阅读说明：本技术 一种天然高纯度及高活性saa的制备方法 (Preparation method of natural high-purity and high-activity SAA ) 是由 周立忠 张波 高燕 刘振国 于 2019-11-30 设计创作，主要内容包括：本发明适用于生物检测技术领域,提供了一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法,包括如下步骤：在脱脂剂中加入SAA-HDL3样品,搅拌离心取沉淀物,向沉淀物中加入缓冲液进行溶解,得到溶解液；分离SAA与载脂蛋白后,以SAA制备多抗血清,并检测血清质量。借此,本发明制备的SAA蛋白纯度和活性较高,且制备方法简单,成本低,效率高,能够满足国内企业的大批量生产要求。(The invention is applicable to the technical field of biological detection, and provides a preparation method of natural high-purity and high-activity SAA, which comprises the following steps: adding an SAA-HDL3 sample into a degreasing agent, stirring, centrifuging to obtain a precipitate, and adding a buffer solution into the precipitate for dissolving to obtain a dissolved solution; after the SAA and apolipoprotein are separated, multiple antiserum is prepared by the SAA, and the quality of the serum is detected. Therefore, the SAA protein prepared by the invention has higher purity and activity, and the preparation method is simple, low in cost and high in efficiency, and can meet the requirement of mass production of domestic enterprises.)

一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种急性期蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白。在急性期反应中，SAA在肝脏中由激活的巨噬细胞和成纤维细胞合成，合成后的SAA与高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)和即低密度脂蛋白(VLDL)结合，尤其与高密度脂蛋白3(HDL3)结合。急性期反应是血浆SAA浓度可上升100～1000倍。检测SAA浓度是感染急性疾病早期诊断的敏感指标。

目前SAA的测定方法是免疫测定法，主要是免疫比浊法，在检测中均需要使用保持天然结构的SAA作为免疫原制备多抗血清。

目前SAA的制备方法大多用基因重组的方法，因受结构的影响，由SAA制备的多抗血清不能充分与天然SAA反应，进而影响检测的特异性和灵敏度。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法，其制备的SAA蛋白纯度和活性较高，且制备方法简单，成本低，效率高，能够满足国内企业的大批量生产要求。

为了实现上述目的，本发明提供一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法，包括如下步骤：

步骤一SAA-HDL3的脱脂

在体积浓度为80～100％的脱脂剂中加入SAA-HDL3样品，搅拌30～40min中进行离心，取沉淀物；所述脱脂剂和所述SAA-HDL3样品的体积比为7～10:1；

向上述沉淀物中加入缓冲液进行溶解，得到溶解液。

步骤二分离SAA与载脂蛋白

A1制备抗体亲和柱

使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱，然后将所述Sephrose柱装入层析柱内，用缓冲液进行平衡，得到吸附柱；

A2过柱吸附脂蛋白

向所述溶解液中加入PBS缓冲液，使所述溶解液中SAA-HDL3的质量浓度为10～20mg/mL，然后将所述溶解液过所述吸附柱，吸附载脂蛋白；

A3洗脱收集SAA蛋白

按峰收集SAA蛋白，然后用超滤管在相对离心力为3500～4500g的条件下离心10～20min，浓缩SAA蛋白。

步骤三制备多抗血清

B1向所述SAA蛋白中加入NaCl溶液，然后加入弗氏佐剂混合并乳化，得到免疫原乳剂；

B2将上述免疫原乳剂进行动物免疫，采血后分离血清。

步骤四检测血清质量

检测所述血清的特异性和灵敏度。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述脱脂剂为甲醇、乙醇、***、甲醚、丙酮、甲烷或者氯仿中的任意一种或者几种。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述脱脂剂为乙醇和丙酮的混合物，且所述乙醇和所述丙酮的体积比为1:1。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述步骤一中，搅拌过程中使用的搅拌器为磁力搅拌器，转速为100～150r/min。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述步骤一中，所述缓冲液为Tris或者PB缓冲液，所述缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，所述缓冲液的pH为5～9。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose抗体亲和柱的方法为：

用HCI浸泡并冲洗所述CNBr-Sepharose4B柱15～30min，得到中间产物一；

将所述中间产物一与脂蛋白进行搅拌混匀，搅拌时间为3～5h，搅拌温度为20～30℃，搅拌完成得到中间产物二；

用0.05～0.15mol/L的NaHCO₃缓冲液冲洗所述中间产物二，然后用0.05～0.15mol/L的HCl-甘氨酸缓冲液冲洗所述中间产物二，得到中间产物三；

向所述中间产物三中加入等体积的乙醇胺溶液搅拌混匀，搅拌时间为3～5h，搅拌温度为20～30℃，然后封闭残余活性基团，再用0.05～0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到Sepharose柱。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述乙醇胺溶液的体积浓度为0.5～1.5mol/L。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述中间产物一与脂蛋白的混匀过程中，所述中间产物一中的CNBr-Sepharose4B柱与脂蛋白的质量比为50：1～5。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述步骤三的B1步骤中，所述SAA蛋白的质量浓度为5～10mg/mL，所述NaCl溶液的质量浓度为0.6～1％。

根据本发明的天然高纯度及高活性SAA的制备方法，所述步骤三的B1步骤中，所述SAA蛋白、NaCl溶液、弗氏佐剂的质量比为1:0.9～1：0.9～1。

本发明的目的在于提供一种超前小导管激光定位装置，采用高纯度的天然SAA-HDL3复合物为材料，通过脱脂及蛋白分离等方法，分离出高纯度SAA，经免疫动物，结果良好，制备的抗血清同国外的同类产品性能相当，符合检测的使用要求；本发明操作过程简单，对工作人员的技术要求低，制备效率高；本发明使用的仪器少，使用的试剂为常见试剂，耗材少，制备成本低，适合批量纯化生产。综上所述，本发明的有益效果是：制备的SAA蛋白纯度和活性较高，且制备方法简单，成本低，效率高，能够满足国内企业的大批量生产要求。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种天然高纯度及高活性SAA的制备方法，包括如下步骤：步骤一SAA-HDL3的脱脂

在脱脂剂中加入SAA-HDL3样品，搅拌30～40min中进行离心，取沉淀物；

向上述沉淀物中加入缓冲液进行溶解，得到溶解液。

本发明中，脱脂剂的体积浓度为80～100％，脱脂剂为甲醇、乙醇、***、甲醚、丙酮、甲烷或者氯仿中的任意一种或者几种，例如，脱脂剂可以为甲醇、乙醇或者***，也可以为甲醇和乙醇的混合物，***和甲醚的混合物，亦可以为***、甲醚和丙酮的混合物。本发明中的脱脂剂优选为乙醇和丙酮的混合物，且乙醇和丙酮的体积比为1:1；本发明中，脱脂剂和SAA-HDL3样品的体积比为7～10:1。

本发明中的SAA-HDL3样品选用高纯度的天然SAA-HDL3复合物，制备方法为：

S1向血清中加入大分子化合物和金属离子；混合均匀后进行沉淀反应，反应后进行离心，取一次沉淀；

S2向一次沉淀中加入缓冲液和金属离子进行搅拌溶解，溶解后进行离心，取上清液；

S3向上清液中加入非选择性沉淀剂进行沉淀反应，非选择性沉淀剂的加入量为上清液体积的8～12％，反应后进行离心，取二次沉淀；

向二次沉淀中加入缓冲液，同时加入金属离子进行溶解反应，得到SAA-HDL3。

本发明搅拌过程中使用的搅拌器为磁力搅拌器，转速为100～150r/min，如果速度过快，会导致SAA-HDL3的蛋白活性降低。

上述缓冲液可选用Tris或者PB缓冲液，缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，缓冲液的pH为5～9。缓冲液与上述沉淀物的体积比为0.8～1.3:10。

步骤二分离SAA与载脂蛋白

A1制备抗体亲和柱

使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱，然后将上述Sephrose柱装入层析柱内，用0.01～0.05mol/L的PBS缓冲液进行平衡，得到吸附柱。

本发明中用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱的方法为：用0.001～0.003mol/L的HCI浸泡并冲洗CNBr-Sepharose4B柱15～30min，得到中间产物一；将中间产物一与脂蛋白进行搅拌混匀，搅拌时间为3～5h，搅拌温度为20～30℃，搅拌完成得到中间产物二；用0.05～0.15mol/L的NaHCO₃缓冲液冲洗上述中间产物二，然后用0.05～0.15mol/L的HCl-甘氨酸缓冲液冲洗上述中间产物二，得到中间产物三；向上述中间产物三中加入等体积的乙醇胺溶液搅拌混匀，搅拌时间为3～5h，搅拌温度为20～30℃，然后封闭残余活性基团，再用0.05～0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到Sepharose柱。

上述乙醇胺溶液的体积浓度为0.5～1.5mol/L，Tris-HCl缓冲液的pH为7～8。NaHCO₃缓冲液的pH为8～9，HCl-甘氨酸缓冲液的pH为2～3。

中间产物一与上述脂蛋白的混匀过程中，中间产物一中的CNBr-Sepharose4B柱与脂蛋白的质量比为50：1～5。

A2过柱吸附脂蛋白

向上述溶解液中加入PBS缓冲液，使上述溶解液中SAA-HDL3的质量浓度为10～20mg/mL，然后以0.1～0.5mL/min的流速将上述溶解液过上述吸附柱，吸附载脂蛋白。

本发明中，上述PBS缓冲液的pH为7～8。

A3洗脱收集SAA蛋白

按峰收集SAA蛋白，然后用载留分子量为3000的超滤管，在相对离心力为3500～4500g的条件下离心10～20min，浓缩SAA蛋白。

步骤三制备多抗血清

B1向SAA蛋白中加入NaCl溶液，然后加入弗氏佐剂混合并乳化，得到免疫原乳剂。SAA蛋白的质量浓度为5～10mg/mL，NaCl溶液的质量浓度为0.6～1％，SAA蛋白、NaCl溶液、弗氏佐剂的质量比为1:0.9～1：0.9～1。

B2将上述免疫原乳剂进行动物免疫，采血后分离血清。

本发明中的动物免疫方法为：选择2～3kg的新西兰雄性大白兔，背部两侧皮内注射13～17点，每点0.1mL；每隔14天加强免疫一次，加强免疫的次数为4～5次；当血清双扩散效价≥1：64时，杀兔取血，将血液离心取血清，加入防腐剂后在2～8℃条件下保存。

步骤四检测血清质量

采用免疫双扩散法和间接酶联免疫吸附法检测上述血清的特异性和灵敏度。

为获取最佳实施方式，本发明以上述制备方法制备SAA蛋白，同时以SAA蛋白进行免疫试验，取血清检测特异性和灵敏度，设置如下若干实施例。本发明还以美国Fitzgerald公司的SAA抗体蛋白作为对比例，检测其特异性和灵敏度，美国Fitzgerald公司的SAA抗体的灵敏度为0.53mg/mL。

实施例1

步骤一SAA-HDL3的脱脂

在体积浓度为92％的脱脂剂中加入SAA-HDL3样品，搅拌30～40min中进行离心，取沉淀物；所述脱脂剂和所述SAA-HDL3样品的体积比为7.8:1；

向上述沉淀物中加入缓冲液进行溶解，得到溶解液。

步骤二分离SAA与载脂蛋白

A1制备抗体亲和柱

使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱，然后将所述Sephrose柱装入层析柱内，用缓冲液进行平衡，得到吸附柱；

A2过柱吸附脂蛋白

向所述溶解液中加入PBS缓冲液，使所述溶解液中SAA-HDL3的质量浓度为10～20mg/mL，然后将所述溶解液过所述吸附柱，吸附载脂蛋白；

A3洗脱收集SAA蛋白

按峰收集SAA蛋白，然后用超滤管在相对离心力为3500～4500g的条件下离心10～20min，浓缩SAA蛋白。

步骤三制备多抗血清

B1向所述SAA蛋白中加入NaCl溶液，然后加入弗氏佐剂混合并乳化，得到免疫原乳剂；

B2将上述免疫原乳剂进行动物免疫，采血后分离血清。

步骤四检测血清质量

检测所述血清的特异性和灵敏度。

采用免疫双扩散法检测，与人载脂蛋白A1、A2均无交叉反应。

采用间接酶联免疫吸附试验，灵敏度为0.52mg/mL。

实施例2

步骤一SAA-HDL3的脱脂

在体积浓度为85％的脱脂剂中加入SAA-HDL3样品，搅拌30～40min中进行离心，取沉淀物；所述脱脂剂和所述SAA-HDL3样品的体积比为9.2:1；

向上述沉淀物中加入缓冲液进行溶解，得到溶解液。

步骤二分离SAA与载脂蛋白

A1制备抗体亲和柱

使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱，然后将所述Sephrose柱装入层析柱内，用缓冲液进行平衡，得到吸附柱；

A2过柱吸附脂蛋白

向所述溶解液中加入PBS缓冲液，使所述溶解液中SAA-HDL3的质量浓度为10～20mg/mL，然后将所述溶解液过所述吸附柱，吸附载脂蛋白；

A3洗脱收集SAA蛋白

按峰收集SAA蛋白，然后用超滤管在相对离心力为3500～4500g的条件下离心10～20min，浓缩SAA蛋白。

步骤三制备多抗血清

B1向所述SAA蛋白中加入NaCl溶液，然后加入弗氏佐剂混合并乳化，得到免疫原乳剂；

B2将上述免疫原乳剂进行动物免疫，采血后分离血清。

步骤四检测血清质量

检测所述血清的特异性和灵敏度。

采用免疫双扩散法检测，与人载脂蛋白A1、A2均无交叉反应。

采用间接酶联免疫吸附试验，灵敏度为0.55mg/mL。

实施例3

步骤一SAA-HDL3的脱脂

在体积浓度为95％的脱脂剂中加入SAA-HDL3样品，搅拌30～40min中进行离心，取沉淀物；所述脱脂剂和所述SAA-HDL3样品的体积比为7:1；

向上述沉淀物中加入缓冲液进行溶解，得到溶解液。

步骤二分离SAA与载脂蛋白

A1制备抗体亲和柱

使用CNBr-Sepharose4B柱制备Sepharose柱，然后将所述Sephrose柱装入层析柱内，用缓冲液进行平衡，得到吸附柱；

A2过柱吸附脂蛋白

向所述溶解液中加入PBS缓冲液，使所述溶解液中SAA-HDL3的质量浓度为10～20mg/mL，然后将所述溶解液过所述吸附柱，吸附载脂蛋白；

A3洗脱收集SAA蛋白

按峰收集SAA蛋白，然后用超滤管在相对离心力为3500～4500g的条件下离心10～20min，浓缩SAA蛋白。

步骤三制备多抗血清

B1向所述SAA蛋白中加入NaCl溶液，然后加入弗氏佐剂混合并乳化，得到免疫原乳剂；

B2将上述免疫原乳剂进行动物免疫，采血后分离血清。

步骤四检测血清质量

检测所述血清的特异性和灵敏度。

采用免疫双扩散法检测，与人载脂蛋白A1、A2均无交叉反应。

采用间接酶联免疫吸附试验，灵敏度为0.51mg/mL。

由于各实施例的执行过程均相同，因此，对于其它实施例的执行过程不再赘述，各实施例其它未示出部分的数据见表一。

表一 各实施例的数据

由上述实施例可以看出，以本发明的方法制备SAA蛋白，SAA蛋白的特异性都较好，灵敏度都能够达到0.50mg/mL，说明本发明制备的SAA蛋白的纯度和活性都较高，能够达到美国Fitzgerald公司的SAA抗体蛋白的质量。

综上所述，本发明采用高纯度的天然SAA-HDL3复合物为材料，通过脱脂及蛋白分离等方法，分离出高纯度SAA，经免疫动物，结果良好，制备的抗血清同国外的同类产品性能相当，符合检测的使用要求；本发明操作过程简单，对工作人员的技术要求低，制备效率高；同时，本发明使用的仪器少，使用的试剂为常见试剂，耗材少，制备成本低，适合批量纯化生产。综上所述，本发明的有益效果是：制备的SAA蛋白纯度和活性较高，且制备方法简单，成本低，效率高，能够满足国内企业的大批量生产要求。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。