一种脂蛋白a的纯化方法
阅读说明：本技术 一种脂蛋白a的纯化方法 (Method for purifying lipoprotein a ) 是由 孙臣忠 周军 韩碧芸 王沂 黄任强 于 2021-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明通过在脂蛋白a的初始液,即在含脂蛋白a的水/生理盐水溶液,或在血清/血浆中,加入聚乙二醇(PEG)和达到0.1M以上的氯化钠,将脂蛋白a析出,然后采用低速离心收集沉淀；再将沉淀溶解于水后,收集上清液,纯化后的脂蛋白a就溶解于所述上清液中。通过加入聚乙二醇和氯化钠,将溶液中的脂蛋白a大部分析出,然后采用低速离心法,就可以将固形物聚集并从溶液中分离,获得提纯后的脂蛋白a。本发明的脂蛋白a纯化方法,因为只需要在溶液中加入聚乙二醇和氯化钠,将脂蛋白a析出,再通过低速离心的方法,分离出固形物,就可以获得提纯后的脂蛋白a,故可低成本、高安全、高效率地执行对脂蛋白a的大规模纯化操作。(Adding polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride with the concentration of more than 0.1M into initial liquid of lipoprotein a, namely water/physiological saline solution containing lipoprotein a or serum/plasma, separating out the lipoprotein a, and then collecting precipitates by low-speed centrifugation; and dissolving the precipitate in water, collecting the supernatant, and dissolving the purified lipoprotein a in the supernatant. Adding polyethylene glycol and sodium chloride to separate out most of lipoprotein a in the solution, and then adopting a low-speed centrifugation method to aggregate solids and separate the solids from the solution to obtain purified lipoprotein a. According to the method for purifying the lipoprotein a, the purified lipoprotein a can be obtained only by adding polyethylene glycol and sodium chloride into the solution to separate out the lipoprotein a and separating out solid matters by a low-speed centrifugation method, so that large-scale purification operation of the lipoprotein a can be performed with low cost, high safety and high efficiency.)
技术领域
本发明属于生物分离技术领域，具体涉及一种脂蛋白a的纯化方法。
背景技术
脂蛋白（lipoproteins）是由脂质和蛋白质组成的复合物，包括由脂类组成的疏水性内核，和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳，形成球状微粒, 在血液中转运脂类。在运载脂类时，脂类与脂蛋白的蛋白质外壳之间并非共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组份之间以疏水键相互作用而结合在一起。
根据脂蛋白颗粒的大小及其密度分类，即根据在特定的盐密度内的漂浮行为，用超速离心技术可把血浆脂蛋白分成四大族：乳糜微粒（chylomicron，CM）：d<0.95g/ml；极低密度脂蛋白（very low density lipoproteins, VLDL）：d＝0.95～1.006g/ml；低密度脂蛋白（low density lipoproteins, LDL）：d＝1.006～1.063g/ml；高密度脂蛋白（highdensity lipoproteins, HDL0：d＝1.063～1.21g/ml。
目前常用的脂蛋白分离纯化方法主要有超速离心法、电泳分离法和沉淀分离法。超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重（密度）的差异，在超速转动产生的强大离心力作用下，进行分离纯化的一种方法。超速离心法是分离纯脂蛋白的有效技术，目前广泛应用于脂蛋白载脂蛋白代谢的研究中。电泳分离法是利用不同脂蛋白因蛋白质含量不同，其荷电量不同，将不同脂蛋白进行分离，并根据血浆脂蛋白的电泳迁移率不同予以判断、确认。沉淀分离法是利用脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子和2价不同金属离子以及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离各种脂蛋白的目的。
在脂蛋白中，脂蛋白a（Lipoprotein a, Lpa）是很多疾病的一项有意义的指标。Lpa有促进动脉粥样硬化的作用，促进血栓形成，是动脉粥样硬化和血栓形成的独立危险因素[1]。可能的生理作用有参与伤口愈合和组织修复；刺激平滑肌细胞增生；能与部分致病菌结合，这其中也许参与了抗感染的作用[1] [2]。
目前对于Lpa生理功能和病理作用已有了一定的知晓，但距全面了解并作进一步应用还有许多研究要做。很多疾病会显示出各种各样的Lpa的异常表现，在医院检查中，就存在对病人的Lpa测定项目，但因为只是测定，故所提供的疾病相关信息就非常有限。而更多的信息，就需要首先从血浆中提取Lpa并纯化，得到符合要求的纯净的Lpa，才能执行更多的后续研究。
即能否简便地提取和纯化Lpa，是获取更多疾病相关信息的第一步。
其中，Lpa的密度为1.05-1.10g/ml，电泳位置前B，分子量约40-80万，个体间的分子量和含量差异很大，故目前提取Lpa的方法主要是用超速离心（>30000rpm），也有些采用层析等方法[3] [4]。但这些方法均存在设备要求和成本较高，但处理量却较小的问题。而采用低温乙醇法提取Lpa，虽然可以达到较大的提取规模，但却面临有机溶剂也许会影响脂蛋白结构的风险，并且还要控制温度，操作及其不方便。
即在现有技术中，对Lpa的纯化方法仍存在耗时较长、成本较高、产量较低的问题，故提供一种新的Lpa纯化方法是非常有必要的。
因此，现有技术还有待于进一步改进和提高。
参考文献如下：
[1] 姚心琪，张秀兰。脂蛋白a与动脉粥样硬化关系研究[J].中国药物与临床,2017,17(07): 997-999.
[2] 王克勤。《脂蛋白与动脉粥样硬化》.人民卫生出版社. 1995,8.
[3] 高玉敏，赵瑞东，呼和巴特尔。一种从血浆中分离纯化脂蛋白(a)的方法[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版）, 2009, 30(02):1-4.
[4] 王思明，董军，李红霞，牟洪娜，杨睿悦，周伟燕，陈文祥。超速离心-高效液相色谱法测定高、低密度脂蛋白胆固醇的研究——β定量法的改良与验证[J].中华检验医学杂志, 2019(08): 623-628. 。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种脂蛋白a的纯化方法，以解决现有技术的脂蛋白a的纯化方法，由于采用超速离心或层析，导致耗时长、成本高、产量低的技术缺陷。
本发明的技术方案如下：
发明公开了一种脂蛋白a的纯化方法，其中，包括步骤：
a. 提供脂蛋白a初始液；
b. 加入聚乙二醇；
c. 加入氯化钠至第一浓度；
d. 低速离心后收集沉淀；
e. 加水溶解沉淀后，弃去不溶物，收集上清液；
所述步骤b和c不分先后；
所述步骤b至e依次执行至少一次；
所述第一浓度为：溶液中的氯化钠的摩尔浓度0.1M，或质量浓度0.58%以上。
优选地，还包括步骤：
f. 加入聚乙二醇至所述上清液中；
g. 加入氯化钠至第二浓度；
h. 低速离心后收集上层的悬浮物；
所述第二浓度大于所述第一浓度。
更优选地，所述第二浓度为：溶液中的氯化钠的质量浓度8%以上。
优选地，所述脂蛋白a初始液为血浆/血清，或脂蛋白a的纯水/生理盐水溶液。
优选地，所述聚乙二醇加入至质量浓度为至少4%。
更优选地，所述聚乙二醇加入至质量浓度为8%。
优选地，所述步骤d中，所述沉淀通过在4℃静置设定时间后获得。
更优选地，所述设定时间为2天。
优选地，所述低速离心的转速为3000rpm。
更优选地，所述低速离心的时间为50分钟。
有益效果：本发明通过在脂蛋白a的初始液，即在含脂蛋白a的水/生理盐水溶液，或在血清/血浆中，加入聚乙二醇（PEG）和达到0.1M以上的氯化钠，将脂蛋白a聚集并析出，然后采用低速离心收集沉淀，再将沉淀溶解于水后，收集上清液，纯化后的脂蛋白a就溶解于所述上清液中。本发明通过加入聚乙二醇和氯化钠，将水溶液中的脂蛋白a大部分析出，且只需要采用低速离心法，就可将固形物聚集并分离，获得纯化后的脂蛋白a。本发明的脂蛋白a纯化方法，因为只需要在溶液中加入聚乙二醇和氯化钠，将脂蛋白a析出，再通过低速离心的方法，分离出固形物，就可以获得纯化后的脂蛋白a，故可低成本、高安全、高效率地执行对脂蛋白a的大规模纯化操作。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为本发明的脂蛋白a的纯化方法的流程图；
图2为本发明的脂蛋白a的纯化方法的进一步处理流程图；
图3为本发明的脂蛋白a的纯化方法的电泳结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种脂蛋白a（Lpa）的纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种脂蛋白a的纯化方法，其中，含有脂蛋白a的初始液，可以直接是血清或血浆，也可以是经过粗提后的脂蛋白a的纯水/生理盐水溶液。在将脂蛋白a溶解于纯水中加以纯化时，就需要额外补充NaCl，使得溶液中的NaCl质量浓度达到第一浓度，即摩尔浓度为至少0.1M，或质量百分比浓度为0.58%。而当从血清/血浆中直接提取脂蛋白a时，或是从生理盐水溶液中纯化脂蛋白a时，因为血清/血浆/生理盐水中已经有了质量百分比为0.9%的NaCl，已经超过了所述第一浓度，故在提取时，就不需要再额外加入NaCl。
一个优选的实施例中，取1000ml血清，加入40g PEG，优选为粉末（即质量比4%的聚乙二醇），搅拌溶解，固形物（主要是Lpa）开始析出，并且随着PEG加入量的增加，固形物析出量也加快并增多，直至加入80g的PEG，就可将血清中几乎全部Lpa析出。加入PEG后，放4℃冰箱静置沉淀2天，或用离心机以3000rpm离心50min，待几乎全部的Lpa析出，沉淀不再增加，即可弃去第一上清液，将析出的第一沉淀再用100ml生理盐水（0.9%NaCl质量百分比）溶解，离心去除不溶物，获得第二上清液，此时所述第一沉淀就几乎全部溶解在所述第二上清液中，然后再次加入PEG 8g（质量比浓度8%），搅拌溶解后，Lpa再次析出，静置或离心后收集第二沉淀。所述第二沉淀即为脂蛋白a的粗提物。
然后开始执行纯化脂蛋白a的操作。即对获得的第二沉淀执行如附图1的处理：
a. 用100ml纯水或生理盐水溶解所述第二沉淀，离心弃去不溶物，获得第三上清液，作为脂蛋白a初始液；
b. 向所述第三上清液中加入PEG8g，搅拌溶解；
并同时或先后执行：
c. 加入NaCl固体，优选为粉末0.58克，达到第一浓度，并搅拌溶解；若步骤a中加入了生理盐水，则此步可以跳过。
此时可以观察到溶液中有固形物开始析出，所述固形物即为脂蛋白a。
d. 将反应液置于4℃静置设定时间，优选为2天，完成脂蛋白a的全部析出和聚集；或将反应液在3000rpm离心50分钟，获得富含脂蛋白a的沉淀。
e. 加纯水100ml，溶解所述沉淀，过滤后获得的第四上清液，即为纯化后的脂蛋白a的水溶液。
并且，上述步骤b至e，应执行至少一次，更佳地，重复2-3次，以确保脂蛋白a的纯化效果。经过上述步骤的沉淀和过滤分离，可去除Lpa中混杂的大部分低密度脂蛋白杂质，包括乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）。
若需要获得脂蛋白a的固体，则最后一次纯化仅重复上述步骤b、c、d，获得所述脂蛋白a的沉淀即可停止。
考虑到在脂蛋白a的沉淀中，可能混入少许的高密度脂蛋白（HDL），在一个更佳的实施例中，对所述第四上清液还执行如图2的进一步纯化操作：
f. 加入8gPEG（质量浓度8%的聚乙二醇）至所述第四上清液中，搅拌溶解；
g. 加入8g氯化钠固体，优选为粉末，即达到第二浓度（质量浓度8%），搅拌溶解；
此时溶液中开始析出固形物，即Lpa沉淀出来，并因为盐水溶液的浓度增加后密度增大，所述固形物将聚集和上浮，从而与较重的杂质沉淀物，主要是HDL分开。
h. 低速离心（3000rpm，50min）后收集上层的悬浮物。所述悬浮物即为纯化后的脂蛋白a。
获得纯化后的脂蛋白a后，执行电泳鉴定，结果如图3所示。
图中，1和2为Lpa，3为HDL，4为LDL。
由图3可见，1和2的Lpa仅在β稍前位置有一上下宽度较窄的染色较浅条带，表明Lpa达到了较高的纯度，经扫描目标条带中Lpa含量≥95%。Lpa的位置与样品3的HDL的α2位置不同，并且比样品4的LDL的位置稍稍靠前。
实验还使用免疫比浊法检测了各步骤中的Lpa含量。具体如下表所示：
表1. Lpa纯化处理各步骤中的Lpa含量表
可见，Lpa在1升混合血清中含量只有340mg/L，即总量340mg，经过本发明的加入8%的PEG以执行提取后，大部分都集中在第一沉淀中，含量为1901mg/L，而所述第一沉淀的体积为150mL，故经过一次粗提后，在所述第一沉淀中获得285.15mg的Lpa。同时检测了残留在850mL所述第一上清液中的Lpa，仅仅剩下26mg/L，或22.1mg，其余在操作中损失。即所述第一沉淀构成了血清中Lpa的粗提物，且与血清中的初始总量340mg相比，得率为83.9%。
然后在所述第一沉淀中加入100ml生理盐水溶解后，再次加入8%的PEG，执行二次纯化，获得第二沉淀，第二沉淀中的Lpa含量下降至1877mg/L，且所述第二沉淀的体积为140mL，故Lpa的总量为262.78mg，相比于初始总量，得率也降至77.3%，但纯度获得进一步提高。当然，若进行多次纯化，则Lpa的纯度将进一步上升，但含量和得率也会相应下降。
而对所述第二沉淀, 在溶解于100 mL纯水，并按照图2的流程进一步纯化后，获得的悬浮物中，基本排除了HDL。此时，获得悬浮物的体积110 mL，其中Lpa的含量为1566 mg/L，故获得了总量172.26 mg的纯化后的Lpa。总得率为50.7%，纯度则得到进一步提高。
综上所述，本发明通过在脂蛋白a的初始液，即在含脂蛋白a的水/生理盐水溶液，或在血清/血浆中，加入聚乙二醇（PEG）和达到第一浓度0.1M以上的氯化钠，将脂蛋白a聚集并析出，然后采用低速离心收集沉淀，再将沉淀溶解于水后，收集上清液，纯化后的脂蛋白a就溶解于所述上清液中。本发明通过加入聚乙二醇和氯化钠，将水溶液中的脂蛋白a大部分析出，且只需要采用低速离心法，就可将固形物聚集并分离，获得纯化后的脂蛋白a。本发明的脂蛋白a的纯化方法，因为只需要在溶液中加入聚乙二醇和氯化钠，将脂蛋白a析出，再通过低速离心的方法，分离出固形物，就可以获得纯化后的脂蛋白a，故可低成本、高安全、高效率地执行对脂蛋白a的大规模纯化操作。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
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