阻断ev71感染的单克隆抗体及其应用
阅读说明：本技术 阻断ev71感染的单克隆抗体及其应用 (Monoclonal antibody for blocking EV71 infection and application thereof ) 是由 张旭媛 叶巍 刘涛 张立国 高光侠 于 2018-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了阻断EV71感染的单克隆抗体及其应用。本发明提供的阻断EV71感染的单克隆抗体为SCARB2的单克隆抗体。通过实验证明：本发明的SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分具有如下特性：A)结合人SCARB2；B)结合细胞膜表面表达的人SCARB2；C)抑制肠道病毒71型感染表达SCARB2的宿主细胞；D)抑制肠道病毒71型在表达SCARB2的宿主细胞中的复制；E)结合人SCARB2蛋白第144-151位和第188-198位所示的氨基酸序列。本发明还提供了包含本发明抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物等衍生物。本发明提供的抗体及衍生物可用于治疗、预防EV71病毒感染引起的疾病。(The invention discloses a monoclonal antibody for blocking EV71 infection and application thereof. The monoclonal antibody for blocking EV71 infection provided by the invention is a monoclonal antibody of SCARB 2. Experiments prove that: the monoclonal antibody of SCARB2 or an antigen-binding portion thereof of the present invention has the following properties: A) binds to human SCARB 2; B) binding to human SCARB2 expressed on the surface of cell membrane; C) inhibiting enterovirus type 71 infection of host cells expressing SCARB 2; D) inhibiting replication of enterovirus type 71 in a host cell expressing SCARB 2; E) binds to the amino acid sequences shown in the 144 th-151 th position and the 188 th-198 th position of the human SCARB2 protein. The invention also provides derivatives such as immunoconjugates, bispecific molecules and pharmaceutical compositions comprising the antibodies of the invention. The antibody and the derivative provided by the invention can be used for treating and preventing diseases caused by EV71 virus infection.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及阻断EV71感染的单克隆抗体及其应用。
背景技术
SCARB2又名溶酶体整合膜蛋白II(LIMP-II)和85KD溶酶体膜唾液酸糖蛋白(LGP85)，与CD36和SCARB1同属于清道夫受体B亚家族。其N末端有一个未切割的信号肽，C末端表达疏水的氨基酸片段，胞内段上含有11个N-糖基化位点，是一个三型跨膜糖蛋白。
SCARB2与许多疾病的发生发展具有密切关系。SCARB2突变是肌阵挛-肾衰综合征(AMRF)的成因，这种单基因遗传病伴随着严重的肌阵挛性癫痫和肾衰竭症状，如不及时治疗往往导致患者迅速死亡。其次，SCARB2是β-葡糖脑苷脂酶(β-GC)的受体，能够介导后者完成从内质网到溶酶体的转移，SCARB2基因缺失的小鼠，其体内β-GC的转运严重受阻，不能有效进入溶酶体中，反而被分泌到细胞外，造成溶酶体贮积症以及帕金森氏症。除此之外，SCARB2还可以作为手足口病主要病原体EV71的功能性受体，介导病毒的进入和脱衣壳。研究发现，SCARB2的α4、α5和α7形成的螺旋束对于该受体结合配体，包括β-GC以及EV71衣壳蛋白，是不可或缺的；并且这个区域也参与了SCARB2形成二聚体，介导脂转运，对于β-GC的转运和EV71的脱衣壳都至关重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明提供的SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分结合人SCARB2蛋白α4、α5和α7形成的螺旋束(该螺旋束区域主要定位在人SCARB2蛋白第138-190位所示的氨基酸序列)，通过直接竞争或改变螺旋束结构，可以抑制或阻断肠道病毒71型(EV71)的感染。
上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分表现如下A)-F)中一种或多种特性：
A)结合人SCARB2；
B)结合细胞膜表面表达的人SCARB2；
C)抑制或阻断肠道病毒71型(EV71)感染表达SCARB2的宿主细胞；
D)抑制肠道病毒71型(EV71)在表达SCARB2的宿主细胞中的复制；
E)结合人SCARB2蛋白第144-151位和第188-198位所示的氨基酸序列；
F)介导SCARB2内吞进入细胞。
所述结合人SCARB2蛋白α4、α5和α7形成的螺旋束体现在结合人SCARB2蛋白第144-151位和第188-198位所示的氨基酸序列。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区的编码基因为小鼠IGKV19-93和IGKJ2基因的产物或来源于该基因；重链可变区的编码基因为小鼠IGHV6-7、IGHD1-2和IGHJ3基因的产物或来源于该基因。
进一步的，所述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区依次包括小鼠IGKV19-93基因全长或部分编码的蛋白或多肽和小鼠IGKJ2基因全长或部分编码的蛋白或多肽；所述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区依次包括小鼠IGHV6-7基因全长或部分编码的蛋白或多肽、小鼠 IGHD1-2基因全长或部分编码的蛋白或多肽和IGHJ3基因的产物或来源于该基因。
更进一步的，所述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区依次包括所述小鼠IGKV19-93基因编码的蛋白和所述小鼠IGKJ2基因编码的蛋白；且其重链可变区依次包括所述小鼠IGHV6-7基因编码的蛋白、小鼠IGHD1-2基因编码的蛋白和所述小鼠IGHJ3基因编码的蛋白。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区包括轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3；所述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区包括重链可变区CDR1、重链可变区CDR2和重链可变区CDR3；
所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列为如下(1)或(2)：
(1)序列3所示的氨基酸序列；
(2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区CDR2的氨基酸序列为如下(3)或(4)：
(3)序列4所示的氨基酸序列；
(4)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区CDR3的氨基酸序列为如下(5)或(6)：
(5)序列5所示的氨基酸序列；
(6)将序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为如下(7)或(8)：
(7)序列8所示的氨基酸序列；
(8)将序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区CDR2的氨基酸序列为如下(9)或(10)：
(9)序列9所示的氨基酸序列；
(10)将序列9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区CDR3的氨基酸序列为如下(11)或(12)：
(11)序列10所示的氨基酸序列；
(12)将序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为a1)或a2)：
a1)序列2所示的氨基酸序列；
a2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为b1)或b2)：
b1)序列7所示的氨基酸序列；
b2)将序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区的编码基因序列为c1)或c2)或c3)：
c1)序列1所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区的cDNA分子或基因组DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的轻链可变区的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区的编码基因序列为d1)或d2)或d3)：
d1)序列6所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区的cDNA分子或基因组DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的重链可变区的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为p1)或p2)：
p1)序列14所示的氨基酸序列；
p2)将序列14所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
所述SCARB2的单克隆抗体的重链的氨基酸序列为q1)或q2)：
q1)序列16所示的氨基酸序列；
q2)将序列16所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列。
上述SCARB2的单克隆抗体中，
所述SCARB2的单克隆抗体的轻链的编码基因序列为m1)或m2)或m3)：
m1)序列13所示的DNA分子；
m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的轻链的cDNA分子或基因组DNA分子；
m3)在严格条件下与m1)或m2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的轻链的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述SCARB2的单克隆抗体的重链的编码基因序列为n1)或n2)或n3)：
n1)序列15所示的DNA分子；
n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的重链的cDNA分子或基因组DNA分子；
n3)在严格条件下与n1)或n2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述SCARB2的单克隆抗体的重链的cDNA分子或基因组DNA分子。
本发明的另一个目的是提供上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的衍生物。
本发明提供的上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的衍生物为如下(e1)-(e6) 中任一种：
(e1)肠道病毒71型(EV71)的拮抗剂，其活性成分为上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分；
(e2)含有上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合物；
(e3)含有上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物；
(e4)将上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分进行修饰和/或改造后得到的抗体；
(e5)将上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分进行人源化后得到的人源化抗体；
(e6)含有上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的多特异性分子。
上述衍生物中，所述组合物可含有与药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包被于一种材料中，以保护该化合物免于可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可包含一种或多种药学上可接受的盐。药学上可接受的盐是指保持了亲代化合物的所需生物活性且不引起任何不想要的毒理学作用的盐(参见如Berge,S.M. 等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由无毒性无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等衍生的盐，以及由无毒性有机酸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等衍生的盐。碱加成盐包括那些由碱土金属如钠、钾、镁、钙等衍生的盐，以及由无毒性有机胺如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的盐。
本发明的药物组合物还可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(DHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种施用途径施用。本领域技术人员应当明白，施用途径和/或方式根据需要的结果而不同。用于本发明抗体的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如注射或输注。
上述衍生物中，所述免疫偶联物是指本发明的SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分与治疗剂如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素偶联得到的偶联物。
上述衍生物中，所述修饰为保守修饰，是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替代、添加和缺失。可以通过本领域公知的技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明的抗体中引入修饰。
上述衍生物中，所述多特异性分子为将本发明的抗体衍生化或连接到一种或一种以上的其他功能性分子上，以生成可与两个或两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子。为了产生本发明的多特异性分子，本发明的抗体可与一种或多种其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，从而得到多特异性分子。
本发明还有一个目的是提供与上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料。
本发明提供的与上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料为下述 A1)-A12)中任一种；
A1)编码上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系。
上述生物材料中，A1)所述的编码上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子为上述SCARB2的单克隆抗体的轻链的编码基因序列和上述SCARB2的单克隆抗体的重链的编码基因序列。
本发明还有一个目的是提供上述SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述衍生物或上述生物材料在如下1)-8)中至少一种的应用：
1)结合人SCARB2；
2)结合细胞膜表面表达的人SCARB2；
3)抑制或阻断肠道病毒71型感染表达SCARB2的宿主细胞；
4)抑制肠道病毒71型在表达SCARB2的宿主细胞中的复制；
5)结合人SCARB2蛋白第144-151位和第188-198位所示的氨基酸序列；
6)介导SCARB2内吞进入细胞；
7)制备抗SCARB2抗体；
8)制备治疗和/或预防肠道病毒71型感染引起的疾病的产品。
上述抗体或应用中，所述结合人SCARB2体现在结合SCARB2单体或SCARB2二聚体或糖基化的SCARB2；
所述宿主细胞具体可为293A-SCARB2细胞(过表达SCARB2的293A细胞)或人横纹肌肉瘤细胞RD。
本发明的最后一个目的是提供一种制备抗SCARB2抗体的方法。
本发明提供的制备抗SCARB2抗体的方法包括如下步骤：
B1)提供：
(i)轻链可变区序列，其含有选自序列3所示的CDR1序列，选自序列4所示的CDR2序列，和选自序列5所示的CDR3序列；
或(ii)重链可变区序列，其含有选自序列8所示的CDR1序列，选自序列9所示的CDR2 序列，和选自序列10所示的CDR3序列；
B2)改变至少一个可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，所述序列选自所述轻链可变区抗体序列和所述重链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列；
B3)将所述改变的抗体序列表达为蛋白质。
本发明的SCARB2的单克隆抗体通过权威的单克隆抗体制备方法(例如，Paterson,H.M.V.a.Y.(Jone Wiley and Sons,Inc.New York,1995).Production ofAntibodies.Current Protocols in Immunology)制备得到。制备杂交瘤优选的动物是小鼠。用小鼠产生杂交瘤是非常完善确立的程序。免疫程序和用于融合的免疫脾细胞的分离技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
除了通过在体内或体外扩增杂交瘤细胞获得抗SCARB2抗体，还可以将本发明的抗体的编码基因利用传统的分子克隆方法克隆到真核表达载体，通过真核表达纯化的方法获得抗体。
本发明提供了一种阻断EV71感染的单克隆抗体及其应用。本发明提供的阻断EV71感染的单克隆抗体为清道夫受体B亚家族成员II SCARB2的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可通过结合SCARB2蛋白α4、α5和α7形成的螺旋束，进而抑制肠道病毒71型(EV71)的感染。通过实验证明本发明的SCARB2的单克隆抗体或其抗原结合部分具有如下特性：A) 结合人SCARB2；B)结合细胞膜表面表达的人SCARB2；C)抑制肠道病毒71型(EV71) 感染表达SCARB2的宿主细胞；D)抑制肠道病毒71型(EV71)在表达SCARB2的宿主细胞中的复制；E)结合人SCARB2蛋白第144-151位和第188-198位所示的氨基酸序列。本发明还提供了包含本发明抗体的免疫偶联物、多特异性分子和药物组合物等衍生物。本发明提供的抗体及衍生物可用于治疗、预防EV71病毒感染引起的疾病。
附图说明
图1显示结合人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2的抗体筛选。
图2显示SCARB2单克隆抗体5C2轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列3)、CDR2区(序列4)和CDR3区(序列5)。
图3显示SCARB2单克隆抗体5C2重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列8)、CDR2区(序列9)和CDR3区(序列10)。
图4显示SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区的氨基酸序列(序列2)与小鼠氨基酸序列(序列11)的对比结果。SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区组成：V基因为 IGKV19-93，J基因为IGKJ2。图中所示为SCARB2单克隆抗体5C2轻链氨基酸序列与其原始VJ基因氨基酸序列的对比结果。
图5显示SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区的氨基酸序列(序列7)与小鼠氨基酸序列(序列12)的对比结果。SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区组成：V基因为IGHV6-7， D基因为IGHD1-2，J基因为IGHJ3。图中所示为SCARB2单克隆抗体5C2重链氨基酸序列与其原始VDJ基因氨基酸序列的对比结果。
图6显示SCARB2单克隆抗体5C2在流式水平上结合细胞膜表面表达的SCARB2。
图7显示SCARB2单克隆抗体5C2在免疫荧光水平上结合细胞膜表面表达的SCARB2。
图8显示SCARB2单克隆抗体5C2在western blot水平上结合SCARB2。
图9显示SCARB2单克隆抗体5C2可以IP出SCARB2的两种形式。
图10显示SCARB2单克隆抗体5C2抗体的结合能力。
图11显示SCARB2单克隆抗体5C2可以介导受体内吞。
图12显示SCARB2单克隆抗体5C2抑制EV71感染过表达SCARB2的细胞系 293A-SCARB2。
图13显示SCARB2单克隆抗体5C2抑制EV71感染宿主细胞RD细胞。
图14显示人和鼠SCARB2的嵌合体示意图。
图15显示SCARB2单克隆抗体5C2在流式水平上结合人SCARB2第144-151位和第188-198位。
图16显示SCARB2单克隆抗体5C2在western blot水平上结合人SCARB2第144-151位和第188-198位。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、抗人SCARB2单克隆抗体的制备
一、人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2抗体的制备
1、人SCARB2抗原的制备
(1)根据人SCARB2序列，设计如下引物：
SCARB2-F：GCTCTAGAATCGATGCCACCATGGGCCGATGCTGCTTCTACACG；
SCARB2-R：CCTTAATTAATTCATCCGCTGTTCCCTCATCCATGGAT。
(2)以离体人pDC(浆细胞样树突状细胞)的cDNA为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2的胞外区、跨膜区和胞内段截至E471之前的片段。
上述PCR反应条件为：预变性，98℃，2分钟；变性，98℃，30秒；退火，60℃，30 秒；延伸，72℃，1.5分钟；共进行30循环，最后增加延伸10分钟。
(3)用限制性内切酶Xba I和Pac I酶切步骤(2)获得的PCR扩增产物和pEGFP-C1载体(Clontech，Cat:#6084-1)，连接，得到pEGFP-human SCARB2E471质粒。在pEGFP-humanSCARB2E471质粒中，SCARB2E471序列下游融合有EGFP基因，当SCARB2E471表达时，可以观察到GFP信号。
(4)将pEGFP-human SCARB2E471质粒使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染进入小鼠L细胞(ATCC，货号：
2、BalB/C小鼠的免疫
以人SCARB2作为免疫原免疫小鼠。具体步骤如下：将5000,000个表达人SCARB2胞外区的小鼠L细胞与20μg CpG1826(TAKARA合成)混合，形成0.5ml的悬液，通过腹腔注射的方式免疫6周龄BalB/C小鼠。每个月免疫一次，共免疫4次。最后，使用同样方法进行加强免疫，并在4天后进行杂交瘤融合。
3、稳定表达人SCARB2的HEK293T细胞系的构建
将pEGFP-human SCARB2E471质粒使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染进入HEK293T细胞系，并通过puromycin筛选获得稳定转染该质粒的细胞(该质粒含有puro抗性基因)，从而使其稳定表达人SCARB2胞外区与跨膜区(SCARB2与GFP融合表达)，得到稳定表达人SCARB2的HEK293T细胞系。该细胞系将用于下述抗体筛选实验。
4、杂交瘤的融合
将免疫后待融合的小鼠处死，并取出脾脏细胞。通过细胞计数，将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0(ATCC，CRL1581)按1:3的比例进行混合，并使用50％PEG(Sigma)融合细胞。将融合后的细胞加入到60ml含1X HAT的RPMI培养基(Cellgro，货号：15-041-CV)(含10％胎牛血清)中，按每孔1～2滴的量加入到96孔细胞培养板中。随后，将杂交瘤细胞在37℃，5％CO2的条件下进行培养，3～4天进行半量换液。约10天后进行抗体筛选。
5、人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2抗体的筛选
筛选前一天，将96孔细胞培养板中的上清吸出约100μl至96孔U形底的培养板中，并在原孔补入100μl新鲜的含1X HAT的RPMI培养基，继续培养细胞。收取已经培养好的稳定表达人SCARB2的HEK293T细胞系，将其加至96孔U形底培养板中，10000个细胞/200μl/ 孔。2200rpm/3分钟离心后，甩出上清，并加入100μl杂交瘤培养上清，重悬后4℃孵育30 分钟。孵育完毕，进行离心并甩出上清，每孔加入200μl FACS buffer(含2％FBS和2mM EDTA 的PBS)，重悬细胞并进行离心，之后甩出上清以达到清洗的目的。每孔加入1:400稀释于FACSbuffer的PE标记的羊抗鼠IgG抗体(Biolegend，Poly4053，405307)，将细胞重悬后在4℃、避光条件下孵育30分钟。孵育后，将培养板进行离心并除去上清，按前述方法清洗细胞一次后加入200μl FACS buffer重悬细胞。最后，使用流式细胞仪Guava(Millipore)分析细胞GFP与PE信号。GFP与PE双阳性孔为SCARB2结合抗体的阳性孔(图1)。
根据上述步骤，最终选择了可以结合膜表面空间构向的SCARB2并且稳定分泌SCARB2 单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株5C2，并将其命名为杂交瘤细胞株5C2。杂交瘤细胞株5C2 分泌的抗体命名为小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2。
将部分小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2送至天津三箭生物技术有限公司进行FITC荧光素标记，并将标记后的抗体命名为小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC。
二、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2的序列
1、RNA的提取
利用Trizol(Invitrogen)裂解杂交瘤细胞株5C2，提取杂交瘤细胞株5C2的RNA。RNA 提取的具体操作步骤如下：
每1ml Trizol加入200μl三氯甲烷，充分震荡后静置10分钟；13000rpm/4℃/15分钟离心；吸取400μl上清加至400μl预冷异丙醇中，混匀后-20℃静置过夜；13000rpm/4℃/15分钟离心；去除上清，加入70％乙醇；13000rpm/4℃/10分钟离心；去除上清，加入70％乙醇；去除上清，加入40μl水溶解，得到RNA溶液。
2、cDNA的获得
将步骤1获得的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录的具体操作步骤如下：吸取16μl步骤1制备的RNA溶液，加入1μl浓度为100nM的Oligo dT(Invitrogen)；70℃反应5分钟；立即放置冰上；分别加入1μl RNA酶抑制剂(Takara)，1μl浓度为10mM的dNTP(Takara)， 1μlMLV反转录酶和5μl 5X缓冲液(Promega)；42℃反应60分钟；80℃处理10分钟。
3、PCR扩增及测序
以步骤2获得的cDNA为模板，分别采用重链引物F和重链引物R、轻链引物F和轻链引物R进行PCR扩增，分别获得编码重链和轻链的片段并对其进行测序。引物序列如下：
轻链引物F：GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA；
轻链引物R：GGATACAGTTGGTGCAGCATC；
重链引物F：SARGTNMAGCTGSAGSAGTC；
重链引物R：CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA；
其中，R＝a,g；Y＝c,t；M＝a,c；K＝g,t；S＝c,g；W＝a,t；V＝a,c,g；N＝a,c,g,t。
上述PCR反应条件：预变性，98℃，2分钟；变性，98℃，30秒；退火，54℃；延伸72℃，1分钟；共35循环，最后增加延伸10分钟。
测序结果如下：
SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区核苷酸和氨基酸序列显示于图2中，SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区核苷酸序列为序列1，SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区氨基酸序列为序列2；将SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区氨基酸序列的第27位-第32位所示的氨基酸序列(序列3)命名为5C2轻链CDR1，将SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区氨基酸序列的第50位-第52位所示的氨基酸序列(序列4)命名为5C2轻链CDR2，将 SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区氨基酸序列的第89位-第96位所示的氨基酸序列(序列5)命名为5C2轻链CDR3。
SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区核苷酸和氨基酸序列显示于图3中，SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区核苷酸序列为序列6，SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区氨基酸序列为序列7；将SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区氨基酸序列的第26位-第33位所示的氨基酸序列(序列8)命名为5C2重链CDR1，将SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区氨基酸序列的第51位-第60位所示的氨基酸序列(序列9)命名为5C2重链CDR2，将 SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区氨基酸序列的第99位-第110位所示的氨基酸序列(序列10)命名为5C2重链CDR3。
4、抗体序列分析
将SCARB2单克隆抗体5C2的核酸片段在抗体序列分析工具igBlast tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)中进行分析发现：SCARB2单克隆抗体5C2轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV19-93基因和IGKJ2基因，SCARB2单克隆抗体5C2的轻链可变区的氨基酸序列(序列2)与小鼠VJ区氨基酸序列(序列11)的对比结果如图4所示；SCARB2单克隆抗体5C2重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV6-7基因、IGHD1-2基因和IGHJ3基因，SCARB2单克隆抗体5C2的重链可变区的氨基酸序列(序列7)与小鼠VDJ区氨基酸序列(序列12)的对比结果如图5所示。
实施例2、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体可以在流式水平上结合膜表面表达的人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2
1、将实施例1步骤一的3中获得的稳定表达人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2的 HEK293T细胞使用含2mM EDTA的PBS溶液(每1L PBS含KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、NaCl 8g、KCl 0.2g、调节pH至7.2～7.4，用水定容至1L)进行处理，使之成为单细胞悬液。2、将稳定表达人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2的单细胞悬液加至96孔U形底培养板中，10000个细胞/200μl/孔。通过2200rpm/3分钟离心后，弃上清，收集沉淀。3、向步骤2 获得的沉淀中分别加入含有5μg/ml的实施例1制备的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2的 FACSbuffer(含2％FBS和2mM EDTA的PBS)，重新悬浮后4℃孵育30分钟。4、孵育完毕，进行离心，弃上清，收集沉淀，每孔加入200μl FACS buffer，重悬细胞并进行离心，弃上清，收集沉淀并进行清洗。5、每孔加入1:400稀释于FACS buffer的PE标记的羊抗鼠IgG 抗体(Biolegend，Poly4053，405307)，将细胞重新悬浮后在4℃、避光条件下孵育30分钟。孵育后，将培养板进行离心并除去上清，按前述方法清洗细胞一次后加入200μl FACS buffer重悬细胞。最后，使用流式细胞仪Guava(Millipore)分析细胞GFP与PE信号。
结果如图6所示。由于SCARB2与GFP融合表达，GFP表达量高的细胞其SCARB2表达量也较高。因此，GFP表达高的细胞结合抗人SCARB2抗体也较多，会结合更多的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体，也就具有更高的PE信号。从图中可以看出：小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2可以结合人SCARB2受体。
实施例3、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体可以在免疫荧光水平上结合膜表面表达的人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2
一、过表达SCARB2的293A细胞系构建
1、pLenti-SCARB2-puro表达质粒的构建
用SpeI-HF与EcoRI-HF两个限制性内切酶酶切pLenti-Puro载体(Addgene Cat:#16578)，得到骨架载体。以pcDNA-SCARB2-wt质粒为模板，采用SCARB2-F-F和SCARB2-F-R引物进行PCR扩增，得到SCARB2片段(GenBank号：NM_005506.3)。连接骨架载体和SCARB2 片段，得到pLenti-SCARB2-puro表达质粒。引物序列如下：
SCARB2-F-F：GACTAGTGCCACCATGGGCCGATGCTGCTTCTA；
SCARB2-F-R：GGAATTCTTAGGTTCGAATGAGGGGTGCT。
2、过表达SCARB2的293A细胞系
将步骤1构建的pLenti-SCARB2-puro表达质粒用磷酸钙转染到293A细胞(ThermoFisher Scientific，Cat:#R70507)中，转染48小时后用致死剂量嘌呤霉素(Applicom，A2856-0010) 杀未被转染的细胞，持续处理一个星期后，用SCARB2的多克隆抗体(R&D，1966-LM-050) 标记细胞，冰上染色30分钟，之后用1ml FACS buffer(含2％FBS和2mM EDTA的PBS) 洗掉一抗，并用1:400稀释于FACS buffer的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend，Poly4053， 405307)重悬细胞，冰上染色30分钟。按前述方法清洗细胞一次后加入1ml FACS buffer重悬细胞。并用FACSArial II分选出膜表面高表达SCARB2的293A细胞，连续培养并分选4 次后，SCARB2的表达量达到99％以上，扩增高表达SCARB2的293A细胞并冻存。
二、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FTIC对过表达SCARB2的293A细胞系进行免疫荧光染色
1、用70％酒精浸泡盖玻片，待酒精挥发干净，置于24孔板中，将膜表面不表达SCARB2 的293A细胞以及步骤一制备的过表达SCARB2的293A细胞分别接种于铺有盖破片的24孔板中，培养过夜。2、吸去细胞培养液，用500μL PBS清洗一遍。吸去PBS，加入2.5～4％甲醛500μL，室温作用15min，固定细胞。3、吸去甲醛，用PBS清洗三遍。加入100μL小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC，室温作用1小时。4、用1xDPBS(Thermo Fisher Scientific，Cat:#14080055)洗3次。5、用1xDPBS(Thermo Fisher Scientific，Cat:#14200166)洗一遍，降低盐浓度。6、吸去玻片上液体，使玻片尽量干燥。取封片剂到EP管中，按照1滴封片剂 0.4μL DAPI(Vector，H-1000)的比例加入DAPI。将配好的含有DAPI的封片剂滴到载玻片上，把已染色的玻片覆盖在上面，有细胞一面朝下，防止产生气泡。用指甲油固定玻片到载玻片上。Olympus FV1000激光共聚焦显微镜下观察玻片。
结果如图7所示，膜表面不表达SCARB2的293A细胞系不能够被小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC染色，而膜表面表达SCARB2的293A细胞系(293A-hSCARB2)则能够有效结合小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC。
实施例4、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体可以在western blot水平上结合SCARB2
一、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2可以用于Western印记检测
1、分别将实施例3的步骤一获得的过表达SCARB2的293A细胞(293A-SCARB2)和293T-SCARB2-KO细胞(293T-SCARB2-KO细胞记载于文献“Protein Cell 2017,8(8):590–600”中)接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的60cm细胞培养皿中(3×106细胞/皿)，在37℃、5％CO2条件下培养48小时。
2、用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤步骤1获得的产物两次，并用500μl冰冷的裂解液(100mM Tris-HCl(pH7.4)，140mM NaCl，2mM EDTA，1％Triton X-100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠；补充1mM PMSF，0.01M DTT，蛋白酶抑制剂混合片(罗氏))裂解，得到细胞裂解物。在4℃条件下振摇细胞裂解物30分钟，并在13000rpm澄清20分钟，吸出上清液，向上清液中加入5x上样缓冲液和β-ME，100℃煮样10分钟，得到处理后样品。
3、将步骤2获得的处理后样品进行SDS PAGE。具体步骤如下：将处理后样品转移至硝酸纤维素膜。然后用5％BSA封闭膜，将其分别与山羊抗人SCARB2的多抗(R&D， 1966-LM-050)和实施例1制备的SCARB2单克隆抗体5C2一起温育过夜。第2天用TBST 清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗山羊或抗小鼠二抗(中杉金桥，ZB-2305)一起在室温条件下温育1小时，随后用TBST清洗3次。按照制造商说明书(Millipore，WBKLS0100)使用化学发光检测试剂盒，最终将膜暴露于SAGECREATION Minichemi成像系统显色。
结果如图8所示。从图中可以看出：山羊抗人SCARB2的多抗(R&D，1966-LM-050) 和本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2均在293A-SCARB2中检测到SCARB2的条带 (位于85kD附近)，而在293T-SCARB2-KO中均未检测到SCARB2的条带。说明本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够在western印记水平上结合SCARB2。
实施例5、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体可以结合SCARB2的单体和二聚体或糖基化形式
1、将HEK 293T细胞接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的60cm细胞培养皿中(3×106细胞/皿)，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。然后将实施例3步骤一的1 获得的表达人SCARB2的pLenti-SCARB2-puro质粒以及对应的空载体 (pLenti-EF2-Nanog-Puro载体)分别转染HEK 293T细胞，转染步骤按照说明书(Thermo Fisher，Lipofectamine 2000，11668019)进行。之后在37℃、5％CO2条件下培养48小时。2、用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤步骤1获得的产物两次，并用500μl冰冷的裂解液(100mM Tris-HCl(pH7.4)，140mM NaCl，2mMEDTA，1％Triton X-100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠；补充1mM PMSF，0.01M DTT，蛋白酶抑制剂混合片(罗氏))裂解，得到细胞裂解物。在4℃条件下振摇细胞裂解物30分钟，并在13000rpm澄清20分钟，吸出上清液。3、将步骤2中的上清各分为两等份，分别加入10μg/ml同型对照抗体IgG2a(Biolegend，MOPC-173， 400223)和实施例1中的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2，4℃混匀过夜。4、次日，向步骤3中抗体-上清混合液中加入20μl Protein A/G，继续在4℃条件下孵育4小时。5、用冰冷的裂解液(100mM Tris-HCl(pH7.4)，140mM NaCl，2mMEDTA，1％Triton X-100，0.1％SDS) 将结合了抗体的Protein A/G洗5次，每次5分钟。6、将步骤5中的混合液在2000rpm/min 的条件下离心1分钟。弃上清，用1x上样缓冲液(加入β-ME)重悬，100℃煮样10分钟，得到处理后样品。
7、将步骤6获得的处理后样品进行SDS PAGE。具体步骤如下：将处理后样品转移至硝酸纤维素膜。然后用5％BSA封闭膜，将其分别与山羊抗人SCARB2的多抗(R&D， 1966-LM-050)和实施例1制备的SCARB2单克隆抗体5C2一起温育过夜。第2天用TBST 清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗山羊或抗小鼠二抗(中杉金桥，ZB-2305)一起在室温条件下温育1小时，随后用TBST清洗3次。按照制造商说明书(Millipore，WBKLS0100)使用化学发光检测试剂盒，最终将膜暴露于SAGECREATION Minichemi成像系统显色。
结果如图9所示。从图中可以看出：本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够结合转染细胞内表达的SCARB2的两种不同形态：单体和二聚体或糖基化形式(85kD和120kD)。
实施例6、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体结合人清道夫受体B亚家族成员IISCARB2的结合能力检测
1、将实施例3步骤一的2中获得的过表达SCARB2的293A细胞使用含2mM EDTA的PBS溶液进行处理，使之成为单细胞悬液。
2、将步骤1获得的单细胞悬液加至96孔U形底培养板中，10000个细胞/200μl/孔。通过2200rpm/3分钟离心后，弃上清，收集沉淀。
3、向步骤2获得的沉淀中分别加入含有实施例1制备的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2的FACS buffer(含2％FBS和2mM EDTA的PBS)，使之在体系中的终浓度分别为 0.001μg/ml、0.0025μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，重新悬浮后4℃孵育30分钟。同时用等量的小鼠IgG2a(Biolegend，MOPC-173，400223)作为阴性对照。
4、孵育完毕后进行离心，弃上清，收集沉淀，每孔加入200μl FACS buffer，重悬细胞并进行离心，弃上清，收集沉淀并进行清洗。
5、每孔加入1:400稀释于FACS buffer的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend，Poly4053，405307)，将细胞重新悬浮后在4℃、避光条件下孵育30分钟。孵育后，将培养板进行离心并除去上清，按前述方法清洗细胞一次后加入200μl FACS buffer重悬细胞。最后，使用流式细胞仪Guava(Millipore)分析细胞PE信号。
结果如图10所示。本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够在很低的浓度，即0.01μg/mL就可以有效地结合稳定表达人SCARB2的293A细胞表面的SCARB2分子。且随着抗体浓度的增加，5C2抗体结合SCARB2的能力显著增强。
实施例7、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体介导受体内吞
1、用70％酒精浸泡盖玻片，待酒精挥发干净，置于24孔板中，将实施例3步骤一的2获得的过表达SCARB2的293A细胞接种于铺有盖破片的24孔板中，培养过夜。2、吸去细胞培养液，用500μL PBS清洗一遍。3、加入100μL小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC，分别在4℃和37℃条件下作用30分钟、1小时、2小时和4小时。4、其中作用2小时的样品用1xDPBS(Thermo Fisher Scientific,Cat:#14080055)洗3次，加入1:400稀释于FACS buffer 的AF594标记的抗小鼠IgG抗体(Invitrogen，Cat:A-11005)，4℃染色30分钟。其他时间样品不做另外处理。5、所有样品用1xDPBS(Thermo Fisher Scientific，Cat:#14080055)洗3 次。6、用1xDPBS(Thermo Fisher Scientific，Cat:#14080055)洗一遍，降低盐浓度。7、吸去玻片上液体，使玻片尽量干燥。取封片剂到EP管中，按照1滴封片剂0.4μL DAPI(Vector， H-1000)的比例加入DAPI。将配好的含有DAPI的封片剂滴到载玻片上，把已染色的玻片覆盖在上面，有细胞一面朝下，防止产生气泡。用指甲油固定玻片到载玻片上。Olympus FV1000 激光共聚焦显微镜下观察玻片。
结果如图11所示，在4℃染色的条件下，无论染色时间长短，小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC都只能结合在过表达SCARB2的293A细胞(293A-SCARB2细胞)表面；而在37℃染色的条件下，小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC可以进入293A-SCARB2细胞内，且随着染色时间的延长，进入293A-SCARB2细胞内的抗体逐渐增多。说明本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够介导受体内吞。染色2小时的结果显示，仍旧有部分小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2-FITC停留在293A-SCARB2细胞膜上，说明37℃条件下，该细胞表达的SCARB2会不断运送到细胞膜上。
实施例8、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体抑制肠道病毒71型EV71感染293A-SCARB2稳定细胞系
一、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2抑制EV71-GFP在293A-SCARB2中的复制
1、将实施例3步骤一获得的过表达SCARB2的293A细胞接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的24孔细胞培养板中(1×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养过夜。2、次日，弃细胞上清，在24孔细胞培养板中加入含有实施例1制备的小鼠抗人SCARB2 单克隆抗体5C2的DMEM完全培养基，使其在体系中的终浓度分别为0μg/ml、0.1μg/ml、 0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，在37℃、5％CO2条件下孵育1h。同时用等量的小鼠IgG2a作为阴性对照。3、向步骤2的各孔中加入0.1MOI EV71-GFP 病毒(EV71-GFP病毒记载于文献“Protein Cell 2017,8(8):590–600”中)，在37℃、5％CO2条件下孵育12～14h，得到感染后细胞。4、用1ml PBS溶液洗涤步骤3获得的感染后细胞两次，然后用0.025％胰蛋白酶消化细胞2分钟，之后加入FACS buffer(含2％FBS和2mM EDTA 的PBS)，重新悬浮后加入等量的4％PFA室温固定20分钟。最后，使用流式细胞仪Guava (Millipore)分析细胞GFP信号，并计算阻断效率，阻断效率计算公式如下：1-(加入抗体后GFP阳性细胞％/不加抗体时GFP阳性细胞％)。
结果如图12A和图12B所示，当抗体浓度为4μg/mL时，相对于对照组，5C2的阻断效率达到最高，为90.2％(1-2.16％/21.98％)(2.16％表示不加抗体时(Mock)GFP阳性细胞比例；21.98％表示加入抗体后GFP阳性细胞比例)。并且抗体浓度大于0.4μg/mL，阻断效率不再呈剂量依赖，即达到平台期。
二、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2抑制野生型EV71在293A-SCARB2中的复制
1、病毒感染及上清收集
(1)将实施例3步骤一获得的过表达SCARB2的293A细胞接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的24孔细胞培养板中(1×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养过夜。(2)次日，弃细胞上清，在24孔细胞培养板中加入含有实施例1制备的小鼠抗人 SCARB2单克隆抗体5C2的DMEM完全培养基，使其在体系中的终浓度分别为0μg/ml或 0.25μg/ml，在37℃、5％CO2条件下孵育1h。同时用等量的小鼠IgG2a作为阴性对照。(3) 向步骤2的各孔中加入0.1MOI EV71野生型病毒(EV71野生病毒记载于文献“Protein Cell 2017,8(8):590–600”中)，在37℃、5％CO2条件下孵育1h后，吸去病毒液。用1ml PBS清细胞三次，然后加入新鲜的培养基，收集此刻细胞上清标注为0h。(4)感染后16～24h，收集感染上清。
2、病毒RNA提取
采用试剂盒Biospin virus RNA extraction kit提取病毒RNA，提取方法按照试剂盒说明书完成，具体操作步骤如下：
(1)病毒感染细胞后24小时，将细胞培养板在2000转/分钟的条件下离心3分钟，取培养上清100μl加入到无RNase的离心管中，同时取100μl已知滴度的病毒储液作为标准品。(2)在上述待测病毒样品中加入300μl蛋白裂解液，充分震荡混匀。(3)在混合液中加入400μl 无水乙醇，充分震荡混匀，并瞬时离心，使液体聚集到管中。(4)将混匀的液体加到柱子里， 12，000转/分钟离心1分钟。(5)弃废液，在柱子中加入200μl DNase，12，000转/分钟离心 1分钟。(6)弃废液，在柱子中加入600μl洗液，12，000转/分钟离心1分钟。(7)弃废液，在柱子中加入250μl洗液，12，000转/分钟离心2分钟。(8)将柱子转移到一个新的无RNase 的离心管中，加入50μl洗脱液，室温静止1分钟，12，000转/分钟离心1分钟，离心所得液体为RNA溶液。
3、反转录cDNA
将步骤2获得的RNA进行反转录，反转录过程同样按照Promega的RNA反转录酶 M-MLV说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)取一个无RNase的PCR管，加入12μl的RNA和1μl 20mM的Oligo dT。(2)将上述混合液混匀放置于PCR仪中70℃变性5分钟，随后立即4℃降温1分钟，使得Oligo dT引物和mRNA的3’端Poly(A)充分结合，防止RNA的发夹、茎环等二级结构的恢复。(3) 向上述反应体系中加入如下成分后混匀：M-MLV 1μl、5xBuffer 4μl、10mM dNTPs 1μl、RNase抑制剂(RRI)1μl。(4)将充分混匀的反应体系置于PCR仪上，按照如下程序进行反转录：42℃，1小时；75℃，10分钟；4℃，--。(5)反转录得到的cDNA置于-80℃存放或者直接进行下一步。
4、real-time PCR检测病毒滴度
取步骤3反转录获得的cDNA，用无菌水稀释50倍作为模板，并将稀释后的标准品进一步10倍稀释6～7个梯度以便绘制标准曲线。配制反应体系，具体用量如下：Easy Taq0.2μl、10xbuffer 2μl、2.5mM dNTPs 1.6μl、稀释后的cDNA 5μl、LG515(10mM)2μl、LG517(10mM)2μl、LG516probe(1mM)2μl、无菌水5.2μl。
PCR反应体系如下：第一步，95℃预变性5分钟；第二步，95℃变性15秒，57℃退货15秒，72℃延伸20秒，共45个循环；第三步，25℃降温1分钟。实时荧光定量PCR引物序列如表5所示。
EV71定量real-time PCR引物序列
编号
名称
序列(5’-3’)
5’标记
3’标记
LG515
反向引物
TCCTCCGGCCCCTGA
LG517
正向引物
AATTGTCACCATAAGCAGCCA
LG516
探针
CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGT
FAM
TAM
结果如图12C所示，当抗体浓度为0.25μg/mL时，相对于不加抗体对照，5C2阻断野生型EV71感染的效率约为75％。
实施例9、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体结合人清道夫受体B亚家族成员IISCARB2抑制肠道病毒71型EV71感染靶细胞人横纹肌肉瘤细胞RD
一、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2抑制EV71-GFP在RD细胞中的复制
1、将人横纹肌肉瘤细胞RD细胞(ATCC，
结果如图13A所示。当抗体5C2浓度为20μg/mL时，相对于对照组，5C2的阻断效率约为60％。
二、小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2抑制野生型EV71在RD细胞中的复制
1、将人横纹肌肉瘤细胞RD细胞接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的24孔细胞培养板中(1×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养过夜。2、次日，弃细胞上清，在24孔细胞培养板中加入含有实施例1制备的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2的 DMEM完全培养基，使其在体系中的终浓度分别为0μg/ml或1μg/ml，在37℃、5％CO2条件下孵育1h。同时用等量的小鼠IgG2a作为阴性对照。3、向步骤2的各孔中加入0.1MOI EV71 野生型病毒(EV71野生型病毒记载于文献“Protein Cell 2017,8(8):590–600”中)，在37℃、 5％CO2条件下孵育1h后，吸去病毒液。用1ml PBS清细胞三次，然后加入新鲜的培养基，收集此刻细胞上清标注为0h。4、感染后16～24h，收集感染上清。5、通过实施例8步骤二 2/3/4的方法检测病毒感染载量。
结果如图13B所示。当抗体5C2浓度为1μg/mL时，相对于对照组，5C2的阻断效率约为50％。
实施例10、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2结合人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2第144-151位和第188-198位
一、人鼠SCARB2嵌合体构建
质粒hSCARB2为将人SCARB2编码基因序列(GenBank号为NM_005506.3)***pcDNA载体(addgene,cat:#52535)的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
质粒mSCARB2为将小鼠SCARB2编码基因序列(GenBank号为NM_007644.4)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒m144-151为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 144-151位氨基酸的编码基因序列为小鼠SCARB2第144-151位氨基酸的编码基因序列，其余均为人SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒m188-198为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 188-198位氨基酸的编码基因序列为小鼠SCARB2第188-198位氨基酸的编码基因序列，其余均为人SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒m278-288为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 278-288位氨基酸的编码基因序列为小鼠SCARB2第278-288位氨基酸的编码基因序列，其余均为人SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒m354-385为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 354-385位氨基酸的编码基因序列为小鼠SCARB2第354-385位氨基酸的编码基因序列，其余均为人SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒h144-151为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 144-151位氨基酸的编码基因序列为人SCARB2第144-151位氨基酸的编码基因序列，其余均为小鼠SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒h188-198为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 188-198位氨基酸的编码基因序列为人SCARB2第188-198位氨基酸的编码基因序列，其余均为小鼠SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒h144-151&h188-198为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第144-151位和第188-198位氨基酸的编码基因序列为人SCARB2第144-151位和第188-198位氨基酸的编码基因序列，其余均为小鼠SCARB2编码基因序列)***pcDNA 载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体；
人鼠SCARB2嵌合体质粒h144-198为将SCARB2编码基因序列(其中，SCARB2第 144-198位氨基酸的编码基因序列为人SCARB2第144-198位氨基酸的编码基因序列，其余均为小鼠SCARB2编码基因序列)***pcDNA载体的NotI和EcoRI酶切位点间得到的载体。
本发明的十个人鼠SCARB2嵌合体结构如图14所示，实心部分代表人SCARB2的序列，空心部分代表小鼠SCARB2的序列。
二、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体在流式水平结合人清道夫受体B亚家族成员 II SCARB2需要残基144-151和188-198区域
1、将293T-SCARB2-KO细胞(293T-SCARB2-KO细胞记载于文献“Protein Cell2017, 8(8):590–600”中)接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的24孔板中(1×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。然后将步骤一制备的人鼠SCARB2嵌合体质粒分别转染HEK 293T细胞，转染步骤按照说明书(Thermo Fisher，Lipofectamine 2000，11668019)进行。在37℃、5％CO2条件下培养48小时。2、将步骤1中获得的转染细胞使用含2mM EDTA的PBS溶液(每1L PBS含KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、NaCl 8g、KCl 0.2g、调节pH至7.2～7.4，用水定容至1L)进行处理，使之成为单细胞悬液。3、将转染细胞的单细胞悬液加至96孔U形底培养板中，10000个细胞/200μl/孔。通过2200rpm/3分钟离心后，弃上清，收集沉淀。4、向步骤3获得的沉淀中分别加入含有1μg/ml的实施例1制备的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2以及同型对照抗体IgG2a的FACS buffer(含2％FBS和2mM EDTA的PBS)，重新悬浮后4℃孵育30分钟。5、孵育完毕，进行离心，弃上清，收集沉淀，每孔加入200μl FACSbuffer，重悬细胞并进行离心，弃上清，收集沉淀并进行清洗。6、每孔加入1:400稀释于FACSbuffer的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend)，将细胞重新悬浮后在4℃避光孵育30分钟。孵育后，将培养板进行离心并除去上清，按前述方法清洗细胞一次后加入200μl FACSbuffer重悬细胞。最后，使用流式细胞仪Guava(Millipore)分析细胞PE信号。
结果如图15所示，本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够在FACS水平结合人SCARB2需要人SCARB2的144-151和188-198区域。
三、本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体在western blot水平结合人清道夫受体B亚家族成员II SCARB2需要残基144-151和188-198区域
1、将293T-SCARB2-KO细胞(293T-SCARB2-KO细胞记载于文献“Protein Cell2017, 8(8):590–600”中)接种于含有DMEM完全培养基(含有10％FBS)的24孔板中(1×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。然后将步骤一制备的人鼠SCARB2嵌合体质粒分别转染HEK 293T细胞，转染步骤按照说明书(Thermo Fisher，Lipofectamine 2000，11668019)进行。在37℃、5％CO2条件下培养48小时。2、用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤步骤1获得的产物两次，并用500μl冰冷的裂解液(100mM Tris-HCl(pH7.4)，140mM NaCl， 2mMEDTA，1％Triton X-100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠；补充1mM PMSF，0.01M DTT，蛋白酶抑制剂混合片(罗氏))裂解，得到细胞裂解物。在4℃振摇细胞裂解物30分钟，并在13000rpm澄清20分钟，吸出上清液，向上清液中加入5x上样缓冲液和β-ME，100℃煮样10分钟，得到处理后样品。3、将步骤2获得的处理后样品进行SDS PAGE。具体步骤如下：将处理后样品转移至硝酸纤维素膜。然后用5％BSA封闭膜，将其分别与山羊抗人SCARB2 的多抗(R&D，1966-LM-050)和实施例1制备的SCARB2单克隆抗体5C2一起温育过夜。第2天用TBST清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗山羊或抗小鼠二抗(中杉金桥，ZB-2305) 一起在室温温育1小时，随后用TBST清洗3次。按照制造商说明书(Millipore，WBKLS0100) 使用化学发光检测试剂盒，最终将膜暴露于SAGECREATION Minichemi成像系统显色。
结果如图16所示，本发明的小鼠抗人SCARB2单克隆抗体5C2能够在western blot水平结合人SCARB2同样需要人SCARB2的144-151和188-198区域。
序列表
<110>广东旋玉健康生物科技有限公司
<120>阻断EV71感染的单克隆抗体及其应用
<160>16
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctacat ctctgggagg caaagtcacc 60
atcacttgca aggcaagcca agacattaac aaatatatag cttggtacca acacaagcct 120
ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acgtctacat tacagccagg catcccatca 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggaaagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240
gaagatcttg caacttatta ttgtctacaa tatgataatc ttctcacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210>2
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
1 5
<210>4
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
Tyr Thr Ser
1
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Thr
1 5
<210>6
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
gaggtgaagc tggatgagac tggaggaggc ttggtgcaac ctgggaggcc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cacttttagt gactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaaag gactggagtg ggtagcacaa attagataca aaccttataa ttctgaaaca 180
ttttattcag attctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacgtgg gtatctatta ctgtacatcc 300
cattactacg gctacgtacc ctttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gca 363
<210>7
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Tyr Lys Pro Tyr Asn Ser Glu Thr Phe Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp
1 5
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
Ile Arg Tyr Lys Pro Tyr Asn Ser Glu Thr
1 5 10
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
Thr Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Val Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210>11
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>12
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
Glu Glu Lys Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Phe Cys Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Ser Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Trp Phe Ile Thr Thr Val Val Ala Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210>13
<211>699
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>13
atgagactgg ctattcagtt cctggggctc ctgttgttct ggcttcatgg tgttcagtgt 60
gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctacat ctctgggagg caaagtcacc 120
atcacttgca aggcaagcca agacattaac aaatatatag cttggtacca acacaagcct 180
ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acgtctacat tacagccagg catcccatca 240
aggttcagtg gaagtgggtc tgggaaagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 300
gaagatcttg caacttatta ttgtctacaa tatgataatc ttctcacgtt cggagggggg 360
accaagctgg aaataaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420
agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 480
aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 540
agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 600
accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 660
acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 699
<210>14
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>14
Met Arg Leu Ala Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Val Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Thr Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn
165 170 175
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His
195 200 205
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile
210 215 220
Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210>15
<211>1410
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>15
atgtactttg gactgagctg tgtattcatt gtttttctct taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaagctgg atgagactgg aggaggcttg gtgcaacctg ggaggcccat gaaactctcc 120
tgtgttgcct ctggattcac ttttagtgac tactggatga actgggtccg ccagtctcca 180
gagaaaggac tggagtgggt agcacaaatt agatacaaac cttataattc tgaaacattt 240
tattcagatt ctgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattccaa aagtagtgtc 300
tacctgcaaa tgaacaactt aagagctgaa gacgtgggta tctattactg tacatcccat 360
tactacggct acgtaccctt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420
gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 480
tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 540
tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 600
ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 660
acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 720
gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 780
ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 840
atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 900
tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 960
agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 1020
gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 1080
aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 1140
atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 1200
tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 1260
ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 1320
gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 1380
actaagagct tctcccggac tccgggtaaa 1410
<210>16
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>16
Met Tyr Phe Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Tyr Lys Pro Tyr Asn Ser Glu Thr Phe
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Val
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Val Pro Phe Ala
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
195 200 205
Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val
210 215 220
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg
225 230 235 240
Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp
260 265 270
Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
290 295 300
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
325 330 335
Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys
370 375 380
Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile
385 390 395 400
Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn
405 410 415
Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys
435 440 445
Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe
450 455 460
Ser Arg Thr Pro Gly Lys
465 470
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