阅读说明：本技术 一种聚谷氨酸的生产工艺 (Production process of polyglutamic acid ) 是由 洪立芝 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚谷氨酸的生产工艺,其包括：蜡样芽孢杆菌1205和解淀粉芽孢杆菌SFPG-123共发酵生产低分子聚谷氨酸；所述蜡样芽孢杆菌菌株的保藏号为：CCTCC NO:M2012382。所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为：CGMCC N0.3447。本公司研发团队在菌株筛选中发现,该株蜡样芽孢杆菌1205可以促进解淀粉芽孢杆菌SFPG-123生产聚谷氨酸的效率,并且显著降低分子量,可以一次性发酵得到低分子量,高生物活性的聚谷氨酸,而不需要进一步加工,节省成本和时间。(The invention discloses a production process of polyglutamic acid, which comprises the following steps: co-fermenting the bacillus cereus1205 and the bacillus amyloliquefaciens SFPG-123 to produce low-molecular polyglutamic acid; the preservation number of the bacillus cereus strain is as follows: CCTCC NO: M2012382. The preservation number of the bacillus amyloliquefaciens is as follows: CGMCC N0.3447. The research and development team of the company discovers that the strain of the bacillus cereus1205 can promote the efficiency of producing polyglutamic acid by the bacillus amyloliquefaciens SFPG-123, obviously reduce the molecular weight, can obtain the polyglutamic acid with low molecular weight and high biological activity by one-time fermentation without further processing, and saves the cost and time.)

一种聚谷氨酸的生产工艺

技术领域

本发明涉及一种聚谷氨酸的生产工艺，尤其涉及一种利用微生物生产低分子聚谷氨酸的生产工艺。

背景技术

γ-聚谷氨酸[poly(gamma-glutamic acid)，γ-PGA]是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的聚氨基酸化合物，虽然是氨基酸的聚合物，但由于连接方式不同于一般的多聚肽，其在结构和功能上与蛋白质不同。

由微生物发酵法制备的γ-PGA的相对分子质量(Mr)一般约100×10³～10 000×10³，每个γ-PGA分子由约500～5000个单位的谷氨酸单体组成，不同Mr的γ-PGA有不同的应用。通常，Mr增大，溶液黏度增大，其流变性越难控制，同时也越难被化学试剂修饰，最终限制了γ-PGA的生产及应用。

γ-PGA主链上存在大量肽键，在自然界或人体内可生物降解成短肽小分子和氨基酸单体，不产生毒副作用，分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基(-COOH)，易于和一些药物结合生成稳定的复合物，具有优良的生物兼容性和生物降解性，是理想的可生物吸收的医药用高分子材料。

γ-PGA水胶是一种无色、无味、透明且柔软的胶质，其独有的三维空间格子结构，使其吸水保湿性超强，十分适合在化妆品中提高保湿效果。但是，聚谷氨酸过强的吸水保湿性能，导致寒冷干燥环境下，易发生争夺皮肤自身水分的情况，使皮肤表面出现干燥和皲裂等不适。调节γ-PGA吸水性的一个方法是适度降解获得低分子γ-PGA。

本发明旨在提出一种利用微生物生产低分子聚谷氨酸的生产工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物生产低分子聚谷氨酸的生产工艺。

中国专利201010150439公开过一株高产γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌，该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123，所述菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.3447；其中所产的高分子聚合物经分析鉴定为γ-聚谷氨酸。该菌株可转化谷氨酸、柠檬酸等生成γ-聚谷氨酸；单位体积发酵液中γ-聚谷氨酸产率可达15-20g/L。

但是在生产中发现，该菌株产生的γ-聚谷氨酸相对分子质量(Mr)偏高，大约在2500-2600×10³，产物粘度大，后期加工困难。

本公司研发团队在研究中发现，采取特定菌株共发酵的方法，可以显著降低产物γ-聚谷氨酸的分子量，此外还能进一步提高产量，缩短发酵时间。

中国专利2012105218189公开过一种蜡样芽孢杆菌菌株，该菌种已于2012年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO:M2012382，名称为：蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus1205)。该菌株的已知功能为烟草疫霉有抑制作用。

本公司研发团队在菌株筛选中发现，该株蜡样芽孢杆菌1205可以显著促进解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123生产聚谷氨酸的效率，并且显著降低分子量，共发酵可以一次性发酵得到低分子量，高生物活性的聚谷氨酸，而不需要进一步水解加工即可获得生物活性高的小分子聚谷氨酸，节省成本和时间。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，其包括：

蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus 1205)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFPG-123共发酵生产低分子聚谷氨酸。

所述蜡样芽孢杆菌菌株的保藏号为：CCTCC NO:M2012382。

所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为：CGMCC N0.3447。

作为优选，所述生产方法步骤如下：

(1)分别活化：

将蜡样芽孢杆菌1205和解淀粉芽孢杆菌SFPG-123分别进行活化，所使用的培养基为标准MRS肉汤培养基；活化条件为37℃摇床培养12h；

(2)种子培养：

将活化的菌种转接至种子培养基中，37℃，170rpm振荡培养12小时；

种子培养基：L-谷氨酸20g/L，葡萄糖60g/L，NaCl 0.5g，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

调节种子液的菌量为：10⁷cfu/mL；

(2)摇瓶发酵：

按照解淀粉芽孢杆菌SFPG-123为2％的接种量，蜡样芽孢杆菌1205为1％的接种量，接入到发酵罐中，38℃进行通风搅拌培养33-60小时；

发酵培养基配方为：

柠檬酸钠30g/L，谷氨酸钠20g/L，氯化铵7g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

(3)聚谷氨酸分离：

将发酵液调pH至6，8000rpm，4℃离心20分钟取出菌体，用4倍体积无水乙醇沉淀上清液，6000rpm，4℃离心20分钟得到沉淀。用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻真空干燥，得到所产γ-聚谷氨酸粗品。

本发明γ-聚谷氨酸分子量的测定方法：

采用凝胶渗透色谱法测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量。

聚谷氨酸的产率计算为：分离得到的粗品聚谷氨酸(g)/发酵液(L)。

本发明的优点：

本公司研发团队在菌株筛选中发现，该株蜡样芽孢杆菌1205可以促进解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123生产聚谷氨酸的效率(发酵时间从大约55小时缩短到33小时左右)，并且显著降低分子量，可以一次性发酵得到低分子量，高生物活性的聚谷氨酸，而不需要进一步加工，节省成本和时间。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

实施例1

一种聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，其包括：

蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus 1205)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFPG-123共发酵生产低分子聚谷氨酸。

所述蜡样芽孢杆菌菌株的保藏号为：CCTCC NO:M2012382。

所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为：CGMCC N0.3447。

所述生产方法步骤如下：

(1)分别活化：

将蜡样芽孢杆菌1205和解淀粉芽孢杆菌SFPG-123分别进行活化，所使用的培养基为标准MRS肉汤培养基；活化条件为37℃摇床培养12h；

(2)种子培养：

将活化的菌种转接至种子培养基中，37℃，170rpm振荡培养12小时；

种子培养基：L-谷氨酸20g/L，葡萄糖60g/L，NaCl 0.5g，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

调节种子液的菌量为：10⁷cfu/mL；

(2)摇瓶发酵：

按照解淀粉芽孢杆菌SFPG-123为2％的接种量，蜡样芽孢杆菌1205为1％的接种量，接入到发酵罐中，38℃进行通风搅拌培养55小时；

发酵培养基配方为：

柠檬酸钠30g/L，谷氨酸钠20g/L，氯化铵7g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

(3)聚谷氨酸分离：

将发酵液调pH至6，8000rpm，4℃离心20分钟取出菌体，用4倍体积无水乙醇沉淀上清液，6000rpm，4℃离心20分钟得到沉淀。用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻真空干燥，得到所产γ-聚谷氨酸粗品。

分别在摇瓶发酵33小时和55小时测试聚谷氨酸的产率和分子量。

实施例2：

实验方法同实施例1，但是不加入蜡样芽孢杆菌1205。

一种聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，其包括：

发酵生产低分子聚谷氨酸。

所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为：CGMCC N0.3447。

所述生产方法步骤如下：

(1)活化：

将解淀粉芽孢杆菌SFPG-123进行活化，所使用的培养基为标准MRS肉汤培养基；活化条件为37℃摇床培养12h；

(2)种子培养：

将活化的菌种转接至种子培养基中，37℃，170rpm振荡培养12小时；

种子培养基：L-谷氨酸20g/L，葡萄糖60g/L，NaCl 0.5g，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

调节种子液的菌量为：10⁷cfu/mL；

(2)摇瓶发酵：

按照解淀粉芽孢杆菌SFPG-123为2％的接种量接入到发酵罐中，38℃进行通风搅拌培养55小时；

发酵培养基配方为：

柠檬酸钠30g/L，谷氨酸钠20g/L，氯化铵7g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，生物素5×10^-4g/L，pH7.0；

(3)聚谷氨酸分离：

将发酵液调pH至6，8000rpm，4℃离心20分钟取出菌体，用4倍体积无水乙醇沉淀上清液，6000rpm，4℃离心20分钟得到沉淀。用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻真空干燥，得到所产γ-聚谷氨酸粗品。

分别在摇瓶发酵33小时和55小时测试聚谷氨酸的产率和分子量。

实施例3：

实验方法同实施例1，将蜡样芽孢杆菌1205替换为蜡样芽孢杆菌GIM 1.778(购买获得)，活化处理方法同实施例1。

分别在摇瓶发酵33小时和55小时测试聚谷氨酸的产率和分子量。

实施例4：

实验方法同实施例1，将蜡样芽孢杆菌1205替换为枯草芽孢杆菌GIM1.1750(购买获得)，活化处理方法同实施例1。

分别在摇瓶发酵33小时和55小时测试聚谷氨酸的产率和分子量。

实施例5

采用紫外光谱法，将粗制品盐酸水解后使用HCLP等方法确定该发酵产物为γ-聚谷氨酸。

γ-聚谷氨酸分子量和产率的测定：采用凝胶渗透色谱法测定实施例1-4中发酵粗产物中的γ-聚谷氨酸的分子量，比较不同实施例组别每升发酵液中的谷氨酸产量，聚谷氨酸的产率计算为：分离得到的粗品聚谷氨酸(g)/发酵液(L)。每个实验重复5次取平均值。

结果如表1和表2所示。

表1不同实施例组别摇瓶发酵33h时γ-聚谷氨酸分子量和产率的测定

组别	分子量(Mr)	γ-聚谷氨酸产率g/L
			实施例1	约(102.1±1.8)×10<sup>3</sup>	24.7±2.8
实施例2	约(2507.7±59.9)×10<sup>3</sup>	11.9±0.9
			实施例3	约(2582.8±69.1)×10<sup>3</sup>	12.2±1.0
实施例4	约(2511.5±65.91)×10<sup>3</sup>	12.1±1.1

表2不同实施例组别摇瓶发酵55h时γ-聚谷氨酸分子量和产率的测定

组别	分子量(Mr)	γ-聚谷氨酸产率g/L
			实施例1	约(103.8±1.7)×10<sup>3</sup>	27.6±2.5
实施例2	约(2513.5±61.3)×10<sup>3</sup>	18.9±0.9
			实施例3	约(2599.8±75.3)×10<sup>3</sup>	20.2±0.8
实施例4	约(2517.6±65.2)×10<sup>3</sup>	19.1±0.7

结果可见：

(1)实施例2为单用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123，产生的γ-聚谷氨酸分子量偏高，大约在2500×10³，并且产量最低。而当解淀粉芽孢杆菌SFPG-123合用蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus 1205)时候(实施例1)，不但显著降低分子量，一次性发酵得到低分子量，而且还能明显提高产量。实施例3和4显示使用其他细菌或者其他亚种的蜡样芽孢杆菌发酵都不能得到小分子量的聚谷氨酸，并且产量没有明显变化，可能的机制是蜡样芽孢杆菌1205菌株对解淀粉芽孢杆菌SFPG-123产聚谷氨酸的酶有特异性的刺激活化作用，同时还有分泌一些限制聚谷氨酸长链形成的物质或者能降解高分子聚谷氨酸的可能性，使得γ-聚谷氨酸分子量变小。

(2)本发明发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123合用蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus 1205)，不但能够得到更小分子量的γ-聚谷氨酸，而且还能明显提高产量。

(3)本发明发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SFPG-123合用蜡样芽孢杆菌1205(Bacillus cereus 1205)还能将发酵时间从55小时左右缩短到30多小时，产率就能够达到20g/L以上，显著提高了效率，降低了成本。可能的机制是蜡样芽孢杆菌1205菌株对解淀粉芽孢杆菌SFPG-123产聚谷氨酸的酶有特异性的刺激活化作用。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。