细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂
阅读说明：本技术 细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂 (Method for detecting interaction between biological molecules and regulating factor thereof in cell and used reagent ) 是由 李丕龙 王静 张冠伟 于 2018-08-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂。本发明的检测细胞内生物分子间相互作用的方法可用于检测细胞内的生物分子间的相互作用,并利用该方法进一步筛选影响已知具有相互作用的生物分子对间相互作用的调控因子。本发明的方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广,适用于进行信号通路调控物的筛选,并且也可进行高通量筛选生物分子间互作的调控因子。(The invention discloses a method for detecting the interaction between biological molecules and a regulatory factor thereof in cells and a reagent used by the method. The method for detecting the interaction between biomolecules in the cell can be used for detecting the interaction between biomolecules in the cell and further screening the regulatory factors influencing the interaction between the pairs of biomolecules known to have interaction by using the method. The method has the advantages of simple operation, high sensitivity, low cost and wide applicability, is suitable for screening signal channel regulators, and can also screen the regulation factors of the interaction between biomolecules at high flux.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂。
背景技术
“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命活动中行使重要的生物学功能。
相关研究发现，具有特定结构的生物大分子在一定浓度下可因相互作用而高度聚集，从而从一般溶液相中分离出来，形成一个大分子富集的独立的相(称为第二相，以区别于原溶液相)，这个现象被称为“相变”(或“相分离”)。在显微镜下可见第二相内含有大量聚集产物(小液滴或固体颗粒或凝胶状物等)，其直径可达微米级甚至更大，具有较高的辨识度。在生物细胞中，固有无序蛋白/区域(intrinsically disordered proteins/regions，简称IDPs/IDRs)之间的相互作用为驱动相变发生的一个重要机制。固有无序蛋白/区域是指在生理条件下没有稳定有序的二级和(或)三级结构，天然状态下整体或局部不折叠，但能够正常行使生物学功能的一类蛋白/蛋白区域，它们在生物体中广泛存在，并在细胞信号转导、蛋白质互作网络中扮演重要角色。无序结构在氨基酸组成上通常具有偏好性，如含有丰富的G、P、E、S、Q、K、D、T、R等极性氨基酸以及Y、F等芳香族氨基酸。研究发现，锚定于核孔复合物上的核孔蛋白(nucleoporin)NUP98的N端含有IDRs，可介导相变发生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测细胞内生物分子间的相互作用并筛选影响其互作的调控因子。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测细胞内生物分子间相互作用的方法，待测生物分子名称为X和XL，所述X为蛋白质、核酸或多糖，所述XL为蛋白质、核酸或多糖，所述方法包括U1)和U2)：
U1)连接名称为R的生物分子和所述X，将得到的重组分子记为R-X；所述R含有固有无序蛋白/区域(intrinsically disordered proteins/regions，简称IDPs/IDRs)；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL-J；
U2)将所述R-X与所述XL-J导入生物细胞中，得到重组细胞，检测所述重组细胞中所述J的信号是否在所述固有无序蛋白/区域所形成的第二相中聚集，确定所述X和所述XL间是否具有相互作用：如所述J的信号在所述第二相中聚集，所述X和所述XL间具有或候选具有相互作用；如所述J的信号在所述第二相中没有聚集，所述X和所述XL间不具有或候选不具有相互作用。
U2)中，当所述X、所述XL和所述J为蛋白质时，将所述R-X与所述XL-J导入生物细胞中可为将所述R-X与所述XL-J的编码基因导入所述生物细胞中以使得到的所述重组细胞表达所述R-X与所述XL-J。
本发明还提供了鉴定细胞内生物分子间互作调控因子的方法，待测生物分子名称为X和XL，所述X为蛋白质、核酸或多糖，所述XL为蛋白质、核酸或多糖，所述X和所述XL间具有相互作用，所述方法包括V1)和V2)：
V1)连接名称为R的生物分子和所述X，将得到的重组分子记为R-X；所述R含有固有无序蛋白/区域(intrinsically disordered proteins/regions，简称IDPs/IDRs)；连接所述XL与名称为J的报告基团，将得到的重组分子记为XL-J；
V2)将所述R-X与所述XL-J导入生物细胞中，得到重组细胞；培养所述重组细胞，向所述重组细胞的培养体系中添加待测调控因子，得到待测体系；培养所述重组细胞，得到对照体系；然后检测所述待测体系和所述对照体系中所述重组细胞中所述J的信号在所述固有无序蛋白/区域所形成的第二相中的强度，确定所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用是否具有调控作用：如所述J的信号在所述待测体系的第二相中高于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有促进作用；如所述J的信号在所述待测体系的第二相中等于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用不具有或候选不具有调控作用；如所述J的信号在所述待测体系的第二相中低于所述对照体系，所述待测调控因子对所述X和所述XL间的相互作用具有或候选具有抑制作用。
上述方法中，所述R还可含有名称为K的报告基团，所述K不同于所述J。
上述方法中，所述J和所述K均可为荧光报告基团。
上述方法中，所述荧光报告基团可为荧光蛋白质。
进一步，所述J具体可为红色荧光蛋白mCherry，所述K具体可为绿色荧光蛋白GFP。
上述方法中，所述固有无序蛋白/区域可为H1)或H2)或H3)：
H1)氨基酸序列是序列1的第258-772位所示的蛋白质；
H2)将序列表中序列1的第258-772位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H1)或H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使H1)中的蛋白质便于纯化，可在H1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签
残基
序列
Poly-Arg
5-6(通常为5个)
RRRRR
Poly-His
2-10(通常为6个)
HHHHHH
FLAG
8
DYKDDDDK
Strep-tag II
8
WSHPQFEK
c-myc
10
EQKLISEEDL
上述H2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述H2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述H2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述固有无序蛋白/区域的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述方法中，所述R中所述K和所述固有无序蛋白/区域可通过连接区或化学键相连。
上述方法中，所述XL-J中所述XL和所述J可通过所述连接区或化学键相连。
所述R-X中所述R和所述X可通过所述连接区或化学键相连。
上述方法中，所述连接区可为(Gly-Gly-Ser)n或含有(Gly-Gly-Ser)n的多肽，n为大于等于2的自然数。
n具体可为4或2。
上述方法中，所述R可为I1)或I2)或I3)或I4)：
I1)氨基酸序列是序列1的第1-772位所示的蛋白质；
I2)氨基酸序列是序列1的第1-784位所示的蛋白质；
I3)将序列表中序列1的第1-772位或第1-784位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
I4)在I1)或I2)或I3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使I1)中的蛋白质便于纯化，可在I1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述I2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述I2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述I2)中的蛋白质的编码基因可通过将编码所述R的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述方法中，所述生物细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为HEK293细胞。
在本发明的一个实施例中，所述X为p53，所述XL为MDM2。
本发明还提供了所述R。
本发明还提供了与所述R相关的生物材料，所述生物材料为下述M1)至M4)中的任一种：
M1)编码权利要求1-10中任一所述R的核酸分子；
M2)含有M1)所述核酸分子的表达盒；
M3)含有M1)所述核酸分子的重组载体、或含有M2)所述表达盒的重组载体；
M4)含有M1)所述核酸分子的重组微生物、或含有M2)所述表达盒的重组微生物、或含有M3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，M1)所述核酸分子可为如下m1)-m8)中的任一种：
m1)编码序列是序列表中序列2的第780-2324位的cDNA分子或DNA分子；
m2)编码序列是序列表中序列2的第738-2324位的cDNA分子或DNA分子；
m3)编码序列是序列表中序列2的第9-2324位的cDNA分子或DNA分子；
m4)编码序列是序列表中序列2的第780-2360位的cDNA分子或DNA分子；
m5)编码序列是序列表中序列2的第738-2360位的cDNA分子或DNA分子；
m6)编码序列是序列表中序列2的第9-2360位的cDNA分子或DNA分子；
m7)与m1)或m2)或m3)或m4)或m5)或m6)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述R的cDNA分子或DNA分子；
m8)在严格条件下与m1)或m2)或m3)或m4)或m5)或m6)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述R的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述R的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
M2)所述的含有编码所述R的核酸分子的表达盒(R基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述R的DNA，该DNA不但可包括启动所述R基因转录的启动子，还可包括终止所述R基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的载体构建含有所述R基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pcDNA3.1载体。
X13)所述重组载体具体可为pcDNA3.1-GFP-NUPN，所述pcDNA3.1-GFP-NUPN为将pcDNA3.1载体的NotI和XbaI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XbaI的识别序列)替换为序列表中序列2所示的DNA分子得到的重组载体。所述pcDNA3.1-GFP-NUPN能表达序列1所示的GFP融合NUPN的融合蛋白质GFP-NUPN。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
本发明还提供了所述R或所述生物材料的下述任一应用：
X1)检测细胞内生物分子间相互作用；
X2)制备检测细胞内生物分子间相互作用产品；
X3)鉴定细胞内生物分子间互作调控因子；
X4)制备鉴定细胞内生物分子间互作调控因子产品；
X5)筛选细胞内生物分子间互作调控因子；
X6)制备筛选细胞内生物分子间互作调控因子产品；
X7)检测物质对细胞内生物分子间相互作用的影响。
上述应用中，所述细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为HEK293细胞。
上述应用中，所述产品可为试剂盒。
所述筛选生物分子间相互作用调控因子可进行高通量筛选，所述鉴定生物分子间相互作用调控因子也可进行高通量鉴定。
实验证明，本发明的检测细胞内生物分子间相互作用的方法可用于检测细胞内的生物分子间的相互作用，并利用该方法进一步筛选影响已知具有相互作用的生物分子对间相互作用的调控因子。本发明的方法操作简便、灵敏度高、成本低廉、适用性广，适用于进行信号通路调控物的筛选，并且也可进行高通量筛选生物分子间互作的调控因子。
附图说明
图1为P53与MDM2间相互作用的检测。A为体系1产生的第二相形态观察，右图为左图框选区域的放大图像；B为体系1-8的激光共聚焦扫描显微成像分析。标尺＝20μm。
图2为抑制剂对P53与MDM2间相互作用影响的激光共聚焦扫描显微成像分析。标尺＝20μm。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pcDNA3.1载体(Yoo et al.,A new strategy for assessingselenoprotein function:siRNA knockdown/knock-in targeting the 3′-UTR,RNA(2007),13:921–929.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的HEK293细胞(SHIN et al.,Overexpression of PGC-1αenhancescell proliferation and tumorigenesis of HEK293 cells through the upregulationof Sp1 and Acyl-CoA binding protein,INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 46:1328-1342,2015)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、P53与MDM2间相互作用及抑制剂对其影响的细胞内检测
一、重组载体的制备
1、表达GFP与NUPN(NUPN为NUP98的N端)的融合蛋白的重组载体
将pcDNA3.1载体的NotI和XbaI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XbaI的识别序列)替换为序列表中序列2所示的DNA分子，得到重组载体pcDNA3.1-GFP-NUPN，pcDNA3.1-GFP-NUPN能表达序列1所示的蛋白质(GFP融合NUPN，记为GFP-NUPN)。
其中，序列2的第9-2363位所示的DNA分子编码序列1所示的GFP-NUPN，序列1的第1-241位为GFP的氨基酸序列，序列1的第244-255位为四个GGS的连接肽的氨基酸序列，序列1的第258-772位为NUPN的氨基酸序列，序列1的第773-784位为四个GGS的连接肽的氨基酸序列。
2、表达GFP-NUPN与P53的融合蛋白的重组载体
将pcDNA3.1载体的NotI和XbaI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XbaI的识别序列)替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到重组载体pcDNA3.1-GFP-NUPN-p53，pcDNA3.1-GFP-NUPN-p53能表达序列3所示的蛋白质(GFP融合NUPN与p53，记为GFP-NUPN-p53)。
其中，序列4的第9-2408位所示的DNA分子编码序列3所示的GFP-NUPN-p53，序列3的第1-241位为GFP的氨基酸序列，序列3的第244-255位为四个GGS的连接肽的氨基酸序列，序列3的第258-772位为NUPN的氨基酸序列，序列3的第773-784位为四个GGS的连接肽的氨基酸序列，序列3的第785-799位为p53的氨基酸序列。
3、表达mCherry的重组载体
将pcDNA3.1载体的NotI和XbaI识别序列间的DNA片段(包含NotI和XbaI的识别序列)替换为序列表中序列6的第1-785位所示的DNA分子，得到重组载体pcDNA3.1-mCherry，pcDNA3.1-mCherry能表达序列5所示的蛋白质(mCherry融合四个GGS的连接肽，记为mCherry-GGS)。
其中，序列6的第9-785位所示的DNA分子编码序列5所示的mCherry-GGS，序列5的第1-238位为mCherry的氨基酸序列，序列5的第241-252位为四个GGS的连接肽的氨基酸序列。
4、表达mCherry与MDM2的融合蛋白的重组载体
将pcDNA3.1-mCherry载体的XhoI和XbaI识别序列间的DNA片段(包含XhoI和XbaI的识别序列)替换为序列表中序列8的所示的DNA分子，得到重组载体pcDNA3.1-mCherry-MDM2，pcDNA3.1-mCherry-MDM2能表达序列5所示的mCherry-GGS与序列7所示的MDM2的融合蛋白(记为mCherry-MDM2)。
二、转染HEK293细胞
将步骤一所得各重组载体按照如下组合转染(或共转染)HEK293细胞(贴壁培养)，所用转染试剂Hifectin I(北京蒂诺奥生物科技有限公司)，并按照试剂说明书操作。各组合以及每105个HEK293细胞转染载体量如下：
组合1：pcDNA3.1-GFP-NUPN，该载体转染用量为1μg；
组合2：pcDNA3.1-mCherry，该载体转染用量为1μg；
组合3：pcDNA3.1-GFP-NUPN+pcDNA3.1-mCherry，这两种载体转染用量依次为0.5μg、0.5μg；
组合4：pcDNA3.1-GFP-NUPN-P53，该载体转染用量为1μg；
组合5：pcDNA3.1-GFP-NUPN-P53+pcDNA3.1-mCherry，这两种载体转染用量依次为0.5μg、0.5μg；
组合6：pcDNA3.1-mCherry-MDM2，该载体转染用量为1μg；
组合7：pcDNA3.1-GFP-NUPN+pcDNA3.1-mCherry-MDM2，这两种载体转染用量依次为0.5μg、0.5μg；
组合8：pcDNA3.1-GFP-NUPN-P53+pcDNA3.1-mCherry-MDM2，这两种载体转染用量依次为0.5μg、0.5μg。
三、P53与MDM2间相互作用的细胞内检测
将步骤二所得转染不同组合载体的细胞系培养24小时后，用激光共聚焦扫描显微镜进行图像采集，结果(图1)显示，转染组合1和4的体系1和4的细胞中发生了相变，绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)聚集于相变产生的第二相中，且其信号强度远远高于细胞内非第二相部分的信号强度；转染组合2和6的体系2和6的细胞中红色荧光信号(mCherry发出的荧光信号)均匀分布，并无聚集；转染组合3、5和7的体系3、5和7的细胞中发生了相变，绿色荧光信号聚集于相变产生的第二相中，且其信号强度远远高于细胞内非相变部分的信号强度，而红色荧光信号无聚集；转染组合8的体系8的细胞中发生了相变，绿色荧光信号和红色荧光信号均聚集于相变产生的第二相中，且其信号强度均远远高于细胞内非相变部分的信号强度。
以上结果说明，NUPN可介导细胞内相变的发生，由该相变产生的第二相可以用与NUPN相连的GFP发出的荧光来标示，将NUPN、GFP与P53连接在一起时，如细胞内含有P53的互作蛋白MDM2时，P53可通过与MDM2的互作将连接有mCherry的MDM2招募至第二相中，进而使红色荧光信号聚集于第二相中。而在P53或MDM2单一缺失或同时缺失情况下，均检测不到红色荧光信号的聚集。表明，可利用GFP-NUPN-P53与mCherry-MDM2共转染HEK293细胞检测细胞内P53与MDM2间的相互作用。
四、MI-773抑制P53与MDM2间相互作用的验证
选用已知的对P53与MDM2间相互作用具有抑制作用的化合物MI-773处理步骤二中的体系8，检测其在细胞中对P53与MDM2互作的抑制作用，利用无关化合物GDC0152作为对照。向体系8的细胞系中分别加入终浓度为5μM的MI-773(体系9)或GDC0152(体系10)，用激光共聚焦扫描显微镜对处理前后的同一个视野进行图像采集。结果(图2)显示，MI-773处理对细胞中的相变无明显影响，第二相中仍检测到绿色荧光信号的聚集，而红色荧光信号在第二相中的聚集消失，转变为均匀分布。而GDC0152处理前后细胞中的相变状态以及两种荧光信号在第二相中的聚集均未发生明显变化。表明，GDC0152不影响P53与MDM2间的互作，MI-773可明显抑制P53与MDM2间相互作用，验证了MI-773对P53与MDM2间相互作用的抑制作用。以上结果表明，可利用GFP-NUPN-P53与mCherry-MDM2共转染HEK293细胞鉴定调控因子对P53与MDM2间相互作用的影响。
<110> 清华大学
<120> 细胞内检测生物分子间相互作用及其调控因子的方法与所用试剂
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 784
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
1 5 10 15
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg
20 25 30
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
35 40 45
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
50 55 60
Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met
65 70 75 80
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
85 90 95
Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala
100 105 110
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
130 135 140
Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys
145 150 155 160
Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
180 185 190
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys
195 200 205
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
210 215 220
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235 240
Thr Met Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Glu Met Phe Asn Lys Ser Phe Gly Thr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Gly
260 265 270
Gly Phe Gly Thr Thr Ser Thr Phe Gly Gln Asn Thr Gly Phe Gly Thr
275 280 285
Thr Ser Gly Gly Ala Phe Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ser Ser Asn Asn
290 295 300
Thr Gly Gly Leu Phe Gly Asn Ser Gln Thr Lys Pro Gly Gly Leu Phe
305 310 315 320
Gly Thr Ser Ser Phe Ser Gln Pro Ala Thr Ser Thr Ser Thr Gly Phe
325 330 335
Gly Phe Gly Thr Ser Thr Gly Thr Ala Asn Thr Leu Phe Gly Thr Ala
340 345 350
Ser Thr Gly Thr Ser Leu Phe Ser Ser Gln Asn Asn Ala Phe Ala Gln
355 360 365
Asn Lys Pro Thr Gly Phe Gly Asn Phe Gly Thr Ser Thr Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Leu Phe Gly Thr Thr Asn Thr Thr Ser Asn Pro Phe Gly Ser Thr
385 390 395 400
Ser Gly Ser Leu Phe Gly Pro Ser Ser Phe Thr Ala Ala Pro Thr Gly
405 410 415
Thr Thr Ile Lys Phe Asn Pro Pro Thr Gly Thr Asp Thr Met Val Lys
420 425 430
Ala Gly Val Ser Thr Asn Ile Ser Thr Lys His Gln Cys Ile Thr Ala
435 440 445
Met Lys Glu Tyr Glu Ser Lys Ser Leu Glu Glu Leu Arg Leu Glu Asp
450 455 460
Tyr Gln Ala Asn Arg Lys Gly Pro Gln Asn Gln Val Gly Ala Gly Thr
465 470 475 480
Thr Thr Gly Leu Phe Gly Ser Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Thr Gly
485 490 495
Leu Phe Ser Ser Ser Thr Thr Asn Ser Gly Phe Ala Tyr Gly Gln Asn
500 505 510
Lys Thr Ala Phe Gly Thr Ser Thr Thr Gly Phe Gly Thr Asn Pro Gly
515 520 525
Gly Leu Phe Gly Gln Gln Asn Gln Gln Thr Thr Ser Leu Phe Ser Lys
530 535 540
Pro Phe Gly Gln Ala Thr Thr Thr Gln Asn Thr Gly Phe Ser Phe Gly
545 550 555 560
Asn Thr Ser Thr Ile Gly Gln Pro Ser Thr Asn Thr Met Gly Leu Phe
565 570 575
Gly Val Thr Gln Ala Ser Gln Pro Gly Gly Leu Phe Gly Thr Ala Thr
580 585 590
Asn Thr Ser Thr Gly Thr Ala Phe Gly Thr Gly Thr Gly Leu Phe Gly
595 600 605
Gln Thr Asn Thr Gly Phe Gly Ala Val Gly Ser Thr Leu Phe Gly Asn
610 615 620
Asn Lys Leu Thr Thr Phe Gly Ser Ser Thr Thr Ser Ala Pro Ser Phe
625 630 635 640
Gly Thr Thr Ser Gly Gly Leu Phe Gly Phe Gly Thr Asn Thr Ser Gly
645 650 655
Asn Ser Ile Phe Gly Ser Lys Pro Ala Pro Gly Thr Leu Gly Thr Gly
660 665 670
Leu Gly Ala Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gly Gln Ala Ser Leu
675 680 685
Phe Gly Asn Asn Gln Pro Lys Ile Gly Gly Pro Leu Gly Thr Gly Ala
690 695 700
Phe Gly Ala Pro Gly Phe Asn Thr Thr Thr Ala Thr Leu Gly Phe Gly
705 710 715 720
Ala Pro Gln Ala Pro Val Ala Leu Thr Asp Pro Asn Ala Ser Ala Ala
725 730 735
Gln Gln Ala Val Leu Gln Gln His Ile Asn Ser Leu Thr Tyr Ser Pro
740 745 750
Phe Gly Asp Ser Pro Leu Phe Arg Asn Pro Met Ser Asp Pro Lys Lys
755 760 765
Lys Glu Glu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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<210> 2
<211> 2369
<212> DNA
<213> 人工序列
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Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
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Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala
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Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
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Asn Ser Ile Phe Gly Ser Lys Pro Ala Pro Gly Thr Leu Gly Thr Gly
660 665 670
Leu Gly Ala Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gly Gln Ala Ser Leu
675 680 685
Phe Gly Asn Asn Gln Pro Lys Ile Gly Gly Pro Leu Gly Thr Gly Ala
690 695 700
Phe Gly Ala Pro Gly Phe Asn Thr Thr Thr Ala Thr Leu Gly Phe Gly
705 710 715 720
Ala Pro Gln Ala Pro Val Ala Leu Thr Asp Pro Asn Ala Ser Ala Ala
725 730 735
Gln Gln Ala Val Leu Gln Gln His Ile Asn Ser Leu Thr Tyr Ser Pro
740 745 750
Phe Gly Asp Ser Pro Leu Phe Arg Asn Pro Met Ser Asp Pro Lys Lys
755 760 765
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Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn
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<212> DNA
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