阅读说明：本技术 地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用 (Application of bacillus licheniformis glutamate dehydrogenase mutant S277W in poly-gamma-glutamic acid synthesis ) 是由 陈守文 蔡冬波 杨帆 张清 马昕 陈建刚 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程和酶工程技术领域,公开了地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用。本发明通过基因组上定点突变的方式,将来源于地衣芽胞杆菌WX-02(<I>Baclicus lincheniformis</I> WX-02,中谷氨酸脱氢酶RocG的第277位丝氨酸突变为色氨酸,显著提高了谷氨酸脱氢酶催化活力,解决了目前聚γ-谷氨酸合成过程中谷氨酸供给不足的问题,突变菌株聚γ-谷氨酸产量相较于对照菌株至少提高了12%以上。本发明为聚γ-谷氨酸的高效生产提供了一种新策略。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering and enzyme engineering, and discloses an application of a bacillus licheniformis glutamate dehydrogenase mutant S277W in poly-gamma-glutamic acid synthesis. The invention uses the mode of site-directed mutagenesis on genome to lead the bacillus licheniformis WX-02 (B) Baclicus lincheniformis WX-02, the 277 th serine of the middle glutamate dehydrogenase RocG is mutated into tryptophan, the catalytic activity of the glutamate dehydrogenase is obviously improved, the problem of insufficient supply of glutamate in the existing synthesis process of poly-gamma-glutamic acid is solved, and the yield of the mutant strain poly-gamma-glutamic acid is at least improved by over 12 percent compared with that of a control strain. The invention provides a new strategy for the efficient production of poly-gamma-glutamic acid.)

地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成 中的应用

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸是由α-氨基和γ-羧酸基团之间的酰胺键连接的D/L-型谷氨酸残基构成的阴离子多肽。因其生物结构特征，使它具有很多优良的性质。聚γ-谷氨酸作为水溶性、生物可降解性、生物相容性、可食用性、无毒性的生物可降解材料，可广泛用于食品、农业、医药、化妆品、环保等领域。因此，聚γ-谷氨酸具有广泛的应用前景。

目前，聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法，但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多，导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化率偏低。从目前报道看，聚γ-谷氨酸的商业生产菌株几乎完全依赖于芽胞杆菌属，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等。根据营养要求，这些聚γ-谷氨酸生产菌株可分为L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非依赖型。L-谷氨酸依赖型菌株在商业生产上增加了生产成本。L-谷氨酸非依赖型菌株虽然是潜在的低生产成本的细胞工厂，但是其生产力却受到了极大的限制。谷氨酸脱氢酶是聚γ-谷氨酸合成途径中关键酶，负责催化α-酮戊二酸形成谷氨酸，随后通过聚γ-谷氨酸合成酶进一步反应生成终产物聚γ-谷氨酸。由于胞内谷氨酸的合成积累是聚γ-谷氨酸高效合成的必要条件，谷氨酸脱氢酶也是聚γ-谷氨酸生物合成的关键酶。

来源于地衣芽胞杆菌的谷氨酸脱氢酶RocG是一类辅酶依赖型脱氢酶，能够催化α-酮戊二酸与谷氨酸之间的相互转化。目前地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶RocG的蛋白结构和催化特性并未研究和解析，其催化核心区域也尚未解析和阐明，因此无法对其进行相应改造。因此，谷氨酸脱氢酶位点改造对于其催化特性及聚γ-谷氨酸生物合成的影响也是未知的。

发明内容

本发明的目的在于提供了地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W聚γ-谷氨酸合成中的应用，所述的谷氨酸脱氢酶突变体S277W的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

谷氨酸脱氢酶突变体S277W在生物发酵生产聚γ-谷氨酸中的应用，包括将编码该突变蛋白的基因转化进地衣芽胞杆菌中，发酵生产聚γ-谷氨酸，所述的突变体S277W的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02。

以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：

葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO₃ 0～10g/L，NH₄Cl10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 0-0.15g/L，CaCl₂ 1g/L；

或甘油20-40g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠10g/L，NaNO₃ 10g/L，NH₄Cl 10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 0.15g/L，CaCl₂ 1g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过基因组突变的方式，将谷氨酸脱氢酶第277位丝氨酸突变为色氨酸(本发明命名为突变体S277W)，显著提高了谷氨酸脱氢酶的催化活性，解决了目前聚γ-谷氨酸合成过程中谷氨酸供应不足的问题，改造后的菌株合成聚γ-谷氨酸显著提高，其聚γ-谷氨酸合成水平相较于对照菌株至少提高了12％。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实验材料和试剂

1、菌株：地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，保藏号为CCTCCNO.M208065，菌株E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：高保真Taq酶购自武汉擎科生物技术有限公司公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。

(2)发酵培养基：葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO₃0～10g/L，NH₄Cl 0～5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0～1g/L，MgSO₄·7H₂O 0～1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0～1g/L，MnSO₄·H₂O 0～0.15g/L，CaCl₂ 0.5～1g/L；

或：甘油20-60g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠10g/L，NaNO₃ 10g/L，NH₄Cl 10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 0.15g/L，CaCl₂ 1g/L

所述发酵的pH为6.5～7.2，115℃灭菌20min后使用。

实施例1：

谷氨酸脱氢酶基因突变的地衣芽胞杆菌WX-rocG^S277W的构建：

1、根据地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA序列通过基因合成rocG^S277W(SEQ ID NO.2所示)；以地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA为模板，PCR扩增出rocG基因的上游同源臂(引物为T2-F1和T2-R1)和rocG^S277W基因的下游同源臂(引物为T2-F2和T2-R2)；

T2-F1:AGAGCGGCTGATGAAGGT

T2-R1:GCTCCATTTTTTCTAGCGTATGCACTAACAGGCACGCCAAAAG

T2-F2:TCGCTCAGGGAGTCGTTTAATCACCTGGAAGTCTTAGCG

T2-R2:ATCAAAAACAGAAGGGGGAGGA

2、通过重叠延伸PCR将rocG基因的上游同源臂、合成的rocG^S277W基因和rocG基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：rocG基因的上游同源臂-合成的rocG^S277W基因-rocG基因的下游同源臂；

3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-Ori进行双酶切得到线性质粒片段；

4、将步骤3得到的酶切目的片段和步骤3得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶连接，验证正确后得到质粒T2(2)-rocG^S277W；

5、将质粒T2(2)-rocG^S277W转入地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02中，经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证；

6、将步骤4得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和rocG^S277W-R为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA

rocG^S277W-R：AGACATAGCCGTCCCATTCGCTGCAGGCCACCACC

7、将步骤5得到的菌株和步骤6得到的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为T2-KYF和T2-KYR)。得到阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的rocG^S277W菌株(即地衣芽胞杆菌WX-rocG^S277W)。

T2-KYF:GAGATTATTCGTAAAGCCGAGATG

T2-KYR:CTGTCTCCCGTGTCTTTACCCG

实施例2：

谷氨酸脱氢酶基因rocG^S277W突变株在提高聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：

发酵产物分析

将实施例1获得的重组菌株接种到LB培养基中，37℃，培养14h；向500mL三角瓶中装入50mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速230r/min，温度37℃，发酵周期36小时。

本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了地衣芽胞杆菌WX-rocG^S277W对聚γ-谷氨酸合成水平的影响(同时也在这24种培养基中接种地衣芽胞杆菌WX-02作为对照)，24组培养基配方具体如表1所示：

表1发酵培养基配方

以上培养基成分单位均为g/L。

采用干重法测量聚γ-谷氨酸产量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，菌体沉淀80℃烘箱烘干，测菌体干重。取上清，用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀聚γ-谷氨酸，离心收集聚γ-谷氨酸絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸产量(见表2)。

表2发酵试验聚γ-谷氨酸的产量

序列表

<110> 湖北大学

<120> 地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶突变体S277W在聚γ-谷氨酸合成中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val His Thr Leu Glu Lys Met Glu Gln Thr Asn Phe Gln Thr Ala Arg

1 5 10 15

Asp Tyr Val Thr Gln Ala Tyr Glu Thr Val Gln Lys Arg Asn Phe Tyr

20 25 30

Glu Ser Glu Phe Leu Gln Ala Val Lys Glu Ile Phe Asp Ser Leu Val

35 40 45

Pro Val Leu Ala Arg His Pro Lys Tyr Ile Glu His Arg Ile Leu Glu

50 55 60

Arg Ile Ala Glu Pro Glu Arg Met Ile Thr Phe Arg Val Pro Trp Val

65 70 75 80

Asp Asp Glu Gly Asn Ile Arg Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Phe

85 90 95

Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Pro Ser

100 105 110

Val Asn Ala Ser Ile Ile Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys

115 120 125

Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asp

130 135 140

Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Arg Glu Ile Met Ser Phe Thr Gln

145 150 155 160

Ser Phe Met Asn Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Thr Asp Ile

165 170 175

Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Val Gly Phe Met Phe

180 185 190

Gly Gln Tyr Lys Lys Ile Arg Gly Arg Tyr Asp Ala Gly Val Leu Thr

195 200 205

Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Gly Gly Ser Leu Thr Arg Lys Glu Ala Thr

210 215 220

Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Val Glu Glu Met Leu Lys Asp Gln Gly

225 230 235 240

Met Arg Phe Glu Asn Ser Thr Val Val Val Ser Gly Ser Gly Asn Val

245 250 255

Ala Leu Tyr Ala Met Glu Lys Ala Ala Gln Phe Gly Ala Lys Val Val

260 265 270

Ala Cys Ser Glu Trp Asp Gly Tyr Val Tyr Asp Glu Lys Gly Ile Cys

275 280 285

Leu Glu Thr Val Lys Arg Leu Lys Glu Asp Gly Asn Gly Arg Ile Arg

290 295 300

Glu Tyr Val Ser Glu His Pro Glu Ala His Tyr Phe Glu Gly Cys Thr

305 310 315 320

Gly Ile Trp Ser Ile Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln

325 330 335

Asn Glu Ile Asp Glu Glu Ala Ala Glu Val Leu Ile Ser Asn Gly Val

340 345 350

Lys Ala Val Gly Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Glu Glu Gly Ala Val

355 360 365

Lys Arg Phe Leu Asp Ala Gly Val Leu Phe Gly Pro Ala Lys Ala Ala

370 375 380

Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Ala Leu Glu Met Ala Gln Asn Ser

385 390 395 400

Ala Arg Leu His Trp Thr Ala Glu Glu Thr Asp Ala Lys Leu Arg Ala

405 410 415

Ile Met Ala Asp Ile His Lys Arg Ser Val Glu Ala Ala Ser Glu Tyr

420 425 430

Gly Arg Pro Gly Asn Leu Leu Asp Gly Cys Asn Ile Ala Gly Phe Ile

435 440 445

Lys Val Ala Asp Ala Met Ile Ala Gln Gly Val Val

450 455 460

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcatacgc tagaaaaaat ggagcaaaca aatttccaga cggcgagaga ttatgtgaca 60

caagcatacg agacagtaca gaagcgaaat ttttacgaaa gcgaatttct tcaagctgta 120

aaggaaatat ttgattccct tgtccctgta ttggcaaggc atccaaagta tatcgaacac 180

cgcattcttg agaggatcgc agagccggaa cggatgatca ccttcagggt gccgtgggtc 240

gatgatgaag gcaatatccg ggttaaccga gggttccggg ttcaatttaa cagtgcaatc 300

ggtccgtata aaggcggcat ccgctttcac ccttctgtga acgcgagcat tattaaattt 360

ttgggttttg agcagatttt taaaaattct ttgaccggac tgccgatcgg aggcggaaaa 420

ggcggggctg attttgatcc gaagggcaaa tcggacaggg agattatgag ttttacgcag 480

agcttcatga atgaactgta cagacatatc ggaccggaca cggatatccc tgccggcgat 540

attggtgtcg gagcaaggga agtcgggttt atgttcggac agtataaaaa gattcggggc 600

cgctatgatg caggcgtgtt aacaggcaaa ggccttgaat acgggggcag tttaacgagg 660

aaagaagcga cagggtacgg tctggtttat ttcgtggaag aaatgctgaa ggatcagggg 720

atgcgctttg aaaacagcac cgttgtcgtc tccggttcag ggaatgtggc gctgtacgcg 780

atggaaaaag ccgctcaatt cggtgcgaag gtggtggcct gcagcgaatg ggacggctat 840

gtctatgacg aaaaaggcat ctgtcttgag acggtgaagc ggctcaaaga agacgggaac 900

ggaaggattc gcgagtatgt cagcgagcat ccggaagcac actatttcga gggatgtacc 960

ggcatttggt ctattccatg cgatatcgcg cttccgtgcg cgacccagaa cgaaattgac 1020

gaagaggcgg ccgaagtgct catttcaaat ggggtcaaag ctgtcggaga aggagcaaat 1080

atgccgtctg aagagggcgc cgtcaaacgc tttttggatg cgggagttct attcggaccg 1140

gctaaggctg caaatgccgg cggtgtagcc gtttcagcgc tcgaaatggc gcagaacagc 1200

gcacggcttc actggacggc ggaagaaacg gatgcgaagc tcagggcgat catggctgat 1260

attcacaaga gaagcgttga agcggcttca gaatacggac ggcccggaaa tctgctcgac 1320

ggctgcaata tagccggatt tatcaaagtg gcggatgcga tgatcgctca gggagtcgtt 1380

taa 1383

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagcggctg atgaaggt 18

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctccatttt ttctagcgta tgcactaaca ggcacgccaa aag 43

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgctcaggg agtcgtttaa tcacctggaa gtcttagcg 39

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcaaaaaca gaagggggag ga 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagattattc gtaaagccga gatg 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgtctcccg tgtctttacc cg 22