阅读说明：本技术 一种人血载脂蛋白a1制品的制备方法及应用 (Preparation method and application of human apolipoprotein A1 product ) 是由 杨宝田 任海波 门小菲 顾晓平 于 2018-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用,是属于生物制药领域,该制品不仅可以降低血脂,更重要的是能够去除动脉粥样硬化斑块,可用于预防和治疗动脉硬化性心脑血管疾病,是一个世界级重大创新药物,将开创人类治疗以动脉粥样硬化为病理基础的心脑血管疾病新时代,人血载脂蛋白A1制品的制备方法是用适当浓度的硫酸铵溶液将人血浆中的载脂蛋白A1分离出来,获得的载脂蛋白A1组分用草酸钾分段除去右旋糖酐硫酸脂,超滤除去杂质后进行除菌过滤,病毒灭活,分装,冷冻干燥等方法制备而成,具有能综合利用血浆中各种蛋白成分,生产方法具有操作简单,投资较低,获得的制品稳定性和安全性好等优点。(The invention discloses a preparation method and application of a human apolipoprotein A1 product, which belongs to the field of biological pharmacy, can reduce blood fat, more importantly can remove atherosclerotic plaques, can be used for preventing and treating arteriosclerotic cardiovascular and cerebrovascular diseases, is a world-level important innovative medicine, and initiates a new era of human treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases based on atherosclerosis, the preparation method of the human apolipoprotein A1 product is to separate the apolipoprotein A1 in human plasma by using ammonium sulfate solution with proper concentration, the obtained apolipoprotein A1 component is prepared by using potassium oxalate to remove dextran sulfate in sections, and after removing impurities by ultrafiltration, the methods of sterilization filtration, virus inactivation, split charging, freeze drying and the like are carried out, the product can comprehensively utilize various protein components in the plasma, and the production method has simple operation, low investment, good stability and safety of the obtained product and the like.)

一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及人血载脂蛋白A1制品，尤其涉及一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用，属于生物制药领域。

背景技术

以动脉粥样硬化（AS）为病理基础的心脑血管疾病是危害人类健康的重大疾病，占人类病死率40%以上。对于这类疾病，人们无疑会十分重视，医药界投入了大量人力物力，研究其预防和治疗方法。

上个世纪中后期，先后有多类（多种）降脂药（他汀类等）问世，对于缓解此类疾病的危害，发挥了一定的作用。然而，降脂药只能减缓动脉粥样硬化（AS）的发展进程，对于已经形成的动脉粥样硬化斑块，却没有研究出药物加以去除。当血管狭窄使重要脏器出现严重供血不足，甚至危及生命时，往往采取血管支架术或血管架桥术等治疗方法。显而易见，这些治疗方法只能使局部血管的供血得到改善，且易于复发或在其它部位发生狭窄阻塞。

上个世纪70年代以来，生物化学领域对动脉粥样硬化的形成机制进行了深入的研究。大量的研究结果证实，人体内的载脂蛋白A1 能够通过结合外周组织胆固醇，激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）等多种脂质代谢酶及受体识别等作用机制，促进胆固醇（从外周组织）逆运转到肝脏，通过复杂的代谢过程，排出体外。简单的说，大量的研究证实，载脂蛋白A1作为核心活性物质（分子），在体内发挥着抗动脉粥样硬化作用。但将人血载脂蛋白A1制成药物去除动脉粥样硬化斑块，预防和治疗心肌梗塞和脑梗塞等严重心脑血管疾病尚未实现。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用，能够清除动脉粥样硬化斑块，能够消除心肌梗塞和脑梗塞等严重疾病的病理基础。

为解决上述技术问题，本发明方案包括：

一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法，其包括以下步骤：

A、取血浆适量加蒸馏水等量稀释，加枸橼酸钠至0.1%-1％，加氯化钠至0.2%-1.5％，搅匀后加饱和硫酸铵溶液至30%-80％饱和度，再次搅匀后放置令其沉淀完全，用滤布过滤或用续流离心机离心，沉淀移作它用；收集滤液或离心上清液，补加硫酸铵至50%-95%的浓度，沉淀完全后用滤布过滤或续流离心，清液移作他用，收集二次沉淀备用；

B、取步骤A中之二次沉淀加适量水溶解，超滤或透析除去残余硫酸铵，收集超滤液或透析内液，加右旋糖酐硫酸脂至0.2%-0.8％，使右旋糖酐硫酸脂的２价阴离子成0.2Ｍ，搅拌到全溶，放置１６小时以上，离心收集沉淀，上清液移做它用，沉淀用适当浓度草酸盐溶解，过滤或离心除去生成之沉淀，上清液超滤或透析除去草酸盐，用巴士德法病毒灭活，除菌过滤，分装，冷冻干燥制成粉末剂型。

一种将所述人血载脂蛋白A1制品在治疗动脉粥样硬化的应用。

一种将所述人血载脂蛋白A1制品在治疗冠心病的应用。

一种将所述人血载脂蛋白A1制品在治疗脑血栓的应用。

一种将所述人血载脂蛋白A1制品在治疗高脂血症的应用。

本发明提供了一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用，建立了从人血浆中提取载脂蛋白A1的生产方法，并进行了稳定性试验，建立了病毒灭活方法，用上述工艺制备的载脂蛋白A1制品，在实验室用U937细胞做实验，证实该载脂蛋白A1制品能够把将近50％的胆固醇从细胞内运转到细胞外，证明了这种载脂蛋白A1制品具有逆运转胆固醇的活性；本发明制备的人血载脂蛋白A1制品经动物（兔）试验证实，不仅可以显著降低血浆总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，且其高剂量组能够去除动脉硬化斑块72%以上，可见，该制品可用于预防和治疗动脉硬化性心脑血管疾病，将开创人类治疗以动脉粥样硬化为病理基础的心脑血管疾病的新时代。

附图说明

图1为本发明试验例与对比例之主动脉壁直观图；

图2为试验例与对比例之主动脉病理图片。

具体实施方式

本发明提供了一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种人血载脂蛋白A1制品的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一，取血浆适量加蒸馏水等量稀释，加枸橼酸钠至0.1%-1％，加氯化钠至0.2%-1.5％，搅匀后加饱和硫酸铵溶液至30%-80％饱和度，再次搅匀后放置令其沉淀完全，用滤布过滤或用续流离心机离心，沉淀移作它用；收集滤液或离心上清液，补加硫酸铵至50%-95%的浓度，沉淀完全后用滤布过滤或续流离心，清液移作他用，收集二次沉淀备用；

步骤二，取步骤一中之二次沉淀加适量水溶解，超滤或透析除去残余硫酸铵，收集超滤液或透析内液，加右旋糖酐硫酸脂至0.2%-0.8％，使右旋糖酐硫酸脂的２价阴离子成0.2Ｍ，搅拌到全溶，放置１６小时以上，离心收集沉淀，上清液移做它用，沉淀用适当浓度草酸盐溶解，过滤或离心除去生成之沉淀，上清液超滤或透析除去草酸盐，用巴士德法病毒灭活，除菌过滤，分装，冷冻干燥制成粉末剂型。可以将本发明的人血载脂蛋白A1制品应用动脉粥样硬化、冠心病、脑血栓以及高脂血症等疾病的治疗中。

为了更进一步的描述本发明以下列举更为详尽的实施例进行说明。

1.取血浆适量加蒸馏水等量稀释，加枸橼酸钠至0.1%-1％，加氯化钠至0.2%-1.5％，搅匀后加饱和硫酸铵溶液至30%-80％饱和度，再次搅匀后放置令其沉淀完全，用滤布过滤或用续流离心机离心，沉淀移作它用。收集滤液或离心上清液，补加硫酸铵至50%-95%％的浓度，沉淀完全后用滤布过滤或续流离心，清液移作他用，收集二次沉淀备用；

2.取A之二次沉淀加适量水溶解，超滤或透析除去残余硫酸铵，收集超滤液或透析内液，加右旋糖酐硫酸脂至0.2%-0.8％，使其２价阴离子成0.2Ｍ，搅拌到全溶，放置１６小时以上，离心收集沉淀，上清液移做它用，沉淀用适当浓度草酸盐溶解，过滤或离心除去生成之沉淀，上清液超滤或透析除去草酸盐，用巴士德法病毒灭活，除菌过滤，分装，冷冻干燥制成粉末剂型。

本发明所述的人血载脂蛋白A1制品的检定方法：用“免疫扩散法”、“免疫比浊法”“免疫电泳法”和“免疫圆周测定法”等方法检测，载脂蛋白A1达到满意的量和收得率，用上诉方法检测，不得检出载脂蛋白B和低密度脂蛋白。

人血载脂蛋白A1制品用于预防和治疗以动脉粥样硬化为病理基础的心脑血管疾病及高脂血症等。具体用法是人血载脂蛋白A1制品为安瓶或瓶装冷冻干燥粉末，内含蛋白量分别为３０ｍｇ／瓶及６０ｍｇ／瓶两种，用时加适量生理盐水或注射用水稀释，肌肉注射或静脉点滴。用量及用法由医生根据病情而定，一般1次1安瓶，每周2-3次，四周为一疗程，约需治疗3个月，治疗过程中不需要改变饮食习惯，无毒副作用，其具体对比如图1与图2所示，可以显著降低血浆总胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，如表1所示。

表1 人血载脂蛋白A1制品对动脉粥样硬化兔血总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C的影响（mmol/L,X±SD）。

当然，本发明并不限于列举上述实施例，应当说明的是，任何熟悉本领域的技术人员在本说明书的教导下，所做出的所有等同替代、明显变形形式，均落在本说明书的实质范围之内，理应受到本发明的保护。