阅读说明：本技术 用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用 (CD44v3-v10 structural domain specific polypeptide ligand for gastric cancer diagnosis, obtaining method and application ) 是由 张丹 任牡丹 卢桂芳 卢新兰 赵艳 和水祥 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物开发技术领域,具体涉及一种用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用。所述用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,为CV-1多肽：THENWPA。所述CV-1多肽能够特异性结合于CD44的v3-v10变异型外显子编码结构域,并通过该肿瘤标志物结合于人胃癌细胞及组织,该CV-1多肽可用于胃癌的分子影像诊断。(The invention belongs to the technical field of drug development, and particularly relates to a CD44v3-v10 domain specific polypeptide ligand for gastric cancer diagnosis, an obtaining method and application. The amino acid sequence of the CD44v3-v10 structural domain specific polypeptide ligand for gastric cancer diagnosis is shown as SEQ ID NO.1, and is CV-1 polypeptide: THENFPA. The CV-1 polypeptide can be specifically combined with a v3-v10 variant exon coding structure domain of CD44, and is combined with human gastric cancer cells and tissues through the tumor marker, and the CV-1 polypeptide can be used for molecular imaging diagnosis of gastric cancer.)

用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方 法及应用

技术领域

本发明属于药物开发技术领域，具体涉及一种用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用。

背景技术

早期诊断是提高胃癌治疗水平、降低疾病复发及致死率的重要手段。现有胃癌检测手法，包括胃镜、消化道造影、血清肿瘤标志物对于早期胃癌缺乏足够的灵敏性及特异性。因而开发经济、便捷、易普及的早期胃癌筛查手段，是许多科学家研究的目标及方向。

传统影像学，包括内镜检查依赖于对病变形态学异常的判断。随着疾病相关分子机制研究的成熟以及各种影像技术的发展，出现了基于疾病特异性分子水平的显像技术。所谓分子影像学，是运用影像学相关手段，显示组织乃至细胞及亚细胞水平的特定分子，反映分子水平的变化，在影像方面对相关分子的生物学行为进行定性和定量研究。其核心技术在于能够结合于病变特殊标志物的分子探针，以及能够检测探针的显像平台。

分子探针一般包括三个要素：可以产生信号被分子影像设备所检测到的基团、可以优化整个分子药代动力学的载体以及可以靶向结合检测目标的亲和配体。目前亲和配体是分子影像技术开发的主要瓶颈。现在已开发的配体主要包括抗体、改良抗体、多肽、适体以及一些其他小分子。其中仅小分子配体广泛应用于临床。但小分子类配体结构简单，假阳性率过高。抗体类探针因高度的特异性，成为目前进入临床试验最多的探针种类，但该类探针制备保存难度大，费用高，免疫原性及毒性均高，一定程度上制约了其使用。多肽配体与抗体拥有相同的分子基础，有高度的多样性，而且低毒低免疫原性、组织穿透力好、易于代谢、价格低廉、易于合成标记，因此也成为探针研究的重要方向。

CD44作为大分子膜蛋白，结构有利于配体在体内与细胞结合，同时还是重要的胃癌肿瘤标记物，其与肿瘤以及胃癌的相关性研究非常成熟。全长CD44包含有10个普通型外显子及9个变异型外显子。普通型CD44仅由普通型外显子构成，记作CD44s，可表达于正常人细胞，完成细胞间与基质连接、促进细胞运动等生理功能(Goodison,S.,V.Urquidi,andD.Tarin,CD44 cell adhesion molecules.Molecular Pathology,1999.52(4):p.189-96)。变异型CD44指具有变异型外显子的CD44分子，写作CD44v，其相对于CD44s,在胃癌中的表达具有更高的特异性。CD44的v3至v10的变异型在胃癌中均有较高的表达率。其表达与胃癌多种临床病理特征、预后及耐药相关。因此CD44v3-v10特异性多肽配体(探针)，在临床中具有优良的应用前景。

现有技术中，CD44多肽配体存在的缺陷是：(1)CD44的天然配体透明质酸及其类似物配体，因其存在其他受体分子如RHAMM、TLR4、ICAM1(Orian-Rousseau,V.and H.Ponta,Perspectives of CD44 targeting therapies.Archives of Toxicology,2015.89(1):p.3-14)，缺乏CD44特异性。(2)CD44v6单克隆抗体配体Bivatuzumab，因良好的敏感性及特异性进入临床试验阶段，但因抗体分子引发的致死性免疫副反应停止应用。(3)由uPA结构设计的CD44多肽配体，目前已进入临床试验阶段，但该探针不结合于CD44变异型外显子编码区，因此肿瘤特异性低。综上，需要开发一种能够特异性结合CD44变异型外显子的、无致死性免疫副反应的多肽配体。

发明内容

为了解决上述技术问题本发明提供了一种用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体，所述用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，为CV-1多肽：THENWPA。

优选的，所述CV-1多肽能够与靶蛋白CD44变异型外显子编码区结合。

本发明的第二个目的是提供一种所述的用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的获得方法，运用改良噬菌体展示技术，进行噬菌体肽库的高通量筛选，获得针对于靶蛋白CD44变异型外显子编码区的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体序列；其中，噬菌体肽库源自Ph.D.^TM-12Phage Display Peptide Library kit。

本发明的第三个目的是提供一种所述的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体在制备胃癌诊断试剂中的应用。

优选的，所述胃癌诊断试剂为分子影像诊断试剂。

本发明的第四个目的是提供一种所述的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体在制备靶向治疗胃癌细胞药物中的应用。

优选的，所述胃癌指的是胃癌细胞SGC-7901、胃癌原位组织、转移***组织、动物胃癌移植瘤模型。

与现有技术相比，本发明提供的一种用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用，至少具有以下有益效果：

1、本发明运用改良噬菌体展示技术，获得针对于靶蛋白的特殊结构域CD44v3-v10特异性多肽配体序列，合成的CD44v3-v10特异性CV-1多肽排除了普通型噬菌体衣壳蛋白CD44的非特异性结合。

2、本发明通过计算CV-1多肽配体亲和力、蛋白水平竞争抑制明确CV-1多肽与胃癌细胞、正常组织水平靶蛋白的亲和作用及特异性。

附图说明

图1是改良噬菌体展示技术筛选过程示意图；

图2是不同多肽噬菌体与靶蛋白的结合力验证试验；

图3是不同多肽配体与靶蛋白在分子水平结合力及特异性验证结果；

图3A是多肽抑制相应噬菌体结合靶蛋白的竞争抑制结果，图3B是多肽与靶蛋白的亲和力验证(图3B中大图)及解离常数计算(图3B中小图)，图3C是抗CD44v3-v10抗体对多肽结合CD44v3-v10的竞争抑制结果，图3D是抗CD44抗体对多肽结合CD44v3-v10的竞争抑制结果；

图4是Western blot验证胃癌细胞SGC-7901、人胚肾细胞HEK-293细胞系中CD44v3-v10的表达；

图5是FITC和DAPI免疫荧光验证多肽配体与细胞的结合的结果；

图5A是FITC标记CV-1多肽结合胃癌细胞SGC-7901结果，图5B是FITC标记CV-1多肽结合人胚肾HEK-293细胞系结果，图5C是FITC标记对照肽结合胃癌细胞SGC-7901结果，图5D是DAPI标记CV-1多肽结合胃癌细胞SGC-7901结果，图5E是DAPI标记CV-1多肽结合人胚肾HEK-293细胞系结果，图5F是DAPI标记对照肽结合胃癌细胞SGC-7901结果；

图6是人胃癌原位组织及转移***组织的染色结果；

图6A-B分别是CV-1多肽对人胃癌原位组织中癌组织和周围非癌组织的染色结果，图6C-D分别是CV-1多肽对转移***组织中癌组织和周围非癌组织的染色结果；

图7是图6中染色结果对应的组化评分统计结果；

图7A是癌组织评分统计结果，图7B非癌组织评分统计结果；

图8是CV-1多肽及对照肽注射后2h动物活体成像结果；

图8A是CV-1多肽，图8B是对照肽。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例1-2基于Ph.D.^TM-12Phage Display Peptide Library kit(NewEngland BioLabs,Beverly,MA,USA)及其操作手册实施。

实施例1用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的筛选

运用改良噬菌体展示技术，进行噬菌体肽库的高通量筛选，获得针对于靶蛋白CD44变异型外显子编码区的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体序列。改良噬菌体展示技术筛选过程如图1所示，具体步骤如下：

(1)重组人CD44s及CD44v3-v10蛋白的固相包被

重组人CD44s(NCBI登录号001001391.1，蛋白序列，由OriGene,Rockville,MD,USA合成，以下简称CD44s蛋白)及CD44v3-v10蛋白(NCBI登录号001001389.1，蛋白序列，由OriGene,Rockville,MD,USA合成)分别稀释于50μl的NaHCO₃缓冲液中，各取100μl溶液包被至酶标板不同的孔中。

(2)第一轮亲和噬菌体筛选

(a)取包被有CD44s蛋白及CD44v3-v10蛋白的酶标板，0.5g/ml BSA封阻，0.1％TBST(1×TBS+Tween-20，Tween-20终浓度0.1ml/100ml)缓冲液洗板6次。

(b)将10μl噬菌体展示12肽库(New England BioLabs,Beverly,MA,USA)使用1×TBS稀释至100μl，加入0.5g/ml BSA，室温孵育1h。

(c)连续将未结合噬菌体的BSA上清加入CD44s包被孔及CD44 v3-v10包被孔，分别室温孵育1h，加入0.1％TBST洗板10次。

(d)在结合有噬菌体的CD44 v3-v10包被孔加入100μl的0.2M、pH2.2甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液，室温孵育10min，洗脱液体后转移至无菌1ml离心管中，加入15μl DNA中和缓冲液，DNA中和缓冲液为1M、pH 9.1Tris-HCl，获得洗脱物，备用。

(e)对洗脱物滴度进行滴定，计算回收率：回收率＝回收噬菌体个数/投入噬菌体个数。

(3)对(2)中(e)筛选所得噬菌体的扩增与纯化

(a)准备对数期宿主菌E.coli ER2738培养液。

(b)将全部洗脱物加入装有20ml菌液的灭菌锥形瓶中，密封后于恒温摇床37℃、225rpm振荡培养4.5h。

(c)将培养物分装至20个1ml离心管中，4℃，10000rpm离心10min，上清液转入新的1ml离心管中，4℃，10000rpm离心10min。

(d)每管沉淀物中加入200μl PEG/NaCl(200g PEG-8000+150g NaCl)，颠倒混匀，4℃过夜。

(e)4℃、10000rpm离心15min，吸取上清液，重复离心一次，吸取残留上清，收集沉淀物备用。

(f)沉淀物中加入1ml 1×TBS，震荡重悬噬菌体沉淀，再将噬菌体悬液4℃、10000rpm离心5min，吸取上清至新的无菌1ml离心管中。

(g)每管加入200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，冰上孵育1h，之后重复步骤(e)去除上清。

(h)加入200μl 1×TBS/0.02％NaN₃(1×TBS+NaN₃，NaN₃终浓度0.02g/100ml)溶液，震荡重悬噬菌体沉淀，4℃、10000rpm离心1min，上清转入新的无菌1ml离心管，是为次级库。

(i)对次级库进行滴定，计算回收率：回收率＝回收噬菌体/投入噬菌体。

(4)第二、三、四轮淘选

第二轮、第三轮重复上述(2)-(3)的筛选过程，但每次使用的是上次筛选所得次级库，第二轮、第三轮的洗脱液也由0.1％TBST更换为0.5％TBST。对筛选获得噬菌体依照上述(3)方法进行扩增、纯化。

第四轮筛选过程重复第三轮，但对洗脱物不再进行扩增。

(5)筛选产物的单克隆化

针对CD44v3-v10的结构域特异性多肽配体筛选过程中，每轮的产出/投入(回收率)上升，代表了阳性噬菌体的富集效应，每轮筛选投入及收获噬菌体数如表1所示。筛选结束后进行单克隆测序分析，20个克隆共获得3条多肽序列。其中CV-1多肽序列重复频率最高，结果参见表2。

表1每轮筛选投入及收获噬菌体数

表2筛选出的氨基酸序列

实施例2噬菌体克隆的结合验证(ELISA初步鉴定噬菌体)

(a)取噬菌体单克隆贮液，以实施例1(3)中描述方法对其进行扩增、纯化、滴定。

(b)将CD44s蛋白与CD44v3-v10蛋白以实施例1描述方法包被酶标板阳性孔，每孔包被量1μg，每组设4个复孔，BSA封阻，同时设仅包被BSA的阴性对照孔。

(c)CD44s、CD44v3-v10与BSA包被孔分别加入待测克隆以及随机阴性对照克隆(urps)，同时设无噬菌体仅含TBS溶剂的空白对照组，37℃孵育1h，TBS常规洗板6次。

(d)先后加入山羊抗M13噬菌体衣壳蛋白多克隆抗体(Santa Cruz,Dallas,USA)、HRP标记兔抗山羊抗体(ZSGB-BIO,Beijing,China)，孵育、洗涤同上一步。

(e)TMB显色试剂盒(Bioss,Beijing,China)常规显色，使用酶标仪在波长450nm处读取吸光度。

(f)计算每个噬菌体选择力值，遵循公式：选择力值＝(OD_1CD44-OD_2CD44)/(OD_1BSA-OD_2BSA)，其中OD_1CD44以及分别表示待测噬菌体与靶蛋白(CD44v3-v10或CD44s)孵育所得OD值，OD_1BSA表示待测噬菌体与BSA蛋白结合OD值，OD_2CD44以及OD_2BSA分别表示无噬菌体时靶蛋白及BSA孔的本底OD值。

实施例3多肽合成，排除噬菌体衣壳蛋白非特异性结合。

参照表2的序列多肽合成仪合成选择每组最佳噬菌体携带多肽CV-1、CV-2、CV-3，同时合成相应随机乱序对照肽WEPANTE(实施例3-7均采用此对照肽)，高分液相色谱纯化，N端作生物素或荧光基团标记。

排除噬菌体衣壳蛋白非特异性结合：1μg/孔CD44v3-v10蛋白包板，分别使用0.01μM,0.1μM,1μM,10μM,100μM,1000μM未标记CV-1多肽做预孵育，后实验组采用CV-1噬菌体，对照组采用空噬菌体孵育，噬菌体浓度10¹⁰/孔，ELISA检测噬菌体结合(参照实施例2)，检测过程设无噬菌体空白对照孔，统计ELISA检测后每孔的OD值，分别计算实验组与对照组噬菌体结合的抑制率，公式如下：抑制率＝100％–100％×(OD₁–OD₀)/(OD₂–OD₀)，OD₁代表使用多肽做预孵育的孔对应OD值，OD₂代表无多肽抑制时噬菌体的ELISA检测值，OD₀代表无噬菌体空白孔的背景OD值。结果如图2所示，图2是待测候选克隆与随机无关克隆(Urps)以及溶剂(TBS)空白对照与BSA、CD44s蛋白、CD44v3-v10蛋白结合的ELISA检测结果。图2结果显示明显抑制表示噬菌体与靶蛋白的结合来自其特异性结合多肽配体而非噬菌体本身。

实施例4蛋白分子水平验证CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的特异性

用0.0781μM，0.156μM，0.313μM，0.625μM，1.25μM，2.5μM，5μM，10μM浓度CV-1多肽分别孵育CD44v3-v10蛋白，使用ELISA法检测每个浓度对应OD值。Scatchard Plot法计算解离常数：结合多肽以净OD值计算，净OD值为每个浓度总OD值减去非特异性结合OD值(即多肽与BSA而非CD44v3-v10蛋白结合OD值)，以净OD值与多肽浓度比值对净OD值线性拟合图，所得斜率负倒数则为解离常数值。

使用抗CD44v3-v10抗体进行对CV-1多肽结合竞争抑制验证。CD44v3-v10蛋白以上述方法包板，后将抗CD44v3-v10抗体(AbD Serotec,Oxford,UK)及抗CD44抗体(SantaCruz,Dallas,USA)分别以0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μM浓度梯度分别孵育。将生物素标记待测多肽及对照肽以10μM浓度加入抗体抑制孔及无抑制孔中。同时设不加多肽的空白对照孔。使用ELISA法检测每个孔对应OD值。抑制率公式如下：抑制率＝100％-100％(抑制组OD值-空白组OD值)/(OD无抑制组-OD空白组)。

图3是不同多肽与靶蛋白在分子水平结合力及特异性验证结果，其中图3A是多肽抑制相应噬菌体结合靶蛋白的竞争抑制结果，图3B是多肽与靶蛋白的亲和力验证及解离常数计算，图3C是抗CD44v3-v10抗体对多肽结合CD44v3-v10的竞争抑制结果，图3D是抗CD44抗体对多肽结合CD44v3-v10的竞争抑制结果。蛋白水平CV-1噬菌体与靶蛋白结合可被CV-1多肽竞争抑制(图3A)，排除噬菌体衣壳蛋白的非特异性结合。Scatchard Plot作图法(图3B)显示解离常数为0.46μM，显示CV-1多肽对靶蛋白亲和力。CV-1多肽与CD44v3-v10的结合可被抗CD44v3-v10抗体(AbD Serotec,Oxford,UK)抑制(图3C)，但不能被抗CD44s抗体抑制(图3D)，表面CV-1仅对CD44v3-v10结构域有特异性，仅结合于变异型CD44而非普通型。因此，CV-1多肽为用于诊断胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体。

实施例5细胞水平验证CD44v3-v10结构域特异性多肽配体的特异性

常规Western blot检测人胃癌SGC-7901以及人胚肾HEK-293细胞中CD44v3-v10以及CD44s的表达，抗体来源同上文所述。

图4是Western blot验证胃癌细胞SGC-7901、人胚肾细胞HEK-293细胞系中CD44v3-v10的表达。图4结果显示CD44v3-v10在胃癌细胞SGC-7901中表达显著，人胚肾细胞HEK-293仅能表达普通型CD44s。

免疫荧光试验：常规细胞爬片，4％多聚甲醛固定，使用FITC标记CV-1多肽以及对照肽(10μM)常温孵育10min，DAPI核染5min。共聚焦显微镜拍照。

图5是免疫荧光验证多肽与细胞的结合的结果，图5A-B分别是FITC标记CV-1多肽结合胃癌细胞SGC-7901、人胚肾HEK-293细胞系结果，图5C是FITC标记对照肽结合胃癌细胞SGC-7901结果，图5D-E分别是DAPI标记CV-1多肽结合胃癌细胞SGC-7901、人胚肾HEK-293细胞系结果，图5F是DAPI标记对照肽结合胃癌细胞SGC-7901结果。图5结果提示CV-1仅结合于表达变异型CD44v3-v10的胃癌细胞，而非CD44s阳性、CD44v3-v10阴性的胚胎来源细胞(HEK-293)，对照肽不结合于细胞。

实施例6组织水平验证CV-1多肽的特异性

胃癌及***组织来源病人均为首诊，手术之前未进行过化疗、放疗及其他肿瘤相关生物治疗。病理诊断经两名以上病理医师确认。在获取患者或其委托人知情同意后，对于手术切除标本以无菌手术刀片取胃癌肿瘤局部约5×5mm全层组织1块，同时旁开肉眼可见癌灶3-5cm处取相应癌旁组织约5×5mm大小1块。切除组织常规固定，石蜡制片。

免疫组化：切片常规脱蜡、水化，使用TE缓冲液(pH 9.0)微波炉内加热行抗原修复，H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性，50g/L FBS封闭。将生物素标记多肽稀释于封闭液中(20μM)，滴加在切片上，37℃孵育30min。后使用HRP标记链霉亲和素，37℃孵育1h。苏木素染核，中性树胶封片。

显微镜下观察切片，统计染色得分，具体方法如下：着色细胞占总细胞比例0％、0％～10％、10％～50％、50％～80％、80％以上分别记0、1、2、3分；着色强度记为1分(浅着色)、2(中等着色)以及3(强着色)；将着色细胞数量比例得分与着色强度得分相乘所得即为染色得分。一个标本中任选5个高倍视野进行统计，最终该标本染色得分为5个分数均值。

图6是人胃癌原位组织及转移***组织的染色结果，图6A-B分别是CV-1多肽对人胃癌原位组织中癌组织和周围非癌组织的染色结果，图6C-D分别是CV-1多肽对转移***组织中癌组织和周围非癌组织的染色结果。图7A是图6中染色结果对应的癌组织组化评分统计结果，图7B是图6中染色结果对应的非癌组织组化评分统计结果，结果显示CV-1多肽结合于人胃癌原位组织及转移***组织，与非癌组织的组化评分具有统计学差异(P＜0.05)。

实施例7活体水平验证CV-1多肽的特异性

建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型：将生长状态良好的SGC-7901制备单细胞悬液；准备6周左右裸鼠10只，以2×10⁶/0.2ml将人胃癌细胞接种于裸鼠左侧腋窝，观察皮下移植瘤生长。

取成瘤成功裸鼠，尾静脉分别注射200μm FITC标记待测CV-1多肽及对照肽，每只100μl。注射后将裸小鼠使用异氟醚麻醉，每60min使用小动物活体成像系统观察移植瘤及全身荧光强度。

观测过程中发现CV-1多肽在注射后2h肿瘤部位荧光信号出现浓聚，注射后4小时经尿液排出，对照肽注射后2小时多肽于膀胱部位浓聚，经尿液排出。整个代谢过程CV-1组及对照肽组未发现裸鼠死亡。图8是CV-1多肽及对照肽注射后2h动物活体成像结果。

综上，本发明通过改良噬菌体展示获得多肽序列CV-1(THENWPA)，可以特异性结合于CD44的v3-v10变异型外显子编码结构域，并通过该肿瘤标志物结合于人胃癌细胞及组织，该CV-1多肽可用于胃癌的分子影像诊断。

需要说明的是本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 用于胃癌诊断的CD44v3-v10结构域特异性多肽配体、获得方法及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr His Glu Asn Trp Pro Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Asp Val Thr Ser Asn Phe Pro

1 5