阅读说明：本技术 一种天然产物药物作用靶点的识别方法 (Method for identifying action target of natural product medicine ) 是由 李静 戚欣 买小圆 唐薇 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种天然产物药物作用靶点的识别方法。本发明包括以下步骤：1)取待测药物和对照溶剂分别添加于有效细胞中,共同孵育；2)置于30-80℃下,热处理3-10min,裂解,离心,得上清液；3)电泳,转印；4)采用广谱的蛋白抗体或染料分别染色,并对比,寻找蛋白稳定差异的条带；5)另取待测药物蛋白样电泳,将蛋白稳定差异的条带质谱分析,验证,得靶点。本发明是一种基于蛋白热稳定与广谱分子染色的天然产物药物作用靶点识别方法,可以高效、低成本、免标记地识别潜在的药物靶点,天然产物的用量少,发现潜在的药物靶点不仅可以推动疾病作用机制和药理学研究,还可以为药物潜在的副作用和药品的商业化提供指导信息。(The invention provides a method for identifying a natural product drug action target. The invention comprises the following steps: 1) adding the drug to be detected and the control solvent into the effective cells respectively, and incubating together; 2) placing at 30-80 deg.C, heat treating for 3-10min, cracking, centrifuging to obtain supernatant; 3) electrophoresis and transfer printing; 4) respectively staining by using broad-spectrum protein antibodies or dyes, comparing, and searching for bands with protein stability differences; 5) and carrying out electrophoresis on the drug protein sample to be detected, and carrying out mass spectrometry on the bands with protein stability difference and verifying to obtain a target spot. The invention relates to a natural product drug action target recognition method based on protein thermal stability and broad spectrum molecular dyeing, which can efficiently recognize potential drug targets at low cost in a label-free manner, the dosage of natural products is small, and the discovery of the potential drug targets can not only promote the research of disease action mechanisms and pharmacology, but also provide guidance information for the potential side effects of drugs and the commercialization of drugs.)

一种天然产物药物作用靶点的识别方法

技术领域

本发明涉及药物靶点识别的技术领域，特别是指一种天然产物药物作用靶点的识别方法。

背景技术

天然产物是指动物、植物提取物(简称植提)或昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分等，其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、甾体化合物、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分。具有独特的化学特性和广泛的生物活性的天然产物，往往具有设计合成文库时难以想象的新型作用模式，而成为新型药物先导物的重要来源。1981年至2014年，所有经批准的天然产物药物中，33％是天然产物或其直接半合成衍生物。由于生态环境的巨大差异，海洋天然产物比陆地生物的化学结构和生物活性更加丰富，是海洋药物的重要源泉。截止到2012年底，全世界已发现约2.5万个海洋天然产物。从2007开始，新海洋天然产物年平均发表量超过了1000个，这些已发现的海洋天然产物50％具有各种生物活性。更令人鼓舞的是，不断有全新骨架的海洋天然产物被报导。

新药或活性化合物作用靶点的早期明确，有助于针对靶点进行优化改造、建立适当的药物评价模型和寻找相应的适应症病人，提高药物研发成功率，推动新药的发现与创新。天然产物特别是海洋天然产物具有不易获取，产量较低，结构复杂，不易合成与标记，活性多样的特点，由于其结构和活性的多样性，天然产物作用靶点的寻找是新药研发的主要瓶颈之一，大大限制了我国天然产物的成药性。目前还没有非常有效的天然产物靶点发现方法。报道最多的方法是化学生物学方法，包括亲和纯化法：通过将天然产物直接跟琼脂糖珠子等不同的介质共价连接，也可以通过将天然产物与生物素通过化学反应进行耦联。该方法比较适于活性较高的天然产物化合物，该方法的最大缺点是需要对天然产物进行修饰，有可能会破坏其活性。光偶联等技术的应用也增加了靶标发现的几率，而很多天然天然产物难以从头全合成，限制了该方法的应用。上述方法还均需要较大量的天然产物，天然产物的微量提取不能满足上述方法的要求。此外报道的方法还包括一些基础生物学方法，如遗传筛选法、转录组、噬菌体展示、酵母三杂交、蛋白质组学法，但这些方法难以做到未知靶点蛋白的广泛筛选。目前报道的新方法是基于活性的蛋白质谱分析(activity-basedprotein profiling，ABPP)和药物亲和反应的靶点稳定性(drug affinityresponsive target stability，DARTS)都大大增加了靶点鉴定的机会。但是，ABPP只适合有催化活性的靶点以及共价修饰等特点大大限制了其的广谱性应用；而DARTS存在构象改变的依赖性以及无法鉴定低丰度靶点的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种天然产物药物作用靶点的识别方法，解决了现有技术中药物靶点识别方法存在构象改变的依赖性以及无法鉴定低丰度靶点等问题而使其无法应用于天然产物药物作用靶点识别。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：包括以下步骤：

1)样本收集，取待测药物溶解于溶剂中，得实验样；另取溶剂，作为对照样；将实验样、对照样分别添加于有效细胞中，共同孵育1-5h，分别得待测药物组样本和溶剂对照组样本；

2)热处理，将待测药物组样本和溶剂对照组样本，置于30-80℃下，热处理3-10min，裂解，离心，取上清液，分别得待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样；

3)电泳与转印，将待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样进行电泳，转印，得待测药物转印组和溶剂对照转印组；

4)染色，将待测药物转印组、溶剂对照转印组均采用广谱的蛋白抗体或染料进行染色，并进行对比，寻找蛋白稳定差异的条带；

5)质谱分析，另取待测药物蛋白样，进行电泳，将蛋白稳定差异的条带进行质谱分析，验证，得靶点。

本发明先将溶剂对照、待测药物分别与有效细胞共孵育，得悬浮细胞，如果有贴壁细胞则需要进行消化，悬浮细胞则不用消化；然后热处理细胞，在不同温度下处理不同时间，裂解，最后进行电泳与转印，采用广谱的分子染料和抗体进行染色，寻找差异性的蛋白条带位置，从对应的位置切下胶条，再进行质谱分析，寻找药物的作用靶点。本发明是一种基于蛋白热稳定与广谱分子染色的天然产物药物作用靶点识别方法，包括活性天然产物，天然产物无需提前标记，天然产物的用量少，微量用量，用量小于2mg即可；本发明的蛋白靶点包括细胞内低丰度靶点分子，具有广泛地寻找天然产物靶点的特点，本发明可以高效、低成本、免标记地识别潜在的药物靶点，发现潜在的药物靶点不仅可以推动疾病作用机制和药理学研究，还可以为药物潜在的副作用和药品的商业化提供指导信息。本发明的有效细胞是指预先通过活性筛选发现的待测药物作用后发生表型变化的那些细胞，这些筛选方法都现有技术，不同的疾病有不同的筛选方法；本发明针对天然产物药物作用靶点的识别方法，不仅适用于天然产物活性化合物和药物，也包括其它来源的活性化合物和化学药物的靶点识别。

作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，染色的具体操作为：a)取脱脂奶粉，采用1×TBST缓冲液配成5％的溶液，备用；b)取待测药物转印组和溶剂对照转印组，加上步骤a)所得的溶液，于摇床上，室温孵育1-2h；c)采用1×TBST缓冲液冲洗，加入蛋白抗体或染料，置于4℃下，孵育过夜；d)避光条件下，涂覆ECL发光试剂或染料底物，采用成像系统显影；e)待测药物转印组和溶剂对照转印组对比，寻找蛋白稳定差异的条带，记下分子量大小。本发明采用脱脂奶粉作为牛奶，用来区别特异性细胞和非特异性细胞，并采用广谱蛋白抗体或染料进行染色，适用性广，操作简单，显影明显，实验效果好；本发明中当使用蛋白抗体时需要涂覆ECL发光试剂进行显影，当使用染料时需要涂覆染料底物进行显影。TBST缓冲液是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，主要用于Western Blot实验中洗去膜上非特异性结合的抗体等试剂，1×PBST缓冲液为即用型，可以直接使用。ECL化学发光试剂是基于Luminol的新一代化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现或使用Luminometer检测。

作为一种优选的实施方案，所述蛋白抗体为酪氨酸蛋白激酶抗体，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抗体银染、生物素标记的凝集素中的任意一种。本发明的蛋白抗体适用范围广，使用方便，效果好。本发明在细胞膜上靶蛋白的寻找优选生物素标记的凝集素抗体，其中优选蓖麻凝集素RCA I。

作为一种优选的实施方案，所述步骤c)中，当加入蛋白抗体时，此时，蛋白抗体为一抗，一抗在孵育过夜之后，还包括以下操作：取二抗，采用1×TBST缓冲液将二抗稀释2000-5000倍；采用1×TBST缓冲液冲洗待测药物转印组和溶剂对照转印组，在室温下，于摇床中，将稀释后的二抗在1-2h内加入到冲洗后的待测药物转印组和溶剂对照转印组中，室温，慢摇，孵育1-2h。本发明中选用蛋白抗体时，先使用一抗孵育，然后再采用二抗孵育。

作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，电泳的具体操作为：A)取SDS-PAGE胶，所述SDS-PAGE胶包括3-5％的浓缩胶和8-12的分离胶，涂覆，成孔；B)每孔加入8-10μL的待测药物蛋白样或溶剂对照蛋白样，并在边孔上添加蛋白预染Marker；C)置于冰水浴中，于60-80V下，电泳20-30min，待蛋白预染Marker完全分开之后，调高电压至120-130V，继续电泳。本发明采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中，SDS-PAGE胶为现有的广泛使用的凝胶；蛋白预染Marker是一种试剂，可以直接购买使用。本发明的电泳操作方法简单，实验效果好。本发明中转印优选使用半干转膜法将带蛋白转印至硝酸纤维素(NC)膜上，根据所需分子量的大小，转膜时间大概为1-2h左右。

作为一种优选的实施方案，所述步骤2)中，热处理的具体操作为：S1富集细胞：将待测药物组样本和溶剂对照组样本洗涤，分别得待测药物组细胞和溶剂对照组细胞；S2梯度加热：将待测药物组细胞和溶剂对照组细胞分别梯度升温加热至30-80℃，得待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液；S3细胞裂解：将待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液裂解，离心，收集上清液；S4样品收集：在上清液中分别加入等体积的Loading Buffer重悬，沸水中煮15-20min，置于-20℃下，保存，备用。本发明采用梯度升温的方法进行热处理，Loading Buffer为上样缓冲液，主要有两种功能，第一，其中的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便适时终止电泳；第二，其中的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

作为一种优选的实施方案，所述裂解为液氮反复冻融、细胞裂解液裂解、超声破碎裂解中的任意一种。本发明的裂解方式有很多种，其中，采用液氮反复冻融裂解时，通常需要反复冻融三次；当然，还可以采用细胞裂解液裂解或者超声破碎裂解。

作为一种优选的实施方案，所述步骤S2中，梯度加热时，将待测药物组细胞和溶剂对照组细胞分别梯度升温加热至40-60℃。本发明在热处理过程中，温度可以优选为40-60℃，大部分蛋白在此温度范围内不稳定，而做为内参的Tubulin仍可以检测到。

作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，样本收集的具体操作为：Sa细胞种板：将生长状态良好并且处于对数生长期的有效细胞，采用胰酶消化并计数后，接种，于37℃，5％CO₂条件下，培养24h；Sb细胞加药：分别设置实验样和对照样，并加入步骤Sa中培养的有效细胞，于37℃，5％CO₂条件下，继续培养1-3h；Sc收集细胞：去掉培养基，加入冷PBS，冲洗，加入胰酶消化，并吹打均匀，使全部贴壁细胞悬浮。本发明的样本收集经过细胞种板、细胞加药和收集细胞而得到，消化过程中，只消化贴壁细胞，非贴壁细胞不需要消化；冷PBS是预冷的PBS缓冲液，PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用；它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl。

作为一种优选的实施方案，所述步骤5)中，质谱分析的具体操作为：取待测药物蛋白样，按照步骤3)进行电泳，电泳时的上样量为20-30μL，切下差异附近的胶条，采用超纯水漂洗，质谱分析。本发明通过质谱分析得到蛋白稳定差异处分子量大小的蛋白，结合一些细胞信号通路研究结果，验证，锁定靶蛋白，从而确定靶点。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明是一种基于蛋白热稳定与广谱分子染色的天然产物药物作用靶点识别方法，天然产物药物包括活性天然产物，天然产物无需提前标记，天然产物的用量少，微量用量，用量小于2mg；本发明的蛋白靶点包括细胞内低丰度靶点分子，具有广泛地寻找天然产物靶点的特点，本发明可以高效、低成本、免标记地识别潜在的药物靶点，发现潜在的药物靶点不仅可以推动疾病作用机制和药理学研究，还可以为药物潜在的副作用和药品的商业化提供指导信息。

附图说明

图1为本发明所述提供的天然产物药物作用靶点的识别方法的工艺流程框图；

图2为Muriceidine A-4抑制多种肿瘤细胞增殖结果图；

图3为Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用图；

图4为Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞中部分信号传递蛋白的影响结果图；

图5为Muriceidine A-4与MDA-MB-231细胞中糖蛋白的结合情况图；

图6为Muriceidine A-4与MDA-MB-231细胞中转铁蛋白受体的结合情况图；

图7为FeSO₄对Muriceidine A-4诱导的MDA-MB-231细胞凋亡的影响结果图；

图8为FeSO₄对Muriceidine A-4诱导的MDA-MB-231细胞凋亡的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参阅附图1，本发明的一种天然产物药物作用靶点的识别方法，包括以下步骤：

1)样本收集，取待测药物溶解于溶剂中，得实验样；另取溶剂，作为对照样；将实验样、对照样分别添加于有效活性细胞中，共同孵育1-5h，分别得待测药物组样本和溶剂对照组样本；

2)热处理，将待测药物组样本和溶剂对照组样本，置于30-80℃下，热处理3-10min，裂解，离心，取上清液，分别得待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样；

3)电泳与转印，将待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样进行电泳，转印，得待测药物转印组和溶剂对照转印组；

4)染色，将待测药物转印组、溶剂对照转印组均采用广谱的蛋白抗体或染料进行染色，并进行对比，寻找蛋白稳定差异的条带；

5)质谱分析，另取待测药物蛋白样，进行电泳，将蛋白稳定差异的条带进行质谱分析，验证，得靶点。

优选地，所述步骤4)中，染色的具体操作为：a)取脱脂奶粉，采用1×TBST缓冲液配成5％的溶液，备用；b)取待测药物转印组和溶剂对照转印组，加上步骤a)所得的溶液，于摇床上，室温孵育1-2h；c)采用1×TBST缓冲液冲洗，加入蛋白抗体或染料，置于4℃下，孵育过夜；d)避光条件下，涂覆ECL发光试剂或染料底物，采用成像系统显影；e)待测药物转印组和溶剂对照转印组对比，寻找蛋白稳定差异的条带，记下分子量大小。

进一步地，所述蛋白抗体为酪氨酸蛋白激酶抗体，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抗体、蛋白质银染、生物素标记的凝集素中的任意一种。

具体地，所述步骤c)中，当加入蛋白抗体时，此时，蛋白抗体为一抗，一抗在孵育过夜之后，还包括以下操作：取二抗，采用1×TBST缓冲液将二抗稀释2000-5000倍；采用1×TBST缓冲液冲洗待测药物转印组和溶剂对照转印组，在室温下，于摇床中，将稀释后的二抗在1-2h内加入到冲洗后的待测药物转印组和溶剂对照转印组中，室温，慢摇，孵育1-2h。

更优选地，所述步骤3)中，电泳的具体操作为：A)取SDS-PAGE胶，所述SDS-PAGE胶包括3-5％的浓缩胶和8-12的分离胶，涂覆，成孔；B)每孔加入8-10μL待测药物蛋白样或溶剂对照蛋白样，并在边孔上添加蛋白预染Marker；C)置于冰水浴中，于60-80V下，电泳20-30min，待蛋白预染Marker完全分开之后，调高电压至120-130V，继续电泳。

更进一步地，所述步骤2)中，热处理的具体操作为：S1富集细胞：将待测药物组样本和溶剂对照组样本洗涤，分别得待测药物组细胞和溶剂对照组细胞；S2梯度加热：将待测药物组细胞和溶剂对照组细胞分别梯度升温加热至30-80℃，待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液；S3细胞裂解：将待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液裂解，离心，收集上清液；S4样品收集：在上清液中分别加入等体积的Loading Buffer重悬，沸水中煮15-20min，置于-20℃下，保存，备用。

更具体地，所述裂解为液氮反复冻融、细胞裂解液裂解、超声破碎裂解中的任意一种。

再次优选地，所述步骤S2中，梯度加热时，将待测药物组细胞和溶剂对照组细胞分别梯度升温加热至40-60℃。

再进一步地，所述步骤1)中，样本收集的具体操作为：Sa细胞种板：将生长状态良好并且处于对数生长期的有效细胞，采用胰酶消化并计数后，接种，于37℃，5％CO₂条件下，培养24h；Sb细胞加药：分别设置实验样和对照样，并加入步骤Sa中培养的有效细胞，于37℃，5％CO₂条件下，继续培养1-3h；Sc收集细胞：去掉培养基，加入冷PBS，冲洗，加入胰酶消化，并吹打均匀，使全部贴壁细胞悬浮。

再具体地，所述步骤5)中，质谱分析的具体操作为：取待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样，按照步骤3)进行电泳，电泳时的上样量为20-30μL，切下差异附近的胶条，采用超纯水漂洗，质谱分析。

实施例一

化合物早期活性筛选与信号通路研究

(1)新结构化合物Muriceidine A-4抑制MDA-MB-231细胞的增殖活性

首先，采用MTT法检测了Muriceidine A-4对多种肿瘤细胞增殖的影响。结果如图2和图3所示，由图2可以看出，Muriceidine A-4对所示13种人类癌细胞均有增殖抑制作用，并且，Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞的抑制作用最强；由图3可以看出，MuriceidineA-4在不同时间、不同浓度下对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性，IC50为1.15μmol/L。

(2)Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞中增殖相关信号分子活化的影响

进一步检测Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞中增殖相关信号分子的影响，实验结果如图4，由图4可以看出，Muriceidine A-4能够抑制MDA-MB-231细胞中AKT、Src、ERK和STAT3的磷酸化。

实施例二

(1)寻找Muriceidine A-4与MDA-MB-231细胞作用后的差异蛋白

Muriceidine A-4对MDA-MB-231细胞中多个胞浆中增殖相关信号分子有明显抑制作用，可能与化合物作用于增殖相关的细胞受体蛋白有关。蛋白质糖基化是最常见的蛋白翻译后修饰之一，膜受体蛋白往往具有较高的糖基化修饰。凝集素是一种糖结合蛋白，其中，蓖麻凝集素(RCA I)能与糖链中含有α、β-D半乳糖的糖蛋白发生特异性结合，而α、β-D半乳糖广泛存在于大多数糖蛋白糖链中。首先，利用化合物和蛋白的结合时热稳定性提高的特性，对Muriceidine A-4作用后的MDA-MB-231细胞进行不同温度的处理后，裂解细胞，进行Westerbloting实验，采用生物素化的凝集素RCA I，结合亲和素抗体对Muriceidine A-4与MDA-MB-231细胞中结合的糖蛋白进行了染色，发现在Muriceidine A-4作用后，80kd附近有分子的热稳定性增加，结果如图5所示。由图5还可以看出，Muriceidine A-4可与80kd附近某一含有α、β-D半乳糖残基的糖蛋白发生结合。

为了进一步确定MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的糖蛋白，SDS-PAGE电泳后，切下80kd附近的胶条，对其进行了蛋白质谱分析检测，共鉴定到142种蛋白，部分相关性较高的蛋白结果如表1所示，由表1可以看出，Transferrin receptor(TfR1)一种是受体蛋白，这说明TfR1可能是MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的靶蛋白。

表1蛋白质谱鉴定到的部分蛋白质种类

本实验的具体步骤为：

(一)样本收集

(1)细胞种板：将生长状态良好并且处于对数生长期的有效细胞——MDA-MB-231，采用胰酶消化并计数后(悬浮细胞无需消化)，接种于6孔板中，置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下，培养24h；

(2)细胞加药：取待测药物——Muriceidine A-4溶解于溶剂中，得实验样；另取溶剂，作为对照样；在实验样、对照样中分别添加上述有效细胞，置于细胞培养箱中，于37℃，5％CO₂条件下，共孵育3h；

(3)收集细胞：去掉培养基，加入冷PBS，冲洗3遍，加入胰酶消化，并吹打均匀，将全部贴壁细胞悬浮，分别得待测药物组样本和溶剂对照组样本。

(二)热处理

(1)富集细胞：将待测药物组样本和溶剂对照组样本洗涤，转移至PCR管，分别得到待测药物组细胞和溶剂对照组细胞；

(2)梯度加热：将待测药物组细胞和溶剂对照组细胞分别置于梯度加热PCR仪中，梯度升温加热，设置温度在30-80℃之间，得待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液；

(3)细胞裂解：将PCR管中的待测药物组细胞悬液和溶剂对照组细胞悬液转移至EP管中，加入0.5μL PMSF，浸入液氮反复冻融三次，完成裂解，立即转入低温冷冻离心机，离心，收集上清液；

(4)样品收集：在上清液中分别加入等体积的Loading Buffer重悬，沸水中煮15min，置于-20℃冰箱中，保存，备用，得待测药物蛋白样和溶剂对照蛋白样。

(三)电泳与转印

(1)取SDS-PAGE胶，一般为5％的浓缩胶和8％的分离胶，涂覆，成孔；

(2)每孔中加入8-10μL的待测药物蛋白样或溶剂对照蛋白样，并在边孔上添加蛋白预染Marker；

(3)将电泳槽置于冰水浴中，先用70V下，电泳25min，待蛋白预染Marker完全分开后，调高电压至125V，继续电泳；

(4)使用半干转膜法将带蛋白转印至硝酸纤维素(NC)膜上，转膜时间2h。

(四)染色

1)天平称取脱脂奶粉，采用1×TBST缓冲液配置成5％的溶液，将NC膜放置在抗体孵育盒中，加入上述溶液，置于摇床上，室温孵育2h；

2)采用1×TBST洗去脱脂奶粉，加入广谱的染料——生物素化的凝集素RCA I，置于4℃环境中，孵育过夜；如使用抗体，则采用1×TBST缓冲液洗掉未结合的一抗，洗完后加入1.5mL采用1×TBST稀释4000倍的二抗，室温条件下，摇床，慢摇，2h内，加入二抗，置于摇床上，室温，慢摇，孵育2h；

3)避光条件下，使用ECL发光试剂涂布在NC膜上，采用多功能成像系统显影；

4)与对照组比较，寻找蛋白稳定差异的条带，记录分子量大小。

(五)质谱分析

(1)同上进行SDS-PAGE电泳，加大上样量，至25μL，切下差异附近的胶条；

(2)将胶条转入0.5mL EP管中，采用超纯水漂洗，漂洗两次，质谱分析。

(六)分析寻找靶蛋白

根据质谱结果，寻找蛋白稳定差异处分子量大小的蛋白，再结合一些细胞信号通路研究结果，验证，锁定靶蛋白，即TfR1是MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的靶蛋白。

实施例三

验证TfR1是MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的靶蛋白

为了进一步确认TfR1是MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的靶蛋白，又利用热稳定实验，采用TfR1的抗体，观察Muriceidine A-4与细胞内TfR1的结合，结果如图6所示；由图6可以看出，Muriceidine A-4与TfR1的结合提高了TfR1的热稳定性，这表明Muriceidine A-4与TfR1发生了结合。

为了验证Muriceidine A-4诱导的MDA-MB-231生长抑制与细胞凋亡是否与TfR1有关，使用FeSO₄预先处理MDA-MB-231细胞24h来降低TfR1的水平，再加入Muriceidine A-4作用24h，结果如图7所示；由图7可以看出，与对照组相比，Muriceidine A-4处理后，TfR1表达减少，而c-PARP表达明显升高，表明MDA-MB-231细胞发生凋亡，随后FeSO₄预处理下调TfR1的表达后，MDA-MB-231细胞的凋亡水平明显降低，这表明FeSO₄可降低Muriceidine A-4介导的细胞凋亡。这说明Muriceidine A-4介导的MDA-MB-231细胞凋亡与TfR1有关，也进一步证明了TfR1是MDA-MB-231细胞中与Muriceidine A-4结合的靶蛋白。如图8所示，由图8可以看出，结果具有显著性差异(P＜0.05)。

因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明是一种基于蛋白热稳定与广谱分子染色的天然产物药物作用靶点识别方法，天然产物药物包括活性天然产物，天然产物无需提前标记，天然产物的用量少，微量用量，用量小于2mg；本发明的蛋白靶点包括细胞内低丰度靶点分子，具有广泛地寻找天然产物靶点的特点，本发明可以高效、低成本、免标记地识别潜在的药物靶点，发现潜在的药物靶点不仅可以推动疾病作用机制和药理学研究，还可以为药物潜在的副作用和药品的商业化提供指导信息。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。