阅读说明：本技术 一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法 (Method for extracting rice starch and rice active peptide from rice ) 是由 宫智勇 吴永宁 张�荣 王泽宇 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法,包括以下步骤：将大米粉与水混合后,调节pH值呈碱性,然后搅拌浸提并分离上清液和沉淀物；分别对所述上清液和沉淀物进行纯化后干燥粉碎,对应制得大米蛋白粉和大米淀粉；将所述大米蛋白粉进行酶解处理后收集酶解液,得到大米粗肽提取液；对所述大米粗肽提取液进行纯化,制得大米活性肽。本发明先在碱性条件下从大米粉中分离出大米淀粉和大米蛋白粉,然后以大米蛋白粉为原料,通过酶解法制成大米肽粗提液,再对大米肽粗提液进行纯化,制得大米活性肽,工艺简便,耗时较短且提取率高,不仅提高了大米多肽的提取效率,同时还副产大米淀粉,提高了原料利用率。(The invention discloses a method for extracting rice starch and rice active peptide from rice, which comprises the following steps: mixing rice flour with water, adjusting pH to alkaline, stirring, leaching, and separating supernatant and precipitate; purifying the supernatant and the precipitate respectively, drying and crushing to obtain rice protein powder and rice starch correspondingly; carrying out enzymolysis treatment on the rice protein powder, and collecting enzymolysis liquid to obtain a rice crude peptide extracting solution; and purifying the rice crude peptide extracting solution to prepare the rice active peptide. According to the invention, rice starch and rice protein powder are separated from rice flour under an alkaline condition, then the rice protein powder is taken as a raw material to prepare a rice peptide crude extract through an enzymolysis method, and then the rice peptide crude extract is purified to prepare the rice active peptide.)

一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法。

背景技术

现有技术中制取大多肽时，多通过强酸水解的方法进行，以大米饲料蛋白为原料，采用酸法研究水解的工艺，得到的最优条件为：温度90℃、盐酸浓度25％的条件下水解20h，此时大米饲料蛋白水解率可达到52.85％。不过由于此时酸度过高，工业化生产中会产生大量废水，造成极大的环境污染，并且饲料蛋白的利用率也较低。

除强酸水解之外，还有采用中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶和两种碱性蛋白酶这5种酶水解米渣蛋白，制取大米多肽的方法，以提取率和水解度为指标，结果表明胰酶的作用效果最好，但方法耗时太长，效率不高。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法，旨在提高大米多肽的制取效率。

为实现上述目的，本发明提出一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法，包括以下步骤：

将大米粉与水混合后，调节pH值呈碱性，然后搅拌浸提并分离上清液和沉淀物；

分别对所述上清液和沉淀物进行纯化后干燥粉碎，对应制得大米蛋白粉和大米淀粉；

将所述大米蛋白粉进行酶解处理后收集酶解液，得到大米粗肽提取液；

对所述大米粗肽提取液进行纯化，制得大米活性肽。

可选地，将大米粉与水混合后，调节pH值呈碱性，然后搅拌浸提并分离上清液和沉淀物的步骤，包括：

将大米粉与水混合后，加入NaOH溶液调节pH为10.5～11.5，然后在45～55℃温度下搅拌浸取3～5h，再分离并对应收集上清液和沉淀物。

可选地，将大米粉与水混合后，加入NaOH溶液调节pH为10.5～11.5，然后在45～55℃温度下搅拌浸取3～5h，再分离并对应收集上清液和沉淀物的步骤中：

所述大米粉与水的料液质量比为1：(5～7)；和/或，

所述NaOH溶液的质量浓度为0.05～0.2％；和/或，

所述大米粉由被镉污染的大米制得。

可选地，分别对所述上清液和沉淀物进行纯化后干燥粉碎，对应制得大米蛋白粉和大米淀粉的步骤，包括：

调节所述上清液的pH值为4.0～5.5，然后分离出固体沉淀并洗涤，经过冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉；

将所述沉淀物洗涤后，去除其中的黄色固体物质，然后干燥并粉碎，得到大米淀粉。

可选地，将所述大米蛋白粉进行酶解处理后收集酶解液，得到大米粗肽提取液的步骤，包括：

将所述大米蛋白粉制成大米蛋白悬浮液，向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，在搅拌作用下进行第一次酶解，得到第一次酶解产物；

向所述第一次酶解产物中加入胰蛋白酶进行第二次酶解，酶解结束后灭酶，然后分离并收集上清液，得到酶解液，即为大米粗肽提取液。

可选地，将所述大米蛋白粉制成大米蛋白悬浮液，向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，在搅拌作用下进行第一次酶解，得到第一次酶解产物的步骤中：

所述大米蛋白悬浮液中，所述大米蛋白粉的质量浓度为7～8％；和/或，

所述碱性蛋白酶的添加量为所述大米蛋白粉质量的1.5～2.5％；和/或，

所述第一次酶解的酶解pH值为8.5～9.5，酶解温度为53～57℃，酶解时间为110～130min。

可选地，向所述第一次酶解产物中加入胰蛋白酶进行第二次酶解，酶解结束后灭酶，然后分离并收集上清液，得到酶解液，即为大米粗肽提取液的步骤中：

所述胰蛋白酶的添加量为所述大米蛋白粉质量的1.5～2.5％；和/或，

所述第二次酶解的酶解pH值为7.0～8.0，酶解温度为35～40℃，酶解时间为20～40min。

可选地，对所述大米粗肽提取液进行纯化，制得大米活性肽的步骤，包括：

将所述大米粗肽提取液稀释后，使用超滤膜进行超滤，收集渗透液并冷冻干燥，得小分子肽；

将小分子肽溶解于水中制成肽溶液，注入层析柱中后，先使用超纯水淋洗层析柱，再使用乙醇洗脱层析柱，收集洗脱液并真空冷冻干燥，制得大米活性肽。

可选地，将所述大米粗肽提取液稀释后，使用超滤膜进行超滤，收集渗透液并冷冻干燥，得小分子肽的步骤中：

所述超滤膜的截留分子量为3000，使用所述超滤进行超滤时的操作压力为0.05～0.2MPa。

可选地，将小分子肽溶解于水中制成肽溶液，注入层析柱中后，先使用超纯水淋洗层析柱，再使用乙醇洗脱层析柱，收集洗脱液并真空冷冻干燥，制得大米活性肽的步骤中：

所述肽溶液中小分子肽的质量浓度为8～12mg/mL；和/或，

所述层析柱中的吸附树脂型号为DA201-C。

本发明提供的技术方案中，先在碱性条件下从大米粉中分离出大米淀粉和大米蛋白粉，然后以大米蛋白粉为原料，通过酶解法制成大米肽粗提液，再对大米肽粗提液进行纯化，制得大米活性肽，工艺简便，耗时较短且提取率高，不仅提高了大米多肽的提取效率，同时还副产大米淀粉，提高了原料利用率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法的一实施例的流程示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法，图1所示为本发明提供的从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述从大米中提取大米淀粉和大米活性肽的方法包括以下步骤：

步骤S10、将大米粉与水混合后，调节pH值呈碱性，然后搅拌浸提并分离上清液和沉淀物；

将大米粉与水混合后，加入NaOH溶液调节pH为10.5～11.5，然后使用磁力搅拌器在45～55℃的温度下搅拌浸取3～5h，再分离并对应收集上清液和沉淀物，分离方式可以是过滤或离心等方式，以离心为例(本文中以下所有涉及固液分离的方式均以离心处理为例进行说明)，可以以4000r/min的转速离心20min，分离得到的上清液为大米蛋白提取液，沉淀物为粗淀粉。

进一步地，在步骤S10中，所述大米粉与水的料液质量比为1：(5～7)，既能有效浸取出大米蛋白，又能避免导致产生过多量的废水。所述NaOH溶液的质量浓度为0.05～0.2％，可快速对大米粉溶液的pH值进行调节，同时避免NaOH溶液浓度过高导致存在操作隐患的问题。本发明实施例所提供的方法，不仅适用于所有的大米原料，还适用于被镉污染的大米，可以有效的从被镉污染的大米中提取出大米淀粉和大米多肽，且在提取过程中能够将镉含量降低至食用安全范围内，如此，使得被镉污染的大米得以有效利用。

步骤S20、分别对所述上清液和沉淀物进行纯化后干燥粉碎，对应制得大米蛋白粉和大米淀粉；

在本实施例中，步骤S20包括：

步骤S21、调节所述上清液的pH值为4.0～5.5，然后分离出固体沉淀并洗涤，经过冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉；

将所述上清液调节pH值至4.0～5.5进行酸降，然后在4000r/min下离心20～30min，水洗沉淀3次后得到大米蛋白，将其冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉，储存在干燥器中备用。

步骤S22、将所述沉淀物洗涤后，去除其中的黄色固体物质，然后干燥并粉碎，得到大米淀粉。

将所述沉淀物用水洗涤3次，然后仔细去除黄色粉末后得到大米淀粉，将其置于烘箱中干燥，然后粉碎，得到大米淀粉，储存在干燥器中备用。

步骤S30、将所述大米蛋白粉进行酶解处理后收集酶解液，得到大米粗肽提取液；

在本实施例中，步骤S30包括：

步骤S31、将所述大米蛋白粉制成大米蛋白悬浮液，向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，在搅拌作用下进行第一次酶解，得到第一次酶解产物；

称取一定量制得的大米蛋白粉，按照蛋白质量浓度7～8％的比例与水混合，配制成大米蛋白悬浮液；然后向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，加酶量为所述大米蛋白质量的1.5～2.5％；再调节pH值为8.5～9.5，在53～57℃的温度下搅拌酶解110～130min，得到第一次酶解产物。

步骤S32、向所述第一次酶解产物中加入胰蛋白酶进行第二次酶解，酶解结束后灭酶，然后分离并收集上清液，得到酶解液，即为大米粗肽提取液。

向第一次酶解的产物中加入胰蛋白酶，加酶量为所述大米蛋白粉质量的1.5～2.5％；然后调节pH值为7.0～8.0，在35～40℃的温度下搅拌酶解20～40min；酶解完毕后，调节pH值为4.0～5.0灭酶，然后将酶解产物在4000r/min下离心10～15min，分离得到的上清液为最终需要的酶解液，即为大米肽粗提液。

步骤S40、对所述大米粗肽提取液进行纯化，制得大米活性肽。

在本实施例中，步骤S40包括：

步骤S41、将所述大米粗肽提取液稀释后，使用超滤膜进行超滤，收集渗透液并冷冻干燥，得小分子肽；

将得到的大米肽粗提液用水稀释到2.0L，在室温下，以一定的流速通过截留分子量为3000的聚砜卷式超滤膜进行超滤，操作压力为0.05～0.2MPa，得到相对分子量为3000以下的渗透液(为小分子肽)和相对分子量3000以上的浓缩液(为大分子肽)，将所述渗透液冷冻干燥得到小分子肽。

步骤S42、将小分子肽溶解于水中制成肽溶液，注入层析柱中后，先使用超纯水淋洗层析柱，再使用乙醇洗脱层析柱，收集洗脱液并真空冷冻干燥，制得大米活性肽。

将经过超滤后得到的小分子肽进行脱盐纯化：将干燥好的小分子肽溶解在水中，配制成小分子肽质量浓度为8～12mg/mL的肽溶液，于室温下注入层析柱内，所述层析柱为3.5cm×50cm的玻璃层析柱，内部填充有处理好的DA201-C树脂，注入流速为0.5～0.6mL/min，用紫外检测器检测流出液的A220nm(220nm处的吸光度)，以A220nm＝0.05为透过点停止上样；然后先使用超纯水淋洗层析柱，流速为0.5～0.6mL/min，当检测淋洗液的电导率与超纯水基本一致时，停止淋洗；然后使用75％的乙醇洗脱层析柱，流速为0.5～0.6mL/min，以洗脱液紫外检测A220nm＝0.05为洗脱终点，收集洗脱液，旋转蒸发除去乙醇并浓缩，最后经过真空冷冻干燥后得到纯化的大米活性肽。

本发明提供的技术方案中，先在碱性条件下从大米粉中分离出大米淀粉和大米蛋白粉，然后以大米蛋白粉为原料，通过酶解法制成大米肽粗提液，再对大米肽粗提液进行纯化，制得大米活性肽，工艺简便，耗时较短且提取率高，不仅提高了大米多肽的提取效率，同时还副产大米淀粉，提高了原料利用率；而且还可以适用于从被镉污染的大米中提取大米淀粉和大米活性肽，提高了被镉污染的大米的利用价值。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)将大米粉(由被镉污染的大米制得)与水以1:6的料液质量比混合后，加入质量浓度为0.1％的NaOH溶液调节pH为11.0，然后使用磁力搅拌器在50℃的温度下搅拌浸取4h，将浸取液装入到离心管中，以4000r/min的转速离心20min，分离得到的上清液为大米蛋白提取液，沉淀物为粗淀粉。

(2)将步骤(1)得到的上清液调节pH值至4.5进行酸降，然后在4000r/min下离心20min，水洗沉淀3次后得到大米蛋白，将其冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉，储存在干燥器中备用；将步骤(1)得到的沉淀物用水洗涤3次，然后仔细去除黄色粉末后得到大米淀粉，将其置于烘箱中干燥，然后粉碎，得到大米淀粉，储存在干燥器中备用。

(3)按照蛋白质量浓度7.5％的比例，将制得的大米蛋白粉与水混合，配制成大米蛋白悬浮液；然后向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的2％，调节pH值为9.0，在55℃的温度下搅拌酶解120min；然后再加入胰蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的2％，调节pH值为7.5，在37℃的温度下搅拌酶解30min；酶解完毕后，调节pH值为4.5灭酶，然后将酶解液在4000r/min下离心10min，分离得到的上清液即为大米肽粗提液。

(4)将得到的大米肽粗提液用水稀释到2.0L，在室温下，以一定的流速通过截留分子量为3000的聚砜卷式超滤膜进行超滤，操作压力为0.1MPa，得到相对分子量为3000以下的渗透液(为小分子肽)和相对分子量3000以上的浓缩液(为大分子肽)，将所述渗透液冷冻干燥得到小分子肽。

(5)将干燥好的小分子肽溶解在水中，配制成小分子肽质量浓度为8～12mg/mL的肽溶液，于室温下注入层析柱内，所述层析柱为3.5cm×50cm的玻璃层析柱，内部填充有处理好的DA201-C树脂，注入流速为0.6mL/min，用紫外检测器检测流出液的A220nm(220nm处的吸光度)，以A220nm＝0.05为透过点停止上样；然后先使用超纯水淋洗层析柱，流速为0.6mL/min，当检测淋洗液的电导率与超纯水基本一致时，停止淋洗；然后使用75％的乙醇洗脱层析柱，流速为0.6mL/min，以洗脱液紫外检测A220nm＝0.05为洗脱终点，收集洗脱液，旋转蒸发除去乙醇并浓缩，最后经过真空冷冻干燥后得到纯化的大米活性肽。

实施例2

(1)将大米粉(由被镉污染的大米制得)与水以1:5的料液质量比混合后，加入质量浓度为0.05％的NaOH溶液调节pH为10.5，然后使用磁力搅拌器在45℃的温度下搅拌浸取5h，将浸取液装入到离心管中，以4000r/min的转速离心25min，分离得到的上清液为大米蛋白提取液，沉淀物为粗淀粉。

(2)将步骤(1)得到的上清液调节pH值至4.0进行酸降，然后在4000r/min下离心25min，水洗沉淀3次后得到大米蛋白，将其冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉，储存在干燥器中备用；将步骤(1)得到的沉淀物用水洗涤3次，然后仔细去除黄色粉末后得到大米淀粉，将其置于烘箱中干燥，然后粉碎，得到大米淀粉，储存在干燥器中备用。

(3)按照蛋白质量浓度7～8％的比例，将制得的大米蛋白粉与水混合，配制成大米蛋白悬浮液；然后向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的1.5％，调节pH值为8.5，在53℃的温度下搅拌酶解130min；然后再加入胰蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的1.5％，调节pH值为7.0，在35℃的温度下搅拌酶解40min；酶解完毕后，调节pH值为4.0灭酶，然后将酶解液在4000r/min下离心15min，分离得到的上清液即为大米肽粗提液。

(4)将得到的大米肽粗提液用水稀释到2.0L，在室温下，以一定的流速通过截留分子量为3000的聚砜卷式超滤膜进行超滤，操作压力为0.05MPa，得到相对分子量为3000以下的渗透液(为小分子肽)和相对分子量3000以上的浓缩液(为大分子肽)，将所述渗透液冷冻干燥得到小分子肽。

(5)将干燥好的小分子肽溶解在水中，配制成小分子肽质量浓度为8～12mg/mL的肽溶液，于室温下注入层析柱内，所述层析柱为3.5cm×50cm的玻璃层析柱，内部填充有处理好的DA201-C树脂，注入流速为0.5mL/min，用紫外检测器检测流出液的A220nm(220nm处的吸光度)，以A220nm＝0.05为透过点停止上样；然后先使用超纯水淋洗层析柱，流速为0.5mL/min，当检测淋洗液的电导率与超纯水基本一致时，停止淋洗；然后使用75％的乙醇洗脱层析柱，流速为0.5mL/min，以洗脱液紫外检测A220nm＝0.05为洗脱终点，收集洗脱液，旋转蒸发除去乙醇并浓缩，最后经过真空冷冻干燥后得到纯化的大米活性肽。

实施例3

(1)将大米粉(由被镉污染的大米制得)与水以1:7的料液质量比混合后，加入质量浓度为0.2％的NaOH溶液调节pH为11.5，然后使用磁力搅拌器在55℃的温度下搅拌浸取3h，将浸取液装入到离心管中，以4000r/min的转速离心30min，分离得到的上清液为大米蛋白提取液，沉淀物为粗淀粉。

(2)将步骤(1)得到的上清液调节pH值至5.5进行酸降，然后在4000r/min下离心30min，水洗沉淀3次后得到大米蛋白，将其冷冻干燥后粉碎，得到大米蛋白粉，储存在干燥器中备用；将步骤(1)得到的沉淀物用水洗涤3次，然后仔细去除黄色粉末后得到大米淀粉，将其置于烘箱中干燥，然后粉碎，得到大米淀粉，储存在干燥器中备用。

(3)按照蛋白质量浓度7～8％的比例，将制得的大米蛋白粉与水混合，配制成大米蛋白悬浮液；然后向所述大米蛋白悬浮液中加入碱性蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的2.5％，调节pH值为9.5，在57℃的温度下搅拌酶解110min；然后再加入胰蛋白酶，加酶量为底物蛋白质量的2.5％，调节pH值为8.0，在40℃的温度下搅拌酶解20min；酶解完毕后，调节pH值为5.0灭酶，然后将酶解液在4000r/min下离心12min，分离得到的上清液即为大米肽粗提液。

(4)将得到的大米肽粗提液用水稀释到2.0L，在室温下，以一定的流速通过截留分子量为3000的聚砜卷式超滤膜进行超滤，操作压力为0.2MPa，得到相对分子量为3000以下的渗透液(为小分子肽)和相对分子量3000以上的浓缩液(为大分子肽)，将所述渗透液冷冻干燥得到小分子肽。

(5)将干燥好的小分子肽溶解在水中，配制成小分子肽质量浓度为8～12mg/mL的肽溶液，于室温下注入层析柱内，所述层析柱为3.5cm×50cm的玻璃层析柱，内部填充有处理好的DA201-C树脂，注入流速为0.55mL/min，用紫外检测器检测流出液的A220nm(220nm处的吸光度)，以A220nm＝0.05为透过点停止上样；然后先使用超纯水淋洗层析柱，流速为0.55mL/min，当检测淋洗液的电导率与超纯水基本一致时，停止淋洗；然后使用75％的乙醇洗脱层析柱，流速为0.55mL/min，以洗脱液紫外检测A220nm＝0.05为洗脱终点，收集洗脱液，旋转蒸发除去乙醇并浓缩，最后经过真空冷冻干燥后得到纯化的大米活性肽。

在上述实施例1至3中，计算在整个提取过程中的产物提取率以及镉含量，方法如下：

(1)称量冷冻干燥后的大米淀粉和大米蛋白粉的质量，用总淀粉测定试剂盒测定淀粉含量，元素分析仪测定其蛋白质含量，计算大米淀粉、大米蛋白得率和提取率，计算公式为：

大米蛋白得率(％)＝目的物提取质量(g)×目的物含量(％)/原料质量(g)×100；大米蛋白提取率(％)＝目的物提取质量(g)×目的物含量(％)/原料中目的物质质量质量(g)×100。

(2)测定冷冻干燥后的小分子肽中的肽含量和镉含量，计算大米粗肽得率和小分子肽得率，计算公式为：

大米粗肽得率(％)＝大米粗肽提取液中肽含量(g/L)×定容体积(L)/大米蛋白质量(g)×100；

小分子肽得率(％)＝小分子肽质量(g)/大米蛋白质量(g)×100。

(3)测定经过真空冷冻干燥获得的大米活性肽的质量及其肽含量和镉含量。

提取过程中各中间产物的含量计算结果如表1所示，提取过程中镉含量分布计算结果如表2所示。

表1提取过程中各中间产物的含量

表2提取过程中镉含量分布

由上述表1中的结果可知，本发明实施例不仅可以从被镉污染的大米中成功提取出出大米多肽，同时还副产大米淀粉，且提取出的大米多肽和大米淀粉的镉含量满足食品相关标准要求；而且在实施例1至3中，随着pH的升高，大米蛋白及分子肽的提取率在下降，而镉含量也在提高，其中以实施例1的提取率最高且镉含量最低，说明选取合适的pH值对提高大米蛋白及分子肽的提取率最高、以及降低镉含量有着非常重要的作用。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。