阅读说明：本技术 一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法 (Method for improving exogenous synthesis yield of water-soluble phycocyanin ) 是由 林凌 陈明明 朱国萍 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法,属于生物基因工程、微生物发酵技术领域。该方法以TB培养基为对照,依据大肠杆菌诱导表达载体系统,使藻青素合成酶合成藻青素,选用特定的培养基组分和培养温度,使得水溶性藻青素合成产量获得大幅提高本发明生产的水溶性藻青素,具有比对照培养产生的水溶性藻青素产量高2.2倍的特性,为水溶性藻青素生产提供了更高效的培养条件。(The invention discloses a method for improving exogenous synthetic yield of water-soluble phycocyanin, and belongs to the technical field of biological genetic engineering and microbial fermentation. The method uses TB culture medium as a reference, synthesizes phycocyanin by phycocyanin synthetase according to an escherichia coli induced expression vector system, selects specific culture medium components and culture temperature, greatly improves the synthesis yield of water-soluble phycocyanin produced by the method, has the characteristic of 2.2 times higher than the yield of the water-soluble phycocyanin produced by the reference culture, and provides more efficient culture conditions for the production of the water-soluble phycocyanin.)

一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程、微生物发酵技术领域，特别是指一种可提高水溶性藻青素外源合成产量的方法及其应用。

背景技术

藻青素(CGP)是一种非核糖体合成的氨基酸聚合物，存在于大多数蓝藻细菌和一些异养细菌中。它包括一个聚L天冬氨酸(Asp)主链，众多精氨酸(Arg)通过其氨基连接到每个天冬氨酸的羧基上形成的侧链。Arg和Asp通常以等摩尔量存在于聚合物中。天然的藻青素分子质量大小为25kDa到100kDa，具有广泛的多分散性。天然状态下的藻青素根据其物理性质的不同可分为两种形式：不溶性和水溶性的藻青素。可溶于中性溶液的称为水溶性藻青素，可以通过添加乙醇来使该复合物沉淀。不溶性藻青素仅溶解在pH<2.0或者pH>9.0溶液中，在中性条件下则会产生沉淀。藻青素作为氮和碳的储存化合物，被认为是大多数蓝细菌颗粒包裹体的组成部分。近年来，由于其在食品、医药、化妆品、营养、农业等领域的应用，引起了越来越多的关注。

目前藻青素合成的主流趋势分为将藻青素合成酶CphA进行异源表达或者直接进行藻青素的体外合成。异源表达的主要宿主包括各种杆菌，烟草和酵母菌。其中大肠杆菌以遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定等一系列优点，被作为受体广泛研究。由于可以分解藻青素的酶也即是藻青素酶可以采用基因敲除的手段人为去除，并且在大肠杆菌中该酶的活性被抑制，这导致大量藻青素在细胞中沉积。实验表明，从外源表达系统中分离出来的藻青素与蓝细菌产生的藻青素分子量存在大小上的差异。外源表达系统中分离出来的藻青素一般水溶性藻青素约为0-25kDa，不可溶性藻青素为25-33kDa。

近年来对藻青素的热稳定性和生物相容性进行了研究，藻青素的弹性压缩模量为560MPa，在200℃以下具有热稳定性。在生物相容性方面，水溶性藻青素对中国仓鼠卵巢CHO细胞无任何毒性。CHO细胞在藻青素形成的薄膜上表现出更高的细胞密度，去除含血清的培养基后，细胞形态可维持72h。这些属性无疑揭示了水溶性藻青素在生物医学上的应用前景。在2002年国外医药期刊上已由研究者祁红报道了藻青素对内毒素处理小鼠血清中TNF-α及亚硝酸盐水平的影响，2017年Ahmed Sallam等人发表专利Aspartyl-Dipeptides ForSkin Care and Cosmetic Use，专利号为US2019/0117548A1，探讨了藻青素在护肤品领域的应用。

尽管藻青素合成载体广泛，研究领域众多，但由于其产量有限，目前以大肠杆菌为载体采用CphA₆₃₀₈基因的藻青素外源表达，水溶性藻青素产量50-100mg/g，而不溶性藻青素占菌体干重的200-300mg/g，以大肠杆菌为载体采用CphA₆₈₀₃基因的藻青素外源表达，水溶性藻青素产量多为菌体干重的30-50mg/g，而不溶性藻青素占菌体干重的100-200mg/g。而本发明采用的CphA_BP基因，在经过培养条件的改变后在不降低不溶性藻青素产量的情况下，可达到水溶性藻青素产量占菌体干重的160mg/g。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提出一种可以提高水溶性藻青素异源合成产量的方法，用于克服上述现有技术中的水溶性藻青素产量低下的缺点。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，利用重组大肠杆菌生产水溶性藻青素，将生产藻青素的大肠杆菌活化菌液接种于提高水溶性藻青素产量的发酵培养基中，在温度为35℃诱导培养30h；所述重组大肠杆菌使用的重组菌株为Escherichia coli BL21宿主菌，所述菌株包含有pCOLADuet-1表达载体和来源于Thermosynechococcus elongatus BP-1的藻青素合成酶基因CphA_BP，所述基因的编号为GenBank No：NC_004113，所述发酵培养基成分为2.4％的酵母粉、1mM的天冬氨酸和1mM的赖氨酸、4mL/L的甘油、由17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄组成的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述提高水溶性藻青素产量的培养基中，所述碳源为甘油、酵母粉、氨基酸；所述主要氮源为酵母粉；所述无机盐为磷酸盐。

优选的，所述活化菌液的制备方法是重组大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基，在温度为37℃、转速180rpm条件下震荡培养16h，得活化菌液。

优选的，将所述活化菌液与所述发酵培养基按体积比1:100接种，在温度为37℃、转速为180rpm条件下预培养2-3h，再诱导培养30h。

优选的，将所述活化菌液与所述发酵培养基按体积比1:100接种，在温度为37℃、转速为180rpm条件下预培养2-3h，待菌液OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加0.01％浓度的1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为35℃，转速为180rpm条件下培养30h。

优选的，还包括藻青素纯化步骤，依据大肠杆菌菌体特性，收菌条件为5500rpm，离心10min；将收集的菌体烘干，并依据菌体干重10-20mL/g添加pH值为1.4的盐酸，在摇床温度为30℃，转速为140rpm条件下震荡12h，将菌体裂解液以转速9000rpm离心30分钟收集上清，沉淀再次添加5mL 0.1M的盐酸，30℃摇晃1h后离心收集上清；将两次所得上清混合，添加NaOH调节pH至7.0，将中性的浑浊液以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为不可溶性藻青素，上清添加2倍体积的冰乙醇后再次以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为水溶性藻青素。

水溶性藻青素外源合成和分析的方法，包括如下步骤：重组菌株构建，菌体活化，扩大培养，转接至特定培养基，添加诱导物，收菌纯化，产量计算，液相色谱检测。

所用的CphA_BP基因，是仅来自Thermosynechococcus elongatus BP-1，该基因功能公布于文献A cyanophycin synthetase from Thermosynechococcus elongatus BP-1catalyzes primer-independent cyanophycin synthesis，基因序列公布于GenBank公共数据库，编号为NC_004113(2249112..2251802)。

将CphA_BP基因的DNA片段连接至质粒pCOLADuet-1上并转化至Escherichia coliBL21宿主菌中，获得重组菌株。活化和扩大培养的方法是根据重组菌株生长和质粒pCOLADuet-1的特性，恢复重组菌株活性。其中，LB培养基包括如下成分：

LB液体培养基(100mL)(M/V)：蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 1.0％。

菌体活化步骤包括：超净工作台无菌条件下，取甘油菌种划线于添加0.1％卡那霉素的LB固体平板，放置于37℃的恒温培养箱中，培养12h。

菌体扩大培养步骤包括：挑取上述活化后的重组菌株单菌落，接种于含100mL LB液体培养基的三角烧瓶中。此外，同时需添加0.1％的卡那霉素于培养基中，培养条件为温度37℃，转速为180rpm，时间定为16h。

转接至TB培养基与特定培养基中并放置在恒温摇床中培养。特定培养基组分包括：酵母粉，甘油，磷酸盐缓冲液和氨基酸。此外，同时需添加0.1％的卡那霉素。培养条件设置为：温度35℃，转速为180rpm。

当菌液OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加0.01％浓度的IPTG，继续培养30h。

依据大肠杆菌菌体特性，收菌条件为5500rpm，离心10min。收集菌体并称量干重，并依据干重10-20mL/g添加pH值为1.4的盐酸，于恒温摇床30℃、140rpm条件下，震荡摇晃12h。

依据酸解纯化法，纯化出水溶性及不溶性的藻青素，并进行产量分析。计算方式为藻青素质量/菌体质量。

有益效果：

一种可提高水溶性藻青素外源合成产量的方法可以被用来工业化大批量生产水溶性藻青素。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种可提高水溶性藻青素外源合成产量的方法及其应用。该方法以TB培养基为对照，依据大肠杆菌诱导表达载体系统，使藻青素合成酶合成藻青素，选用特定的培养基组分和培养温度，使得水溶性藻青素合成产量获得大幅提高本发明生产的水溶性藻青素，具有比对照培养产生的水溶性藻青素产量高2.2倍的特性，为水溶性藻青素生产提供了更高效的培养条件。

本发明公开了提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，包括以大肠杆菌为载体采用CphA_BP基因的藻青素外源表达、和选用特定的可提高水溶性藻青素产量的培养基及培养温度。特定培养基中仅含有固定配比的酵母粉，作为菌体生产所需的碳源、氮源，去除含有大量复杂氨基酸、多肽分子的蛋白胨成分，以避免其干扰水溶性藻青素合成效率，添加的天冬氨酸、赖氨酸成分为藻青素的合成提供外源底物，从而提高水溶性藻青素的产量。所述水溶性藻青素外源合成方法，采用的培养温度为35℃，相比较25℃和40℃的培养条件，水溶性藻青素的产量分别提高20.6％和44.5％。目前以大肠杆菌为载体采用CphA₆₈₀₃基因的藻青素外源表达，水溶性藻青素产量多为菌体干重的30-50mg/g，而不溶性藻青素占菌体干重的100-200mg/g。而本发明所述在不影响不溶性藻青素产量的情况下，可达到水溶性藻青素产量占菌体干重的160mg/g，远远超过现有技术报道的合成的水溶性溶性藻青素产量，这对于本领域来说是一个非常大的突破，具有显著的技术进步，本发明公开的培养条件能够用于大肠杆菌诱导表达生产水溶性藻青素，具有很好的经济效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1为实施例1中菌液内容物电泳图。

图2为实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和实施例7中藻青素纯度电泳图。

图3为实施例1中液相色谱检测藻青素成分图。

图4为实施例2中液相色谱检测藻青素成分图。

图5为实施例5中液相色谱检测藻青素成分图。

图6为实施例7中菌液内容物电泳图。

图7为实施例7中藻青素纯度电泳图。

具体实施方式

实施例1

1重组菌株构建

根据GenBank中Thermosynechococcus elongatus BP-1编码藻青素合成酶的基因CphA_BP序列，人工合成全基因序列，通过SalI和NotI限制性内切酶位点与质粒pCOLADuet-1连接，重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。提取重组质粒，再次转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得重组菌株。

2活化菌体

超净工作台无菌条件下，取甘油菌种划线于添加0.1％卡那霉素的LB固体平板，放置于37℃的恒温培养箱中，培养12h。从平板上挑取一环重组菌株单菌落，于100mL添加了0.1％卡那霉素的LB液体培养基中，在摇床条件为37℃，转速180rpm培养16h。

3发酵培养

将活化后的菌液按1％接种量接种于添加了0.1％卡那霉素的100mL发酵培养基中，在温度为37℃，转速为180rpm条件下培养2-3h。待菌液OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加0.01％浓度的1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为35℃，转速为180rpm条件下培养30h。发酵培养基分为TB培养基。TB培养基配方为2.4％的酵母粉，1.2％的蛋白胨，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)。

4藻青素纯化提取

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是TB培养基菌体总蛋白。

依据大肠杆菌菌体特性，收菌条件为5500rpm，离心10min；将收集的菌体烘干并称重。

藻青素纯化方法采用酸解法，并依据菌体干重10-20mL/g添加pH值为1.4的盐酸，在摇床温度为30℃，转速为140rpm条件下震荡12h。

将菌体裂解液以转速9000rpm离心30分钟收集上清，沉淀再次添加5mL 0.1M的盐酸，30℃摇晃1h后离心收集上清。将两次所得上清混合，添加NaOH调节pH至中性。

将中性的浑浊液以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为不可溶性藻青素。上清添加2倍体积的冰乙醇后再次以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为水溶性藻青素。

将不溶性藻青素再溶于0.1M盐酸中，调节pH至中性，以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀置于65℃烘箱中烘干并称重。计算水溶性藻青素占比，结果为73.6mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将纯化出的藻青素进行SDS-PAGE电泳。结果如图2。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是TB培养基纯化出的不溶性藻青素；泳道2是TB培养基纯化出的水溶性藻青素。

5藻青素HPLC检测

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品，该样品为TB培养基培养菌体纯化所得。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后,加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL 0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。

HPLC采用Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，柱温设置为35℃，流动相为30％甲醇:70％37mM醋酸钠，流速为0.9mL/min，检测波长为334nm，进样量为5μL。

结果如图3所示，天冬氨酸保留时间为2.5分钟，精氨酸保留时间为5.0分钟，样品中不可溶藻青素天冬氨酸与精氨酸摩尔比为54：46，水溶性藻青素天冬氨酸与精氨酸摩尔比为64：36。

实施例2

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

方法同实例1

发酵培养基配方为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)。

3藻青素纯化提取

方法同实例1

计算水溶性藻青素占比，结果为149.2mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道2是添加2.4％酵母粉的培养基菌体总蛋白。

将纯化出的藻青素进行SDS-PAGE电泳。结果如图2。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道3是添加2.4％酵母粉的培养基纯化出的不溶性藻青素；泳道4是添加2.4％酵母粉的培养基纯化出的水溶性藻青素。

4藻青素HPLC检测

方法同实例1

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品，该样品为2.4％酵母粉培养基培养菌体纯化所得。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后，加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL 0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。

结果如图4所示，天冬氨酸保留时间为2.5分钟，精氨酸保留时间为5.0分钟，样品中天冬氨酸与精氨酸摩尔浓度比为42：58。

实施例3

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

方法同实例1

发酵培养基配方为4.8％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)。

3藻青素纯化提取

方法同实例1

计算水溶性藻青素占比，结果为105.3mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道4是添加4.8％酵母粉的培养基菌体总蛋白。

将纯化出的藻青素进行SDS-PAGE电泳。结果如图2。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道7是添加4.8％酵母粉的培养基纯化出的不溶性藻青素；泳道8是添加4.8％酵母粉的培养基纯化出的水溶性藻青素。

4藻青素HPLC检测

方法同实例1

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品，该样品为4.8％酵母粉培养基培养菌体纯化所得。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后,加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL 0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。结果如图3所示，不溶性藻青素中天冬氨酸与精氨酸摩尔比为41：59。可溶性藻青素样品中天冬氨酸与精氨酸摩尔浓度比为45：55。

实施例4

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

方法同实例1

发酵培养基配方为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM天冬氨酸、1mM精氨酸。

3藻青素纯化提取

方法同实例1

计算水溶性藻青素占比，结果为149mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道5是本次发酵培养基菌体总蛋白。

4藻青素HPLC检测

方法同实例1

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后,加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。

不溶性藻青素天冬氨酸与精氨酸摩尔比为41：59。可溶性藻青素中天冬氨酸与精氨酸摩尔浓度比为48：52。

实施例5

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

方法同实例1

发酵培养基配方为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM天冬氨酸、1mM赖氨酸。

3藻青素纯化提取

方法同实例1

计算水溶性藻青素占比，结果为165.3mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道6是本次发酵培养基菌体总蛋白。

4藻青素HPLC检测

方法同实例1

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后，加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。

结果如图5所示，天冬氨酸保留时间为2.5分钟，精氨酸保留时间为5.0分钟，不溶性藻青素液相色谱样品中天冬氨酸峰、精氨酸摩尔比为48：52。可溶性藻青素样品中天冬氨酸与精氨酸摩尔浓度比为50：50。

实施例6

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

方法同实例1

发酵培养基配方为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM精氨酸、1mM赖氨酸。

3藻青素纯化提取

方法同实例1

计算水溶性藻青素占比，结果为101.3mg/g(藻青素质量/菌体质量)。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道7是本次发酵培养基菌体总蛋白。

4藻青素HPLC检测

方法同实例1

分别称取1mg纯化的不溶性藻青素样品和水溶性藻青素样品。将样品用100μL 6M浓盐酸100℃下水解12h后,加入纯水至1mL，在65℃烘箱中干燥12h。将烘干的样品加入1mL0.1M盐酸，稀释后进行液相色谱检测。

不溶性藻青素液相色谱样品中天冬氨酸峰、精氨酸摩尔比为45：55。可溶性藻青素样品中天冬氨酸与精氨酸摩尔浓度比为40：60。

实施例7

1活化菌体

方法同实例1

2发酵培养

将活化后的菌液按1％接种量接种于添加了0.1％卡那霉素的100mL TB培养基中，在温度为37℃，转速为180rpm条件下培养2-3h。待菌液OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加0.01％浓度的1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃培养温度的摇床中，转速180rpm条件下培养30h。TB培养基配方为2.4％的酵母粉，1.2％的蛋白胨，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)。

3藻青素纯化提取

方法如实例1

计算水溶性藻青素占比，结果如下表所示。

表1不同培养条件下水溶性藻青素产量

25℃下水溶性藻青素产量为95.4mg/g；30℃下水溶性藻青素产量为113.9mg/g；35℃下水溶性藻青素产量为115.1mg/g；40℃下水溶性藻青素产量为79.6mg/g。35℃温度生产时，水溶性藻青素产量提高44.5％。

将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6制作SDS-PAGE样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图6所示。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是25℃条件下菌体总蛋白；泳道2是30℃条件下菌体总蛋白；泳道3是35℃条件下菌体总蛋白；泳道4是40℃条件下菌体总蛋白。

将纯化出的藻青素进行SDS-PAGE电泳。结果如图7。泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1-2分别为25℃下化出的不溶性藻青素、水溶性藻青素；泳道3-4分别为30℃下化出的不溶性藻青素、水溶性藻青素；泳道5-6分别为35℃下化出的不溶性藻青素、水溶性藻青素；泳道7-8分别为40℃下化出的不溶性藻青素、水溶性藻青素。分子量大小符合已知藻青素分子量。

实验结论：

TB培养基作为对照组的情况下，水溶性藻青素产量为73.6mg/g，而2.4％、4.8％酵母粉培养基中水溶性藻青素产量依次为149.2mg/g、105.3mg/g；添加lys、Asp培养基水溶性产量为165.3mg/g，添加Arg和Asp培养基水溶性藻青素产量为149mg/g，添加Arg和Lys培养基水溶性藻青素产量为101.3mg/g，添加氨基酸的量为每种氨基酸添加1mM。

产量较佳的培养基配方1为：2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mMKH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)；配方2为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mMKH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM天冬氨酸、1mM赖氨酸；配方3为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM天冬氨酸、1mM精氨酸。

藻青素产量最佳条件为温度35℃，培养基配方为2.4％的酵母粉，甘油0.4mL、10mL磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄和72mM K₂HPO₄)和1mM天冬氨酸、1mM赖氨酸，最佳产量为165.3mg/g相比于TB培养基在35℃下73.6mg/g的产量，提高了2.2倍。

目前现有技术所基因和合成方法，水溶性藻青素产量仅为30-110mg/g。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。