阅读说明：本技术 混菌发酵法制备紫苏酱的方法 (Method for preparing perilla sauce by mixed fermentation method ) 是由 何腊平 冉渺 李翠芹 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种混菌发酵法制备紫苏酱的方法。本发明利用产纳豆激酶和蛋白酶、β-葡萄糖苷酶的性能优良的贝莱斯芽孢杆菌SN-14和产蛋白酶的雅致放射毛霉生长较快且发酵出来的紫苏酱带有浓郁的酯香味,两者结合在一起,不仅能使紫苏酱产生的纳豆激酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶含量丰富,适度酶解蛋白、纤维等大分子,也会中和掉单一菌种发酵带来的豆粕、紫苏的苦涩味,使最终产品质地营养丰富,不仅能带来新的活性成分,而且能够将紫苏饼粕中特殊的营养成分,活性成分和风味物质较为完整地保留在紫苏酱中,且风味质感俱佳。最终所得到的紫苏酱产品也会比一般传统豆酱类食品的调味,增香方面更胜一筹。(The invention utilizes the belief bacillus SN-14 which produces nattokinase and protease and β -glucosidase and the actinomucor elegans which produces protease and has excellent performance to grow fast, and the fermented perilla sauce has strong ester flavor, and the two are combined together, so that the nattokinase, the protease and the β -glucosidase which are produced by the perilla sauce are rich, macromolecules such as protein, fiber and the like are properly enzymolyzed, the bean pulp and the bitter taste of the perilla brought by the fermentation of a single strain are neutralized, the texture of the final product is rich in nutrition, new active ingredients are brought, special nutritional ingredients in the perilla cake pulp, the active ingredients and flavor substances are completely retained in the perilla sauce, and the flavor and the texture are both good.)

混菌发酵法制备紫苏酱的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，特别涉及混菌发酵法制备紫苏酱的方法。

背景技术

紫苏，古名为荏，系唇形科紫苏属一年生草本植物，亦称苏麻，一直以来都是我国重要且传统的药食同源植物，也是我国***首批公布的60种中特色的兼用型油料作物之一。紫苏全身都是宝，紫苏的叶片和梗中主要含有萜类物质、酚类物质、脂肪酸以及黄酮类物质，而紫苏籽中油脂丰富，油脂含量可高达40％～45％，其脂肪酸中a－亚麻酸含量高达65％，其蛋白质含量在其经过脱脂工序后所形成的紫苏饼粕更增高至35％左右，而且富含花青素、柠檬烯、紫苏酮、紫苏醛等特殊的营养和活性成分的同时。紫苏籽在经过提油工序后主要剩余物就称为紫苏饼粕，目前，提油后所剩余的饼粕除少量被用作面包、挤压蛋白等产品的原料外，大部分的紫苏饼粕只被作为饲料进行低值利用。近年来，虽然国内外相关行业对紫苏系列产品的研究热度不减，但是与之相关的的也单单只是对紫苏饼粕蛋白的粗提取研究，并未更进一步地深入开发与研究。其实，紫苏饼粕营养丰富，除含有较丰富的a－亚麻酸外，还含有较高的粗纤维、粗蛋白，所以发酵制成酱类、调味品也许有独特的口感与气味。不过市场上的不少紫苏饼粕被低价的做饲料了。当前不仅市面上此类紫苏酱产品很少，而且国内外对紫苏酱的研究开发也处于较浅的层面，主要是紫苏饼粕与豆粕、大豆等一起进行单菌发酵，菌种多为米曲霉，毛霉一类，这是由于紫苏饼粕在传统发酵条件下口感较差，不能充分发挥其独特风味，且容易带有焦糊味。另外利用功能菌发酵的很少。所以如何更好地发挥出不掩盖紫苏特有的清香味，又能使其口感变得柔和醇厚丰富，是当前紫苏酱产品开发所普遍存在的问题。

基于现如今所研究开发的紫苏系列产品的发展状况，以及紫苏本身的价值、特性，本项目将产蛋白酶的雅致放射毛霉CICC3118与产纳豆激酶(防治心脑血管疾病的天然良药)和蛋白酶(助消化)的贝莱斯芽孢杆菌SN-14(该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-14，保藏编号：CCTCC M2017134，地址：中国武汉市武汉大学。)混菌发酵按照一定比例混合紫苏饼粕和豆粕原料，生产富含纳豆激酶、蛋白酶且不掩盖紫苏特有的清香味，又能使其口感变得柔和醇厚丰富的紫苏酱。

发明内容

针对现有发明材料的不足，本发明提供了一种混菌发酵法制备紫苏酱的方法，它富含纳豆激酶、蛋白酶且具紫苏特有的清香味，且口感柔和醇厚。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：混菌发酵法制备紫苏酱的方法，包括如下步骤：

(1)原料预处理:将豆粕及苏麻饼粕筛选，磨细，再按一定量混合，向混合物料中加水，料水比不少于1:4的质量比，浸泡静置1h 至原料充分吸收，吸收程度以握之成团，有水析出，松之散开为准，在物料量表面撒物料总质量1-5％的面粉，接着121℃，20min进行高温蒸煮灭菌；

(2)种子液培养：

1)先制备雅致放射毛霉CICC3118的孢子悬液：挑取PDA斜面保存的毛霉菌丝，接种于PDA平板培养基，于28℃培养72h，再以无菌生理盐水将孢子洗下，所得孢子悬液保存于4℃备用；

2)贝莱斯芽孢杆菌SN-14种子液制备：所用的液体种子培养基为10-15g/L葡糖糖，5-10g/L酵母提取物，10-15/L牛肉膏，5-10g/L NaCl，pH 7.4～7.6，用接种环挑选2-5环的本来是有不干净SN-14 菌接种到液体种子培养基中，于37℃，180r/min的条件下培养 16-18h，得贝莱斯芽孢杆菌SN-14种子液；

3)待原料混合物冷却至室温后，将配好的雅致放射毛霉 CICC3118(这个是商业菌株)孢子悬液接入原料内，30℃控温进行摇床培养发酵24h后，再接入贝贝莱斯芽孢杆菌种子液，控温30℃，进行后发酵，保持该温度直至有浓郁香味挥发出；

(4)加盐：按酱质量的1～3％的量加入盐。

所述的豆粕粉与苏麻饼粕按照5.5-6.5：3.5-4.5的质量比进行混合。

雅致放射毛霉CICC3118的孢子悬液与贝莱斯芽孢杆菌SN-14种子液的菌种的体积比2.5-3：1，两种种子液的总接种量为物料总质量的0.4-0.42％。

所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为贝莱斯芽孢杆菌 SN-14，保藏编号：CCTCC M 2017134。申请人以前就该菌株申请过专利，是发明人的实验室筛选的菌株。

本发明同现有技术相比，本发明利用产纳豆激酶和蛋白酶、β- 葡萄糖苷酶的性能优良的贝莱斯芽孢杆菌SN-14和产蛋白酶的雅致放射毛霉生长较快且发酵出来的紫苏酱带有浓郁的酯香味，两者结合在一起，不仅能使紫苏酱产生的纳豆激酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶含量丰富，适度酶解蛋白、纤维等大分子，也会中和掉单一菌种发酵带来的豆粕、紫苏的苦涩味，使最终产品质地营养丰富，不仅能带来新的活性成分，而且能够将紫苏饼粕中特殊的营养成分，活性成分和风味物质较为完整地保留在紫苏酱中，且风味质感俱佳。最终所得到的紫苏酱产品也会比一般传统豆酱类食品的调味，增香方面更胜一筹。同时可实现紫苏籽饼粕的高值化利用。

具体实施方式

实施例：通过量纲分析预测食品货架期的方法，本实施例以西式熏煮火腿为检测示例。

1.1操作要点

(2)操作要点

1)原料预处理:将豆粕，苏麻饼粕筛选，磨细，再按一定量(豆粕粉占总量60％，苏麻饼粕占40％混合，加水(料水比应不少于 1:4)浸泡静置1h至原料充分吸收，吸收程度以握之成团，有水析出，松之散开较为合适，混料装三角瓶装填10-30％容量的后在原料表面撒混料的1％-5％的面粉，接着121℃，20min 进行高温蒸煮灭菌；

2)种子液培养：毛霉的孢子悬液制作如下：挑取PDA斜面保存的毛霉菌丝，接种于PDA平板培养基，于28℃培养72h，再以无菌生理盐水将孢子洗下，所得孢子悬液保存于4℃备用；贝莱斯芽孢杆菌种子液制备：液体种子培养基：10-15g/L葡糖糖，5-10g/L酵母提取物，10-15/L牛肉膏，5-10g/L NaCl，pH 7.4～7.6，用接种环挑选2-5环的本来是有不干净SN-14菌接种到液体种子培养基中，于37℃，180r/min的条件下培养 16-18h，得SN-14种子液。

3)待原料混合物冷却至室温后，将配好的雅致放射毛霉 CICC3118孢子悬液先按一定菌种比列量，接入原料内，30℃控温进行摇床培养发酵24h后，再按一定菌种比例接入贝莱斯芽孢杆菌SN-14，控温，进行后发酵，保持该温度直至有浓郁香味挥发出；

4)加盐：按酱质量的1％～3％量来加盐，也可根据最终实际生产的需要情况确定加盐量

1.2蛋白酶活力测定方法

蛋白酶活力测定采用Folin-酚试剂比色法。

酶活定义：1g样品在40℃和pH7.0的条件下，1min分解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位(U)。

1.3纳豆激酶活力测定方法

活性测定：向试管中加入1.4mL Tris-HCL(50mmol/L,pH7.8)缓冲液和0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL),37℃温育5min后加入 0.1mL凝血酶(20U/mL),在37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL的待测样品，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2mol/L) 溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm 波长处测定吸光度。

酶活定义：每分钟27nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为 1个单位的纤维蛋白降解酶活力。

1.4紫苏酱感官综合品评

综合单一紫苏酱产品相关指标，根据产品的色泽、气味、口感、组织稳定性等方面，以此来制定紫苏酱感官质量评分方法，即以色泽，气味，口感，组织稳定性，将紫苏酱发酵制备完成后，再请5位感官评定员按照表1评分细则对紫苏酱的产品进行感官评定，最后按照该 5位感官评定人员的评分得出最终评价。(具体评分细则见表1)

表1紫苏酱感官评分

案例2

2.1单因素实验结果

2.1.1不同菌种比例对紫苏酱中产生纳豆激酶和蛋白酶酶活值与感官评分的影响

贝莱斯芽孢杆菌SN-14单菌种进行紫苏酱的发酵时存在产生的纳豆激酶，蛋白酶酶活值普遍偏低的缺陷，以及气味过于浓重刺激的不足，而通过与雅致放射毛霉CICC3118进行混菌发酵制酱，不仅大大提高了成品中纳豆激酶，蛋白酶的酶活值，还综合了过于刺激浓重的气味，使之更为柔和，带有清香，从而提高紫苏酱的品质。不同菌中比例对紫苏酱中产生纳豆激酶和蛋白酶酶活值的影响见表2，随着菌种比例的增大，纳豆激酶和蛋白酶的酶活值也逐渐呈增长趋势，但考虑到经过48h时发酵后，从香气，质地，滋味等方面上相比，当菌种比例为3:1时，可以在保留豆粕清香和苏麻饼粕香味，且无不良气味的同时，还有独特的淡淡沁脾酯香，酱香溢出，黏稠适度且纳豆激酶，蛋白酶的酶活值均处于中等偏上，可将3:1作为优选菌种比例并进一步进行发酵研究。故在响应面分析优化实验中，将雅致放射毛霉 CICC3118与贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比列定为2:1、3:1、4:1。

表2不同菌种比例对紫苏酱中纳豆激酶和蛋白酶酶活值的影响

感官评分

在不同的菌种比例下，设立九组进行感官评定。发酵48h后，对最终发酵完成的紫苏酱成品进行感官评价，从色泽、气味、口感和组织形态方面进行评分，得到该紫苏酱的平均色泽值为15；气味值为 13；口感值为15；组织形态值为6.5。1:1组至2:3组紫苏酱不够浓郁，酯香味并没有完全挥发出来，而3:2,3:3组相较于前面几组而言，经过48h后，紫苏酱成品已经有酸味溢出，影响了紫苏酱的口感品质。

2.1.2不同接种量对紫苏酱中产生纳豆激酶和蛋白酶酶活值和感官评分的影响

不同接种量对紫苏酱中产生纳豆激酶和蛋白酶的酶活值的影响见表3。在5组不同的接种量下，当接种量>0.3％时，紫苏酱成品中，产生的纳豆激酶和蛋白酶的酶活值明显大大升高，这是因为随着接种量加大使得紫苏酱成品内的菌种数量增加，对原料中营养物质的利用率也增高，进而使得蛋白酶，纳豆激酶等酶系的分泌增加。除此之外，在5组不同的接种量下，0.2％接种量组以及0.3％接种量组味道清淡，只有微弱的苏麻香味产生，黏稠度较差，流动性较强。而0.35％接种量组，0.4％接种量组味道方面浓郁回甘，酱香，醇香，酯香味更浓，无其他不良气味，独特的苏麻气味与其他组相比溢出更多，黏稠适度，无杂质；但是0.45％接种量组与其他4组相比，味道较重，有淡淡酸味及焦糊味，较冲鼻。经过气味，滋味，质地以及蛋白酶，纳豆激酶酶活值等方面的比较，接种量为0.4％可作为优选，并进行进一步研究优化。故在响应面分析优化实验中，将雅致放射毛霉CICC3118和贝莱斯芽孢杆菌SN-14的接种量定为0.3％、0.4％、0.5％。

表3不同接种量对紫苏酱中纳豆激酶和蛋白酶酶活值的影响

感官评分

在不同的接种量下，设立五组进行感官评定。菌种比例以3:1，发酵48h为主，对最终发酵完成的紫苏酱成品进行感官评价，从色泽、气味、口感和组织形态方面进行评分，得到该紫苏酱的平均色泽值为 16；气味值为14；口感值为15；组织形态值为7.5。其结果表明，在 5组不同的接种量下，0.2％接种量组以及0.3％接种量组味道清淡，只有微弱的苏麻香味产生，黏稠度较差，流动性较强。而0.35％接种量组，0.4％接种量组味道方面浓郁回甘，酱香，醇香，酯香味更浓，无其他不良气味，独特的苏麻气味与其他组相比溢出更多，黏稠适度，无杂质；但是0.45％接种量组与其他4组相比，味道较重，有淡淡酸味及焦糊味，较冲鼻。

2.1.3不同发酵时长对紫苏酱中产生纳豆激酶和蛋白酶酶活值与感官评分的影响

发酵时长是制酱发酵工艺过程中一个重要的影响因素，发酵时长过段时，会导致菌丝不能充分生长，不仅大大影响了紫苏酱的品质及气味，而且也会影响紫苏酱中纳豆激酶，蛋白酶的酶活值；可是若发酵时长过长，发酵过程中则很容易沾染上别的杂菌，这样也会破坏紫苏酱的气味，质地和口感，并且会和优质发酵菌株竞争原料中的营养物质，以至于大大减少了纳豆激酶，蛋白酶的产生，所以，对于发酵时长的把控尤为重要。由表4可见，不同的发酵时长对紫苏酱中纳豆激酶和蛋白酶酶活值的影响则为随着发酵时长增长，所产生的纳豆激酶，蛋白酶的酶活值也渐渐上升。但是经过6组不同的发酵时长，紫苏酱成品在味道上的区别十分明显。36h组的味道太过于清淡，且体态过稀；而40h组与44h组相比，气味有相似之处，色泽均为棕褐色但有光泽，但凑近细闻后会发现40h组的苏麻味更为自然浓郁，酱香，酯香醇厚，无其他不良气味，但发酵时长延长至48h之后，味道加重，可见发酵时长越久(当发酵时长>48h)，味道愈发刺鼻带有酸味，苏麻味被其他类似纳豆不良气味所掩盖。最后再结合蛋白酶，纳豆激酶酶活值等方面，40h的发酵时长可作为紫苏酱发酵的优选项。故在响应面分析优化实验中，可将发酵时长定为36h、40h、44h。

表4不同发酵时长对紫苏酱中纳豆激酶和蛋白酶酶活值的影响

感官评分

在不同的发酵时长下，设立六组进行感官评定。菌种比例以先 3:1，接种量0.4％为主，对最终发酵完成的紫苏酱成品进行感官评价，从色泽、气味、口感和组织形态方面进行评分，得到该紫苏酱的平均色泽值为16；气味值为15；口感值为15；组织形态值为7。在经过 6组不同的发酵时长，紫苏酱成品在味道上的区别十分明显。36h组的味道太过于清淡，且体态过稀；而40h组与44h组相比，气味有相似之处，色泽均为棕褐色但有光泽，但凑近细闻后会发现40h组的苏麻味更为自然浓郁，酱香，酯香醇厚，无其他不良气味，但发酵时长延长至48h之后，味道加重，可见发酵时长越久(当发酵时长>48h)，味道愈发刺鼻带有酸味，苏麻味被其他类似纳豆不良气味所掩盖。案例3响应面优化分析

3.1确定试验点

在单因素试验结果的基础之上，以雅致放射毛霉CICC3118及贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例，接种量，发酵时长3个因素为自变因素，采用响应面法对纳豆激酶含量、蛋白酶含量的最佳提取工艺进行优化，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和数据分析。

3.2响应面试验水平因素与结果

运用根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，通过菌种比例 A、接种量B和发酵时长C进行三因素三水平的响应面分析试验。响应面试验因素水平和结果见表5和表6。

表5响应面试验因素水平及编码

表6响应面试验设计与结果

3.3响应面试验结果及其方差分析

利用Desihn-Expert 8.0.6软件对实验数据进行分析，则得到该二次多项回归方程：

R1＝46.80-1.5A-0.5B+3.5C-1.75AB-0.25AC-1.25BC-8.53A²-6.03B²- 6.03C²

R2＝39.00-1.75A+0.62B+2.88C-0.5AB-1.0AC+1.75BC-4.63A²-3.38 B²-3.87C²

其中，R1,R2分别为纳豆激酶含量，蛋白酶含量；A、B和C 分别对应雅致放射毛霉CICC3118与贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例、接种量(％)和发酵时长(h)的编码。

3.3.4菌种比例、接种量和发酵时长对纳豆激酶含量的影响

F值是用来检验试验中各变量对其响应值影响的显著性的高低，当P值越小，则相应变量的显著程度越高，而失拟项p＞0.05则不显著。由表7方差分析结果可知，模型的F＝100.92，p＜0.0001差异极显著，并且失拟项p＝0.7510>0.05，故说明该模型是显著的。并且雅致放射毛霉CICC3118与贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌落比例和紫苏酱的发酵时长对纳豆激酶的酶活含量的影响为显著(P<0.05)，接种量对纳豆激酶的酶活含量的影响为不显著(P>0.05)。所以，三个因素对纳豆激酶的酶活含量的影响程度应为C>A>B。再者，由于 R²＝0.9924，Adj R²＝0.9825，Pre R²＝0.9618，方差相差很小且接近1，不仅说明拟合程度很好，而且可以用此模型来分析及预测纳豆激酶含量的最优提取工艺。对交互作用来说，只有雅致放射毛霉CICC3118 与贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例和发酵时长的交互作用对纳豆激酶的酶活含量的影响不显著(P>0.05)，但菌种比例和接种量以及接种量和发酵时长的交互作用则对纳豆激酶的酶活含量的影响显著 (P<0.05)。

表7纳豆激酶含量响应面拟合回归方程的方差分析结果

*，差异显著,p<0.05；**,差异极显著，p<0.01；R²＝0.9924,Adj R²＝0.9825,PreR²＝0.9618

3.5菌种比例、接种量和发酵时长对蛋白酶含量的影响

由表8方差分析结果可知，模型中的F＝94.85，p＜0.0001差异极显著，并且失拟项p＝0.7022>0.05，故说明该模型是显著的。雅致放射毛霉CICC3118和贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例和发酵时长对蛋白酶含量的影响显著(P<0.05)，而接种量对蛋白酶含量的影响并不显著(P>0.05)。因此，三个因素对蛋白酶含量影响程度应为C>A>B。由于R²＝0.9919，Adj R²＝0.9814，Pre R²＝0.9553，方差相差很小且接近1，说明拟合程度很好，所以可以用此模型来分析并预测蛋白酶的酶活含量的最优提取工艺。对于交互作用来说，雅致放射毛霉CICC3118和贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例和发酵时长以及接种量和发酵时长交互作用对蛋白酶含量的影响均为显著(P<0.05), 但是菌种比例和接种量交互作用对蛋白酶含量的影响并不显著 (P>0.05)。

表8蛋白酶含量应面拟合回归方程的方差分析结果

*，差异显著,p<0.05；**,差异极显著，p<0.01；R²＝0.9919,Adj R²＝0.9814,PreR²＝0.9553

3.6感官评定

对最终响应面分析优化发酵完成的17组紫苏酱进行感官评价，从色泽、气味、口感和组织形态方面进行评分，得到该紫苏酱的平均色泽值为17；气味值为16.5；口感值为16；组织形态值为7.5。该 17组紫苏酱整体差距较小，色泽鲜亮，口感，滋味，组织形态区别微乎其微，但是成品均紫苏香味浓郁，有沁人心脾的酯香味。

利用Design-Expert 8.0.6软件可以得出在菌种比例、接种量(％) 和发酵时长(h)的共同影响下，可以使紫苏酱中纳豆激酶含量、蛋白酶含量的最优结果为：菌种比例为2.86:1，接种量为0.41％，发酵时长则为41.38h，而在此条件下，模型预测的纳豆激酶含量为 47.2691Fu/g，蛋白酶含量为39.8112u/g。然后对最终发酵完成的紫苏酱进行感官评价，从色泽、气味、口感和组织形态方面进行评分，得到该紫苏酱的平均色泽值为16.3；气味值为16.3；口感值为16.3；组织形态值为7.5。该结果表明本次实验所采用的琯溪蜜柚整体成熟度很高，且色泽、气味和滋味评分也都表现出良好的评分，说明该实验所混菌发酵形成的外观呈均匀棕色且有光泽，表面无黑斑，有紫苏特有的芳香气味和滋味，浓郁回甘，组织虽有部分粗糙，但稳定性良好。总的来说，该批次生产的紫苏酱感官品质良好，能令大部分消费者满意。

本专利所采用雅致放射毛霉CICC3118与贝莱斯芽孢杆菌SN-14 对豆粕、紫苏饼粕进行混菌发酵，以蛋白酶、纳豆激酶的含量为检测指标并辅以感官评价，通过观测这些指标在紫苏酱混菌发酵过程中的含量变化以及感官性状的改变，最终确定了混菌发酵风味紫苏酱的发酵条件与最优配方。其最终结果表明：豆粕，苏麻饼粕在经过混菌发酵后，紫苏酱成品中的蛋白酶、纳豆激酶的含量在不同的菌种比列、接种量、发酵时间下均发生了比较明显的增长趋势，而在雅致放射毛霉CICC3118与贝莱斯芽孢杆菌SN-14的菌种比例为2.86:1，接种量为0.41％,控温发酵，时间为41.38h的条件时，蛋白酶含量达到 39.8112u/g，纳豆激酶含量达到47.2691Fu/g，且按照以上配方进行紫苏饼粕和豆粕混菌发酵生产出来的紫苏酱成品色泽光亮，口感醇厚，说明该响应面方法分析优化混菌发酵风味紫苏酱的配方可行性高。

以上实施方式仅是本发明的具体例子，显然本发明的实现并不受上述方式的限制。只要采用本发明的方法构思和技术方案进行的非实质性改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。