂不存在因服药而引发低血糖的风险(Best Pract Res Clin Endocrinol Metab.2009,23(4):479-86)

发明内容

本发明的目的是提供多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala在抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖中的应用和快速筛选方法；多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala具有DPP-Ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、II型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明以所述多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala为抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖的有效成份。

其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala为DPP-Ⅳ抑制剂及降血糖药物及保健品的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。

具有抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖活性的多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala来源于梅花鹿。由于鹿的蛋白库不够完善，总蛋白数量较少，而牛和鹿的基因同源性超过90％(Sui Z G,Yuan H M,Liang Z,et al.Talanta,2013,107,189-194.)，因此本实验选择牛科(bovine)作为蛋白数据库。多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala来源于牛科(bovine)蛋白库的Alpha globin chain蛋白，含11个氨基酸残基，氨基酸序列为Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala，为单链线性结构，白色粉末状，易溶于水，分子量为1214Da；对DPP-Ⅳ活性具有较好的抑制作用，IC₅₀为108±7μM(n＝3，Mean±SD)。

多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala具备DPP-Ⅳ抑制剂所要求的特征：

DPP-Ⅳ抑制肽由至少应含有一个Pro残基，特别是当N端第二位为Pro残基时DPP-Ⅳ抑制活性尤为明显。多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala含有Pro残基且其位于N端第二位，因此满足这一影响活性的条件。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明首次从鹿茸中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制DPP-Ⅳ的活性，因此作为治疗高血糖、II型糖尿病药物的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。

具体实施方式

实施例1多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala的制备

采用LC-MS/MS与Shotgun蛋白质组学技术相结合的方法。以梅花鹿茸为原料，经酶解蛋白，离心，纯化及LC-MS/MS分析，结合构效关系特征，筛选对DPP-Ⅳ具有抑制作用的肽段。

其具体方法如下：

将新鲜梅花鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入去离子水使鹿茸浓度为33.3g/L，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(W/W)的胰蛋白酶，在40℃下酶解3小时；酶解结束将酶解液过80目筛，残渣同法提取一次。将两次酶解液升温至90℃保温15分钟，分别经8层纱布和200目筛过滤，所得滤液以10000g的速度离心10分钟，收集上清液；上清液经Nanodrop Onec在205nm下测定肽浓度，加水稀释至肽浓度20mg/mL待用；将溶胀后的Sephadex G-25medium填料填装成直径2cm、柱高30cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速3.5mL/min进行洗脱，以床体积的1/20为一个流份，洗脱2个床体积，收集全部40个流份并经Nanodrop Onec在205nm下测定肽浓度。根据肽浓度合并第16至第25个流份，冷冻干燥，得到鹿茸提取物。

将鹿茸提取物用LTQ Orbitrap Velos进行质谱分析：将鹿茸提取物用0.1％(V/V)甲酸水溶液复溶成0.4mg/mL的溶液，进行LC-MS/MS分析。将毛细管的一端拉成内径约为5μm的尖端，通过气压将C18AQ填料压入柱内，填充柱长度约15cm。将毛细管的尖端与质谱相连。所用的流动相A为0.1％(V/V)甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，线性梯度洗脱过程为：0％B(0min)—2％B(2min)—25％B(87min)—35％B(97min)—90％B(99min)—90％B(109min)—2％B(110min)—2％B(120min)。流速60μL/min。

设置离子传输毛细管的温度200℃，电喷雾电压1.8KV，归一化碰撞能量35.0％。均使用数据依赖模式(data-dependent mode)对MS和MS/MS进行图谱采集。质谱扫描条件设定为：从每次m/z＝400～2000的全扫描中选择10个最高丰度离子峰进行MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)设置为：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeatduration)30s，动态排除时间(exclusion duration)90s。利用Xcalibur软件(Version2.2，Thermo)进行系统控制和数据收集。

将采集的*.raw文件数据用Thermo Proteome Discoverer Daemon(v1.4)转换成*.mgf格式，再用Mascot(version 2.3.0，Matrix Science，London，UK)于牛科数据库(bovine，蛋白数目17890，下载自http://www.uniprot.org/),进行检索，检索参数如下：不设置酶切位点、最大漏切数和固定修饰；蛋氨酸残基、脯氨酸残基加15.9949Da的可变修饰；母离子的质量容忍度(peptide tolerance)为20ppm，碎片离子的质量容忍度(fragmentions tolerance)为0.8Da。导出肽段结果时设置score>25,调整显著性差异P使肽段假阳性率(FDR，false discovery rate)控制在1％内。鉴定结果见附表一。结合构效关系进行筛选，获得序列为Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala的多肽。

实施例2多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala的DPP-Ⅳ抑制活性检测

原理

对于N端为X-Pro、X-Ala的肽段，DPP-Ⅳ可将该二肽选择性切除，GLP-1具有X-Ala结构，因此DPP-Ⅳ可导致超过95％的GLP-1发生降解。本方法采用Gly-Pro-p-nitroanilide代替GLP-1作为DPP-Ⅳ的模拟底物，DPP-Ⅳ切下Gly-Pro后，生成的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，由此可计算DPP-Ⅳ的抑制活性。实验方法：

实验所用多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。将多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala溶解于100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，向96孔板加入25μL的Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala溶液和25μL 1.59mM的Gly-pro-p-nitroanilide溶液(用相同缓冲液配置，下同)，混匀，于37℃温育10分钟，再加入50μL 0.01U/mL的DPP-Ⅳ溶液，混匀后于37℃温育60分钟，加入100μL 1M的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0)使反应终止，用酶标仪测定405nm吸光度。Control组用等体积的Tris-HCl缓冲液代替Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala溶液，blank组用等体积的Tris-HCl缓冲液代替Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala溶液和DPP-Ⅳ溶液。

分别配制浓度0.5、0.25、0.1、0.05mM的多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala溶液，按上述方法进行DPP-Ⅳ抑制活性检测，计算Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala抑制率，抑制率计算公式：

其中I％表示抑制率，A_多肽表示Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala吸光度值，A_Control表示阴性对照组吸光度值，A_blank表示空白组吸光度值。结果如表一所示：

表一不同浓度的Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala对DPP-IV的抑制率

由表一可知，多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala对DPP-IV的半数抑制浓度(IC₅₀)为108±7μM(Mean±SD，n＝3)

多肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala具有DPP-Ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、II型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。

附表：

附表一鹿茸提取物经LC-MS/MS鉴定的肽段

以TGTPGLPGPPGPMGPPGDR为例：肽段的修饰种类为Oxidation(M)；3Pro(O)(P)，表明该肽段有1处甲硫氨酸氧化修饰和3处脯氨酸羟基修饰。肽段的修饰位置为0.0002002000001002000.0，表示该肽段的3处脯氨酸羟基修饰位于第4、7、16位残基，甲硫氨酸氧化修饰位于第13位残基。

附表一的序列所涉及的氨基酸均为氨基酸的简写，各氨基酸缩写、简写及名称见附表二。

附表二氨基酸名称、缩写与简写

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 多肽及其应用和DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物或保健品

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala

1 5 10