一种白介素-6检测试剂盒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种白介素-6检测试剂盒及其制备方法 (Interleukin-6 detection kit and preparation method thereof ) 是由 袁嘉扬 张勇 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,涉及一种白介素-6检测试剂盒,尤其涉及一种白介素-6检测试剂盒的制备方法,公开了包括试剂R1和试剂R2的组分和浓度,所述试剂R2由第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成,其保存液由N,N-二羟乙基甘氨酸、第二稳定剂、第二防腐剂构成,胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、白介素-6抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成。本发明的优点是：该方法使用的样本量较少,与其他检测方法相比具有简单、准确、快速的特点,并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测；该试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、特异性高、精密度好、检测时间短等特点,且价格低廉。(The invention relates to the technical field of biology, relates to an interleukin-6 detection kit, and particularly relates to a preparation method of the interleukin-6 detection kit, and discloses components and concentrations including a reagent R1 and a reagent R2, wherein the reagent R2 consists of a second buffer solution, a preservation solution and a latex microsphere antibody conjugate, the preservation solution consists of N, N-dihydroxyethyl glycine, a second stabilizer and a second preservative, and the latex microsphere antibody conjugate consists of a latex microsphere, an interleukin-6 antibody and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide hydrochloride. The invention has the advantages that: the method uses a small amount of samples, has the characteristics of simplicity, accuracy and rapidness compared with other detection methods, and can realize high-throughput detection by batch analysis on a full-automatic biochemical analyzer; the kit has the characteristics of good stability, high sensitivity, wide linear range, high specificity, good precision, short detection time and the like, and is low in price.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种白介素-6检测试剂盒，尤 其涉及一种白介素-6检测试剂盒的制备方法。
背景技术
白介素-6(IL-6)是一种功能广泛的多效性细胞因子。白介素-6 不仅对B细胞有生理活性作用，对T细胞、造血干细胞、肝细胞和脑 细胞均有生理活性作用，其能够诱导B细胞分化产生免疫球蛋白，促 进T细胞的增殖生长，促进骨髓造血干细胞的增殖，增强血细胞的分 化及其抗瘤效应等。白介素-6的生物学功能，在抗感染、肿瘤、免疫 性疾病及免疫调节等方面均发挥重要作用。
研究表明，在发生外伤、外科手术，应激反应，感染，脑死亡， 肿瘤产生以及其他情况的急性炎症反应过程中，白介素-6会快速产生。 连续监测重症监护病人血清或血浆中白介素-6的含量，能有效评估系 统性炎症反应综合征(SIRS)的严重程度，脓毒血症以及脓毒血症性 休克的预后情况。白介素-6能作为脓毒血症的早期预警指标，同时白 介素-6在慢性炎症反应中也扮演着重要角色。
目前在国内，白介素-6的检测在临床应用上主要以国外进口试剂 和酶联免疫吸附试验法(ELISA)为主，进口试剂价格昂贵，对于患 者来说经济负担较大，不利于基层推广；而ELISA方法检测灵敏度较 低，线性范围较窄，检测过程耗时长，并且通常只适用手工操作，不 利于全自动检测仪器的检测，从而限制了该方法的推广应用。目前， 具有自主知识产权的国产白介素-6免疫化学发光试剂盒比较少，因此， 提供一种分析灵敏度高且线性范围较宽的白介素-6国产试剂盒在临 床应用上具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是：针对上述不足，提供稳定性好、灵敏度高、线 性范围宽、特异性高、精密度好、检测时间短的一种白介素-6检测 试剂盒及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种白介素-6检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1 的各组分及浓度包括：
所述试剂R2由第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组 成，其保存液由N,N-二羟乙基甘氨酸、第二稳定剂、第二防腐剂构 成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、白介素-6抗体、1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.01-0.3g/L。
试剂R1中的第一缓冲液包括PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES 缓冲液、Tris缓冲液中的一种或几种。
试剂R1的第一稳定剂以及R2中的第二稳定剂均为酪蛋白、甘 露醇、牛血清白蛋白中的一种或几种以上混合物。
试剂R1中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种 或两种以上混合物。
试剂R1中的表面活性剂为吐温20、曲拉通、聚乙烯吡咯烷酮、 辛基苯基聚氧乙烯醚中的一种或几种以上混合物。
试剂R1中的第一防腐剂以及R2中的第二防腐剂均为叠氮钠、 Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞中的一种。
试剂R2中的第二缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸 缓冲体系、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或几种。
试剂R2中的胶乳微球所选粒径为80-250nm，其表面修饰集团为 羧基、羟基、醛基、氨基中的一种。
一种白介素-6检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂 R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中 档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入第一缓冲液、第一 稳定剂、电解质、表面活性剂、聚乙二醇6000和第一防腐剂，搅拌 20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后， 调节pH值到8.30-10.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐 中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
B1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入第二缓冲液，搅拌20-30分钟至物料完全溶解，调节pH值到 6.00-7.50之间，继续搅拌5-10分钟至溶液清澈透明，配液罐底部 无沉淀，定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；
B2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入N,N-二羟乙基甘氨酸、第二稳定剂和第二防腐剂，搅拌20-30分 钟至物料完全溶解，调节pH值到6.00-7.50之间，继续搅拌5-10分 钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至 最终体积，溶液存放备用，进行标识；
B3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到 0.1-2.0％的浓度，将白介素-6抗体以缓冲液稀释到0.5-3.0g/L的 浓度，二者进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐以缓冲液溶解到0.01-0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合 溶液中，室温反应120分钟，加入第二稳定剂封闭，振荡混匀，室温 反应60分钟，将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清， 加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后， 加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
与现有技术相比，本发明所达到的技术效果是：该发明首次实现 在生化分析仪上检测白介素-6的含量，其检测范围可达到1.5-3000 pg/mL；该方法使用的样本量较少，与其他检测方法相比具有简单、 准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量 检测；该试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、特异性高、 精密度好、检测时间短等特点，且价格低廉，可广泛应用大、中、小 医院。
附图说明
图1是本发明实施例4中胶乳微球间接偶联白介素-6抗体定标 曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示吸光度。
图2是本发明实施例4中线性范围测定图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
本发明的一种白介素-6检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2， 所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基 甲烷，含量为6.0g/L，作为第一稳定剂的牛血清白蛋白，含量为0.5 g/L，作为电解质的氯化钠，含量为5.8g/L，作为表面活性剂的吐温20，含量为1ml/L，聚乙二醇6000，含量为40g/L，作为第一 防腐剂的Proclin-950，含量为0.8ml/L；
所述试剂R2由作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、 保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由N,N-二羟乙基甘 氨酸、作为第二稳定剂的牛血清白蛋白、作为第二防腐剂的 Proclin-950构成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、白介素-6抗体、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为： 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，浓度为10.00g/L，N,N-二羟乙基甘氨 酸，浓度为1.26g/L，牛血清白蛋白，浓度为0.5g/L，Proclin-950， 浓度为0.8ml/L，胶乳微球，浓度为0.1％，白介素-6抗体，浓度为 0.5g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.01 g/L。
试剂R2中的胶乳微球所选粒径为80nm，其表面修饰集团为羧基、 羟基、醛基、氨基中的一种。
一种白介素-6检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂 R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中 档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、 牛血清白蛋白、氯化钠、吐温20、聚乙二醇6000和Proclin-950， 搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后， 调节pH值到8.30，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标 识；
B)、试剂R2制备：
B1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌20分钟至物料完全溶解，调节 pH值到6.00，继续搅拌5分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀， 定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；
B2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入N,N-二羟乙基甘氨酸、牛血清白蛋白和Proclin-950，搅拌20分 钟至物料完全溶解，调节pH值到6.00之间，继续搅拌5分钟至全部 物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积， 溶液存放备用，进行标识；
B3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到0.1 的浓度，将白介素-6抗体以缓冲液稀释到0.5g/L的浓度，二者进 行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶 解到0.01g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应 120分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟， 将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液， 超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液， 超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例二：
本发明的一种白介素-6检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2， 所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基 甲烷，含量为9g/L，作为第一稳定剂的甘露醇，含量为1.2g/L，作 为电解质的氯化钾，含量为12g/L，作为表面活性剂的曲拉通，含 量为2ml/L，聚乙二醇6000，含量为40-120g/L，作为第一防腐剂 的Proclin-300，含量为1.4ml/L；
所述试剂R2由作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、 保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由N,N-二羟乙基甘 氨酸、作为第二稳定剂的甘露醇、作为第二防腐剂的Proclin-300构 成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、白介素-6抗体、1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：2-(N-吗啉) 乙磺酸一水合物，浓度为18g/L，N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为5g/L， 甘露醇，浓度为1g/L，Proclin-300，浓度为1.4ml/L，胶乳微球， 浓度为1％，白介素-6抗体，浓度为2g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.2g/L。
试剂R2中的胶乳微球所选粒径为160nm，其表面修饰集团为羧 基、羟基、醛基、氨基中的一种。
一种白介素-6检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂 R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中 档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、 甘露醇、氯化钾、曲拉通、聚乙二醇6000和Proclin-300，搅拌25 分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节 pH值到9.3，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
B1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌25分钟至物料完全溶解，调节 pH值到6.5，继续搅拌7分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀， 定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；
B2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入N,N-二羟乙基甘氨酸、甘露醇和Proclin-300，搅拌25分钟至物 料完全溶解，调节pH值到6.5，继续搅拌7分钟至全部物料完全溶 解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放 备用，进行标识；
B3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到1％ 的浓度，将白介素-6抗体以缓冲液稀释到2g/L的浓度，二者进行混 匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶解到 0.2g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分 钟，加入Proclin-300封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合 液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重 悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声 重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例三：
本发明的一种白介素-6检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2， 所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基 甲烷，含量为12.2g/L，作为第一稳定剂的酪蛋白，含量为2g/L， 作为电解质的氯化镁，含量为20.0g/L，作为表面活性剂的聚乙烯 吡咯烷酮，含量为3ml/L，聚乙二醇6000，含量为120g/L，作为 第一防腐剂的叠氮钠，含量为2.0ml/L；
所述试剂R2由作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、 保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由N,N-二羟乙基甘 氨酸、作为第二稳定剂的酪蛋白、作为第二防腐剂的叠氮钠构成，胶 乳微球抗体偶联物由胶乳微球、白介素-6抗体、1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：2-(N-吗啉)乙磺 酸一水合物，浓度为25.30g/L，N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为9.83 g/L，酪蛋白，浓度为1.5g/L，叠氮钠，浓度为2.0ml/L，胶乳微 球，浓度为2.0％，白介素-6抗体，浓度为3.0g/L，1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.3g/L。
试剂R2中的胶乳微球所选粒径为250nm，其表面修饰集团为羧 基、羟基、醛基、氨基中的一种。
一种白介素-6检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂 R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中 档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、 酪蛋白、氯化镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000和叠氮钠，搅拌 30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调 节pH值到10.50，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标 识；
B)、试剂R2制备：
B1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌30分钟至物料完全溶解，调节 pH值到7.50，继续搅拌10分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀， 定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；
B2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器 上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投 入N,N-二羟乙基甘氨酸、酪蛋白和叠氮钠，搅拌30分钟至物料完全 溶解，调节pH值到7.50，继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放备用， 进行标识；
B3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到 2.0％的浓度，将白介素-6抗体以缓冲液稀释3.0g/L的浓度，二者 进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液 溶解到0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应 120分钟，加入酪蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合 液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重 悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声 重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例四：
胶乳微球间接偶联白介素-6抗体，使用标准品进行定标，结果 如表1和图1所示。
表1：胶乳微球间接偶联白介素-6抗体定标结果：
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围低 限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：1.0pg/mL、1.2 pg/mL、1.5pg/mL和2.0pg/mL，每个浓度水平样本重复测定10次， 以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值 的最低浓度水平做为检测范围低限，结果如表2所示。
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围高 限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：2500pg/mL、3000 pg/mL、3500pg/mL和4000pg/mL，每个浓度水平样本重复测定10 次，以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受 界值的最高浓度水平做为检测范围高限，结果如表3所示。
表2：
当样本浓度低于1.2pg/mL时，CV＞8％；当样本浓度高于1.5 pg/mL时，CV＜8％；故线性范围低限定为1.5pg/mL。
表3：
当样本浓度高于3500pg/mL时，CV＞8％；当样本浓度低于3000 pg/mL时，CV＜8％；故线性范围高限定为3000pg/mL。
综上所述，该发明的线性范围可做到1.5-3000pg/mL。
实施例五：
精密度CV检测：
胶乳微球间接偶联白介素-6抗体，对五个样本本重复检测10次， 检测结果如表4所示：
表4：
1
1.7
84.4
393.4
1497.2
2879.9
2
1.8
83.3
370.5
1403.0
2689.6
3
1.7
76.4
368.0
1405.0
2909.0
4
1.6
80.0
380.3
1442.2
2719.9
5
1.9
76.8
386.8
1469.1
2854.7
6
1.9
79.6
388.2
1470.8
2979.3
7
1.7
79.6
359.6
1416.3
2726.9
8
1.9
75.1
400.0
1421.1
2703.7
9
1.9
79.4
391.3
1438.2
2779.2
10
1.7
77.4
396.6
1465.0
2971.6
均值
1.8
79.2
383.5
1442.8
2821.4
SD
0.11
2.95
13.44
31.86
111.52
CV
6.38％
3.73％
3.51％
2.21％
3.95％
精密度CV较小，8％以内。
现有的白介素-6试剂与本发明的相关性测试：
对照试剂与本发明试剂盒按照各自的参数同时检测20例临床血 清，对测定结果进行相关性分析，结果如图所示，R2＞0.95，符合临
综上所述：与现有技术相比，本发明所达到的技术效果是：该发 明首次实现在生化分析仪上检测白介素-6的含量，其检测范围可达 到1.5-3000pg/mL；该方法使用的样本量较少，与其他检测方法相 比具有简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分 析实现高通量检测；该试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、 特异性高、精密度好、检测时间短等特点，且价格低廉，可广泛应用 大、中、小医院。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此 项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本 发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。