检测滤泡调节性t细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用
阅读说明：本技术 检测滤泡调节性t细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用 (Application of reagent for detecting follicular regulatory T cells in preparation of diagnostic reagent for prognosis of immunotherapy of allergic rhinitis ) 是由 刘争 姚银 王志超 刘阳 陆翔 王恒 曾明 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测滤泡调节性T细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用,属于变应性鼻炎检测技术领域。具体的,包括如下步骤：1)制备外周血单个核细胞；2)采用流式细胞术检测步骤1)中单个核细胞中滤泡调节性T细胞表达水平。本发明通过检测正常样本和变应性鼻炎患者的外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平,判断变应性鼻炎严重程度,为变应性鼻炎患者的疾病风险及治疗方案提供重要依据；同时,通过监控变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平,以此判断变应性鼻炎免疫治疗预后指标。(The invention discloses an application of a reagent for detecting follicular regulatory T cells in preparation of an allergic rhinitis immunotherapy prognosis diagnosis reagent, and belongs to the technical field of allergic rhinitis detection. Specifically, the method comprises the following steps: 1) preparing peripheral blood mononuclear cells; 2) measuring the expression level of the follicular regulatory T cells in the mononuclear cells of step 1) by flow cytometry. The invention judges the severity of the allergic rhinitis by detecting the level of follicular regulatory T cells in the peripheral blood mononuclear cells of a normal sample and a patient with the allergic rhinitis, and provides an important basis for the disease risk and treatment scheme of the patient with the allergic rhinitis; meanwhile, the level of follicular regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells of a patient with allergic rhinitis before and after receiving immunotherapy is monitored, so that the prognosis index of the allergic rhinitis immunotherapy is judged.)
技术领域
本发明涉及滤泡调节性T细胞作为变应性鼻炎标志物在判断变应性鼻炎患者免疫治疗预后方面的应用，属于变应性鼻炎检测技术领域，具体地涉及一种检测滤泡调节性T细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用。
背景技术
变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是指当机体暴露于变应原后，以IgE介导为主的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，我国大陆地区AR患病率为4～38％。AR的主要症状包括鼻痒，喷嚏，流涕，眼痒和鼻塞等，影响患者的生活、睡眠、工作质量，并造成严重的社会和经济负担。当前对AR的治疗方案包括避免接触变应原、药物治疗、AIT(变应原特异性免疫治疗)和患者教育。与避免接触变应原和药物治疗等暂时缓解症状的方式不同，AIT中的变应原提取物(疫苗)通过反复与患者接触，并逐渐增加剂量，可诱导机体产生免疫耐受，从而控制或减轻过敏症状。然而，AIT也有治疗周期长、花费高、患者依从性差、易引发严重并发症等缺点。更重要的是，相当一部分变应性鼻炎患者对AIT反应不佳，造成了大量的社会医疗资源浪费和个人经济损失。因此，寻找可以监测和预测AIT疗效的生物标记物，探索可以增强AIT疗效的新方法，是变应性鼻炎和AIT研究的重点和难点。
文献《生物标志物在变应性鼻炎特异性免疫治疗疗效评价中的应用》提到目前国内外已发现一些与变应性鼻炎发生和诊治相关的潜在指标，如特异性IgE、白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-5、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞、特异性IgG4和干扰素γ、调节性T细胞、sIgE/tIgE比率等。又如文献《白细胞介素23在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达及意义》中报道了收集12例AR患者(AR组)下鼻甲黏膜及11例单纯性鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜(对照组)，采用免疫组织化学方法和定时定量RT-PCR方法检测下鼻甲黏膜中1L-23的表达。结果表明1L-23p19mRNA在AR组中表达水平较对照组明显提高(P＜0.01)。免疫组织化学显示1L-23蛋白主要表达于黏膜固有层的炎性浸润细胞，AR组鼻黏膜中1L-23阳性细胞数明显高于对照组(P＜0.01)。1L-23p19mRNA和蛋白表达水平与黏膜固有层总炎性细胞浸润程度及固有层胶原纤沉积程度显著正相关(对于mRNA表达水平，相关系数分别为0.678和0.834，对于蛋白表达水平，相关系数分别为0.644和0.721，均P＜0.01)。及文献《高迁移率族蛋白B1在变应性鼻炎中的表达及意义》中描述了收集12例变应性鼻炎患者下鼻甲黏膜及11例单纯性鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜(对照组)，采用免疫组化学和RT-PCR方法检测下鼻甲黏膜中HMGB1的表达，结果表明HMGB1表达水平在变应性鼻炎患者鼻甲黏膜中的表达水平较对照组明显增高(P＜0.01)。免疫组化显示阳性表达主要位于黏膜固有层间质，变应性鼻炎患者鼻甲黏膜中荧光强度明显高于对照组(P＜0.01)，HMGB1mRNA水平(5.0±1.2)与蛋白水平都和鼻甲黏膜中成熟的树突状细胞数目成正相关(r＝0.695和r＝0.578，P＜0.01)，HMGB1蛋白水平与鼻甲黏膜中嗜酸性粒细胞数目(40.0±3.1)成明显负相关(r＝-0.547，P＜0.01)。
寻找新的变应性鼻炎标志物且可以作为临床疗效的特异性评估手段是当前的研究重点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种检测滤泡调节性T细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用。其中，该滤泡调节性T细胞试可作为变应性鼻炎的有效标志物，不仅可以用于判断患病的严重程度，还能为患者的疾病风险及治疗方案提供依据及相关指导。
为实现上述目的，本发明公开了检测滤泡调节性T细胞试剂在制备变应性鼻炎免疫治疗预后诊断试剂中的应用。
进一步地，它包括检测体外正常样本和变应性鼻炎患者的外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平。
进一步地，它还包括监控变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平。
进一步地，通过监控滤泡调节性T细胞表达水平的变化及相关性，与治疗前相比，所述外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞数量增加。
进一步地，变应性鼻炎患者的外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞表达水平与变应性鼻炎严重程度成明显相关性，且相关系数r＝-0.206，这说明变应性鼻炎严重程度与外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞的表达水平密切相关。
进一步地，它包括如下检测步骤：
1)制备外周血单个核细胞；
2)采用流式细胞术检测步骤1)中所述单个核细胞中滤泡调节性T细胞表达水平。
进一步地，步骤1)的具体过程如下：
1.1)取外周血淋巴细胞分离液置于试管底部；
1.2)制备抗凝稀释液：取静脉抗凝血置于另一试管底部，再加入等体积的PBS稀释；
1.3)预混：取步骤1.2)的所述抗凝稀释液缓慢加入步骤1.1)的外周血淋巴细胞分离液中；
1.4)离心处理；
1.5)制备悬浮细胞：取出经步骤1.4)离心处理后所形成溶液的界面白色细胞层，加入PBS稀释后进行悬浮细胞。
进一步地，步骤1.2)中，所述静脉抗凝血为每毫升血加入15～25单位肝素。
进一步地，步骤1.4)中，所述离心处理条件为：室温下，离心速度为1800～2200r/min，离心处理15～25min。
此外，本发明还公开了一种变应性鼻炎预后诊断试剂盒，它包括上述应用。同时，所述诊断试剂盒包含用于检测外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平的物质，如下表中任意一种。即CD3抗体、CD4抗体、CD45RA抗体、CXCR5抗体、CD127抗体及CD25抗体中任意一种或两种及两种以上，且所有的抗体均为荧光标记的抗体。
有益效果：
1、本发明通过检测正常样本和变应性鼻炎患者的外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平，判断变应性鼻炎严重程度，为变应性鼻炎患者的疾病风险及治疗方案提供重要依据。
2、本发明通过监控变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平，以此判断变应性鼻炎免疫治疗预后指标。
3、本发明设计采用外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞作为变应性鼻炎预后诊断试剂，检测过程便捷迅速。
附图说明
图1为滤泡调节性T细胞与变应性鼻炎相关性研究示意图；
图2为滤泡调节性T细胞与变应性鼻炎相关性研究示意图；
图3为变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平研究示意图；
图4为变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平研究示意图。
具体实施方式
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员常理解的相同含义。
术语的定义和使用
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一种或可选项的两种或多种。
术语“标志物”或“生物标志物”是与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一种表型状态(例如患有疾病)的受试者的样品中差别存在的有机生物分子。如果在不同组中生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不同的表型状态中差别存在。
本文所用的术语“样品”是指自受试者分离的类似细胞或组织的收集物，以及在受试者内存在的组织、细胞和流体。术语“样品”包括来自受试者的任何体液(例如血液、淋巴、妇科流体、囊液、尿液、眼泪和通过支气管灌洗和/或腹膜冲洗收集的流体)或细胞。在一个实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一实施方案中，所述或细胞存在于所述受试者内。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。在另一实施方案中，生物学样品可包含来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。
术语“测定”意指包括检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。
术语“监控”意指能实时知晓检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。
术语“试剂盒”是包含特异性检测本发明的标志物的至少一种试剂例如探针、引物或抗体的任何制品(例如包装或容器)，所述制品作为用于进行本发明的方法的一个单位来推销、分配或销售。在某些实施方案中，试剂盒可包括基质，例如包含本发明的一种或多种标志物的捕获试剂和/或与本发明的一种或多种标志物结合的捕获试剂的基质。在一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于使用质谱测定标志物的水平的使用说明书。
受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物，例如牛、鸟、犬、马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非灵长动物)。
实施例1：通过检测滤泡调节性T细胞表达水平，判断患者的变应性鼻炎严重程度
实验对象及材料：
1、实验对象：
变应性鼻炎患者和正常对照组的外周血样本来自武汉市多家市级医院。收集晨空腹抗凝血。
2、实验材料：
1.抗体：如下表1；
表1抗体组成列表
2.其它材料：
(1)FACS buffer：3％小牛血清in PBS；
(2)锥形管(BD Labware)；
(3)PBS；
3.仪器
BD LSRFortessaTMX-20流式细胞仪；
3、具体实验：
(1)收获外周血单细胞悬液。
(2)将细胞转移到50mL锥形管，4℃，300RCF降速离心5min。
(3)弃上清，保留沉淀。
(4)用PBS重悬细胞，冰置5min。
(5)再加入15mL PBS，300RCF，4℃，离心5min。
(6)弃去上清液，加入20mL PBS重悬细胞，细胞计数。
(7)在50uL的细胞悬液中加入5％小牛血清封闭，冰上孵育10min。
(8)用200mL PBS清洗细胞，300RCF，4℃，离心5min。
(9)弃上清，用荧光标记的CD3，CD4，CD45RA，CXCR5，CD127及CD25抗体或isotype各30uL(体积比1：50in FACS buffer)重悬细胞，冰上孵育30min。
(10)用200mL PBS清洗细胞3次，300RCF，4℃，离心5min。
(11)用400uLPBS重悬细胞，用BD LSRFortessaTmX-20流式细胞仪分析所得细胞，滤泡调节性T细胞标记为CD3+CD4+CD45RAlowCXCR5+CD25highCD127low。
4、实验结果：
其中，结合图1、图2可知，变应性鼻炎患者滤泡调节性T细胞水平较正常人显著降低。通过相关性说明，通过检测滤泡调节性T细胞水平，可以判断变应性鼻炎严重程度。
实施例2：通过监控变应性鼻炎患者在接受免疫治疗前后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞表达水平的变化，判断变应性鼻炎免疫治疗预后指标
实验对象及材料：
1、实验对象：
变应性鼻炎患者的外周血样本及同一患者接受免疫治疗后的外周血样本，样本来自武汉市多家市级医院。本申请针对于变应性鼻炎患者的免疫治疗方法为皮下注射。
2、实验材料：
同实施例1。
3、实验方法：
同实施例1。
4、实验结果：
结合图3可知，当变应性鼻炎患者在接受特异性免疫治疗后，滤泡调节性T细胞水平显著增高，结合图4可知，患者的临床评分也显著降低，其与滤泡调节性T细胞明显呈负相关。
实施例3
本申请还公开了一种变应性鼻炎预后诊断试剂，所述诊断试剂包含用于检测外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞水平的物质，它包含用于检测外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞的抗体组合物，所述抗体组合物包括CD3抗体、CD4抗体、CD45RA抗体、CXCR5抗体、CD127抗体及CD25抗体中任意一种或两种及两种以上，且所有的抗体均为荧光标记的抗体。具体如上述表1所示。
因此，本发明设计的诊断试剂盒能有效监测变应性鼻炎患者在预前及预后外周血单个核细胞中滤泡调节性T细胞表达水平，为预测AIT疗效及寻找新的AIT治疗方法提供重要的指导意义。
此外，本发明设计的诊断试剂盒还能与其它检测指标一起协同作用。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。