阅读说明：本技术 一种脂蛋白纯化方法 (lipoprotein purification method ) 是由 李长路 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脂蛋白纯化方法,其特征在于：包括以下步骤：1)在血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液,混匀,2～8℃保存12～24小时后离心；2)取步骤1)中的沉淀,加入沉淀溶解液溶解后离心,取上清,得到低密度脂蛋白；3)取步骤1)中的上清,加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液,混匀,2～8℃保存2～5小时后离心,取沉淀；4)取步骤3)中的沉淀,加入沉淀溶解液溶解后离心,取上清,得到高密度脂蛋白；其中,沉淀溶解液中含有：三氨基甲烷、草酸钾、十二烷基琥珀酸、脱氧胆酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚。可以简单、高效地提取血清中的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。(the invention discloses a lipoprotein purification method, which is characterized by comprising the following steps: the method comprises the following steps: 1) adding a dextran sulfate solution and a calcium chloride solution into serum, uniformly mixing, storing at 2-8 ℃ for 12-24 hours, and centrifuging; 2) taking the precipitate in the step 1), adding a precipitate dissolving solution for dissolving, centrifuging, and taking the supernatant to obtain low-density lipoprotein; 3) taking the supernatant obtained in the step 1), adding a dextran sulfate solution and a calcium chloride solution, uniformly mixing, storing at the temperature of 2-8 ℃ for 2-5 hours, centrifuging, and taking a precipitate; 4) taking the precipitate in the step 3), adding a precipitate dissolving solution for dissolving, centrifuging, and taking the supernatant to obtain high-density lipoprotein; wherein the precipitation dissolving solution contains: triaminomethane, potassium oxalate, dodecyl succinic acid, sodium deoxycholate and nonylphenol polyoxyethylene ether. Can simply and efficiently extract low-density lipoprotein and high-density lipoprotein in serum.)

一种脂蛋白纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脂蛋白纯化方法。

背景技术

脂蛋白是由脂质和蛋白质组成的复合物。在脂蛋白内的脂质与蛋白质之间没有共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组份之间以疏水键相互作用而结合在一起。血脂不溶于水，必须与载脂蛋白结合形成脂蛋白才能溶于血液，被运输至组织进行代谢。根据脂蛋白颗粒的大小及其密度分类，即根据在特定的盐密度内的漂浮行为，用超速离心技术可把血浆脂蛋白分成四大族：乳糜微粒(chylomicron,CM)：d<0.95g/ml；极低密度脂蛋白(VLDL)： d＝0.95～1.006g/ml；低密度脂蛋白(LDL)：d＝1.006～1.063g/ml；高密度脂蛋白(HDL)： d＝1.063～1.21g/ml。

目前常用的脂蛋白分离纯化方法主要有超速离心法、电泳分离法和沉淀分离法。超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重(密度)的差异，在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。超速离心法是分离纯脂蛋白的有效技术，目前广泛应用于脂蛋白载脂蛋白代谢的研究中。电泳分离法是利用不同脂蛋白因蛋白质含量不同，其荷电量不同，将不同脂蛋白进行分离，并根据血浆脂蛋白的电泳迁移率不同予以判断、确认。沉淀分离法是利用脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子和2价不同金属离子以及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离各种脂蛋白的目的。

但是，现有技术中的纯化方法仍存在耗时较长、成本较高、产量较低的问题，因此，提供一种新的脂蛋白纯化方法是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂蛋白纯化方法，可高效分离低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。

本发明所采取的技术方案是：

一种脂蛋白纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)在血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，2～8℃保存12～24小时后离心；

2)取步骤1)中的沉淀，加入沉淀溶解液溶解后离心，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，2～8℃保存2～

5小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入沉淀溶解液溶解后离心，取上清，得到高密度脂蛋白；

其中，沉淀溶解液中含有：三氨基甲烷、草酸钾、十二烷基琥珀酸、脱氧胆酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚。

进一步地，沉淀溶解液中各成分的浓度为：三氨基甲烷30μmol/L、草酸钾0.06mol/L、十二烷基琥珀酸1g/L、脱氧胆酸钠4g/L和壬基酚聚氧乙烯醚8g/L。

进一步地，硫酸右旋糖酐的质量浓度为4％～6％。

进一步地，氯化钙的浓度为1.5mol/L～2.5mol/L。

进一步地，步骤1)中血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：(5～10)：(20～40)。

进一步地，步骤1)中离心速度为3000～4000转/min，离心时间为20～40min。

进一步地，以步骤1)中血清为1L计，步骤2)中加入的沉淀溶解液为25～35mL；进一步地，步骤2)中离心速度为8000～12000转/min，离心时间为15～25min。

进一步地，步骤3)中上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：(75～85)：(20～40)。

进一步地，步骤3)中离心速度为3500～4500转/min，离心时间为25～35min。

进一步地，以步骤1)中血清为1L计，步骤4)中加入的沉淀溶解液为15～25mL；进一步地，步骤4)中离心速度为12000～15000转/min，离心时间为15～25min。

本发明的有益效果是：

本发明中公开了一种脂蛋白纯化方法，可以简单、高效地提取血清中的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。

附图说明

图1为LDL电泳图谱，其中1-Marker、2-实施例1、3-实施例2、4-实施例3、5-对照例1、6-对照例2、7-对照例3；

图2为HDL电泳图谱，其中1-Marker、2-实施例1、3-实施例2、4-实施例3、5-对照例1、6-对照例2、7-对照例3。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

下述实施例中使用的淀溶解液中各成分的浓度为：三氨基甲烷30μmol/L、草酸钾0.06 mol/L、十二烷基琥珀酸1g/L、脱氧胆酸钠4g/L和壬基酚聚氧乙烯醚8g/L，pH为7.5。

下述实施例中使用的硫酸右旋糖酐的质量浓度为5wt％，氯化钙溶液的浓度为2mol/L。

实施例1

一种脂蛋白纯化方法：

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：5：20，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为3000 转/min，离心时间为40min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入25mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为8000转/min，离心时间为25min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：75：20，2～8℃保存3小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入15mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为12000转/min，离心时间为25min，取上清，得到高密度脂蛋白。

实施例2

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：10：40，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为4000 转/min，离心时间为20min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入25mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为8000转/min，离心时间为15min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：85：40，2～8℃保存5小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入25mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为15000转/min，离心时间为15min，取上清，得到高密度脂蛋白。

实施例3

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：5.3：30，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为3500 转/min，离心时间为30min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入30mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为10000转/min，离心时间为20min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：85：30，2～8℃保存3小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入20mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为15000转/min，离心时间为20min，取上清，得到高密度脂蛋白。

对比例1

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：5.3：30，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为3500 转/min，离心时间为30min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入30mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为10000转/min，离心时间为20min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：85：30，2～8℃保存3小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入20mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为15000转/min，离心时间为20min，取上清，得到高密度脂蛋白。

其中，淀溶解液中各成分的浓度为：三氨基甲烷20μmol/L、草酸钾0.1mol/L、十二烷基琥珀酸1g/L、脱氧胆酸钠4g/L和壬基酚聚氧乙烯醚8g/L，pH为7.5。

对比例2

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：5.3：30，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为3500 转/min，离心时间为30min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入30mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为10000转/min，离心时间为20min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：85：30，2～8℃保存3小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入20mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为15000转/min，离心时间为20min，取上清，得到高密度脂蛋白。

其中，淀溶解液中各成分的浓度为：三氨基甲烷30μmol/L、十二烷基琥珀酸1g/L、脱氧胆酸钠4g/L和壬基酚聚氧乙烯醚8g/L，pH为7.5。

对比例3

1)在牛血清中加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，血清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：5.3：30，2～8℃保存24小时后离心，离心速度为3500 转/min，离心时间为30min；

2)取步骤1)中的沉淀，加入30mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为10000转/min，离心时间为20min，取上清，得到低密度脂蛋白；

3)取步骤1)中的上清，加入硫酸右旋糖酐溶液和氯化钙溶液，混匀，上清、硫酸右旋糖酐溶液、氯化钙溶液的体积比为1000：85：30，2～8℃保存3小时后离心，取沉淀；

4)取步骤3)中的沉淀，加入20mL沉淀溶解液溶解后离心，离心速度为15000转/min，离心时间为20min，取上清，得到高密度脂蛋白。

其中，淀溶解液中各成分的浓度为：三氨基甲烷20μmol/L、草酸钾0.1mol/L。

使用全自动生化分析仪检测上述提取的LDL和HDL的浓度，结果如下表所示：

	实施例1	实施例2	实施例3	对照例1	对照例2	对照例3
							LDL(g/L)	5.7	5.2	6.1	4.8	4.2	4.5
HDL(g/L)	8.5	8.0	8.9	8.0	7.7	8.1

对上述提取的LDL和HDL取样进行了SDS-PAGE检测，LDL电泳图谱如图1所示，提取后LDL经SDS-PAGE检测，基本呈一条致密带，实施例优于对照例。HDL电泳图谱如图2所示，提取后HDL经SDS-PAGE检测，在相应分子量区间出现致密带，杂条带少，实施例优于对照例。