发明内容

为了解决上述提到的光片荧光显微成像的局限问题，本发明提供一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及其成像方法，通过对样品槽进行特殊设计，常规的透射式显微成像光路即可实现光片成像，光路简单，且能够与多种成像模式相结合，进一步拓展了光片显微成像技术的应用范围。

本发明的一个目的在于提出一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置。

本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包括：激光光源、高斯光扩束准直装置、空间光场调控装置、聚焦透镜、数字扫描装置、4f中继系统、激发物镜、接收物镜、平移台、第一管镜、第一相机、样品架、压电扫描系统、白光照明系统和控制装置；其中，样品架包括平板、通光孔、微棱镜固定装置、微管固定装置、微管和45°微棱镜，平板的中间开设有贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直放置的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x-y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面；在45°微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，样品位于微管内；样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统上；接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装置；激光光源发射出线偏振高斯光束；线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向；聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y-z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x-y平面，直接由竖直放置的接收物镜收集；经第一管镜会聚成像到第一相机上；第一相机直接接收样品的二维图像；同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品位于激发物镜的前焦平面；控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步；压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

高斯光扩束准直装置包括焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激光器出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的直径与空间光调制器的液晶面板相适配。

空间光场调控装置包括二分之一波片、96°棱镜和空间光调制器；其中，二分之一波片对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器的硅基液晶晶体偏振方向相适配；96°棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线偏振光经96°反射棱镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载不同的相位全息图，产生无衍射光束，无衍射光束为贝塞尔(Bessel)光束或者艾利(Airy)光束，调制后的光场再次被96°反射棱镜反射至光路中，入射角与反射角之间的夹角为6°，使得达到空间光调制器最高的调制效率。空间光调制器为纯相位型硅基液晶空间光调制器，液晶分子为平行排列的向列型液晶分子，整体呈现单轴晶体性质。液晶空间光调制器通过调制每一个像元中液晶分子的主轴方向实现像素化的折射率变化的均匀厚度液晶面板。因此，空间光调制器对入射光的偏振态要求很高。且进行全息图加载前，需确定电压占空比与相位调制值之间的关系，即伽马校正。通过对入射光场加载合适的相位全息图，进而得到所期望的出射光场分布。通过盖师贝格-撒克斯通(Gerchberg–Saxton,GS)GS算法完成对拟产生的光场额相位全息图计算，将相位全息图加载到空间光调制器上即产生所期望的光场分布。

数字扫描装置为一维扫描振镜，通过控制装置控制一维扫描振镜的扫描范围、步进距离和采样点数实现对光束的快速扫描，使聚焦到样品的无衍射光束形成光片。

4f中继系统包括焦距相同的两个透镜，将数字扫描装置所在平面与激发物镜后焦平面的光场分布完全一致。

白光照明系统包括LED白光光源、第二管镜和第二相机，其中，LED白光光源照射样品，由激发物镜收集后，经第二管镜成像到第二相机上，观察样品的x-y平面信息，并确定微管中的样品处于激发物镜的前焦平面，即处于贝塞尔光束区。

控制装置为数字采集系统DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置的扫描范围和采样频率；通过输出数字信号触发控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的间隔和触发延时；模拟信号和数字信号同步输出，通过设置每个平面的曝光时间、步进距离和扫描范围，保证数字扫描装置的每一个扫描位置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分辨成像。

本发明的另一个目的在于提出一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像方法。

本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像方法，包括以下步骤：

1)装置安装：

a)将平板的中间开设贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置微管固定装置，通光孔的底部设置竖直放置的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x-y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面，在45°

微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，接收物镜放置在平移台上，完成样品架设置；

b)将样品位于微管内，样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统上；

c)接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装置；

2)激光光源发射出线偏振高斯光束；

3)线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；

4)经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向；

5)聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y-z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；

6)荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x-y平面，直接由竖直放置的接收物镜收集；

7)经第一管镜会聚成像到第一相机上；

8)第一相机直接接收样品的二维图像；

9)同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品位于激发物镜的前焦平面；

10)控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步；

11)压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，

获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

在步骤6)中，调节接收物镜的位置，使接收物镜的中心与45°微棱镜的反射面相对应，样品架设置在压电扫描系统的压电平移台上，压电平移台所在平面为x-y平面，垂直于压电平移台的方向为z方向，微管的长边方向为y方向，短边方向为x方向，具体调节方法如下：

i.样品架位于压电扫描系统的压电平移台上，观测微管的位置，通过压电平移台移动微管的位置，使得微管大致位于激发物镜的中心，在微管中放置荧光微球，打开白光照明系统，调节样品架的z方向，在相机中观察到样品架，调节样品架的x方向位置，直至在第二相机中观察到微管中的样品处于在焦状态，继续调节样品架的x方向位置，能够观察到45°微棱镜、样品和微管的管壁，并在保持y方向不动的前提下，将样品架移动到

样品位于前焦平面的位置；

ii.45°微棱镜和微管的管壁之间的距离在0.1mm～0.5mm，在调节探测物镜时，只小范围微调接收物镜的x方向距离，经过45°微棱镜反射的光的光程大于微管直接透射光的光程，在实际调节时，通过确定45°微棱镜的反射面为焦平面，横向移动探测物镜，不再进行探测物镜轴向位置调节时，均不存在焦图像，且能够在视野中观察到微管的管壁的信息来判断第一相机的探测平面是否为45°微棱镜反射的样品的轴平面信息。

在步骤7)中，调节第一相机的接收平面与入光方向垂直，同时保证入光点位于接收平面的正中间位置。

在步骤9)中，控制装置为数字采集系统DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置的扫描范围和采样频率；通过输出数字信号触发控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的间隔和触发延时；模拟信号和数字信号同步输出，通过设置每个平面的曝光时间、步进距离和扫描范围，保证数字扫描装置的每一个扫描位置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分辨成像。

本发明的优点：

本发明利用45°微棱镜，将通常物镜复杂倾斜放置的光片系统简化为透射式显微成像系统，光路调节简单，能够与多种成像模态相结合；且样品只需注射入微管，或使细胞等生物样品在微管中生长即可，无需对样品进行复杂的处理；且一次即可激发完整的轴平面，能够快速实现轴向特殊分布样品的观测，且装置能够实现对大数值孔径物镜的使用，从而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无法进一步提升的限制；并且，光路设计简单易行，便于实现后续产业化发展。