生成用于具有多模式标记和信号放大的分析物检测的生物相容的树枝状聚合物的方法
阅读说明：本技术 生成用于具有多模式标记和信号放大的分析物检测的生物相容的树枝状聚合物的方法 (Method of generating biocompatible dendrimers for analyte detection with multimodal labeling and signal amplification ) 是由 斯科特·E·弗雷泽 西蒙·雷斯特雷波 约瑟夫·P·邓纳姆 于 2018-02-28 设计创作，主要内容包括：本文描述了使用聚合触发剂以受控的方式由成对的互补的树枝状核酸单体产生树枝状生物相容的聚合物的方法。树枝状单体由能够自组装的有机聚合物和核酸构成。各聚合物包含约200个分枝,该分枝可用于附着标记并构成生物学上相容的信号放大技术。根据上下文,该技术可用于揭示多种分析物(例如特定的核酸分子、小分子、蛋白质和肽)的存在。(Described herein are methods of producing dendritic biocompatible polymers from pairs of complementary dendritic nucleic acid monomers in a controlled manner using a polymerization trigger. Dendritic monomers are composed of organic polymers and nucleic acids that are capable of self-assembly. Each polymer contains about 200 branches that can be used to attach labels and constitute a biologically compatible signal amplification technique. Depending on the context, this technique can be used to reveal the presence of a variety of analytes (e.g., specific nucleic acid molecules, small molecules, proteins, and peptides).)
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的HD075605的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本文描述了与用于标记和检测分析物的树枝状单体有关的方法和组合物。
背景技术
需要创新的方案来对复杂混合物中的相关分析物进行检测。大多数分析物没有待用作检测标记的固有信号。因此，迫切需要新技术以用可易于检测的标记物(例如色原体或荧光团)来对分析物进行标记。此外，能够进行信号放大的技术通常比直接标记方法更优选，因为它们增强了信噪比，从而提高了检测的简便性和准确性。此外，所采用的最合适的标记可以在特定情况下有所不同，例如，可取决于样品、分析物的性质，或取决于分析的背景。因此，可被利用且其信号将被放大的标记的类型的灵活性构成了另一期望的特征。理想的分析物检测方法将结合检测分析物的简便方式，同时提供标记灵活性和信号放大能力。因此，在本领域中非常需要能够结合至不同生物部分且赋予信号放大作用的标记试剂，以产生高信噪比，从而有益于检测的灵敏度、准确性和可靠性。
本文描述了满足这些标准的方法和组合物。具体地，如通过聚合触发剂的存在而引发的以受控的方式由成对的互补的树枝状核酸单体生成树枝状生物相容的聚合物。树枝状单体(monomers)由核酸和有机聚合物构成。各聚合物包含约200个分枝(dendrite)，该分枝可用于附着标记并构成生物学上相容的信号放大技术。
发明内容
本文描述了一种组装体，该组装体包含至少两种分子和偶联至分析物结合剂的至少一种核酸触发剂，其中，每种分子包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的核酸茎和结合分枝互补。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约10-24个核苷酸。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约6-10个核苷酸。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约11-13个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含约10-20个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含约13-16个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含约10-25个核苷酸。在其它实施方式中，核酸触发剂包含约12-48个核苷酸。在其它实施方式中，核酸触发剂包含约34-38个核苷酸。在其它实施方式中，核酸茎包含约12-30个核苷酸。在其它实施方式中，核酸茎包含约6-15个核苷酸。在其它实施方式中，核酸茎包含约22-26个核苷酸。在其它实施方式中，有机聚合物包括聚乙二醇。在其它实施方式中，聚乙二醇包含约16-20个碳的长度。在其它实施方式中，分析物结合剂包括多核苷酸。在其它实施方式中，分析物结合剂包括肽或蛋白质。在其它实施方式中，分析物结合剂包括抗体。在其它实施方式中，该方法进一步包括与延伸分枝互补的标记多核苷酸。在其它实施方式中，标记多核苷酸包含荧光团、发色团、色原体、量子点、荧光微球、纳米颗粒、元素标记、金属螯合聚合物、条形码和/或序列条形码(sequential barcode)。
本文进一步描述了一种聚合方法，该方法包括：添加至少两种分子，所述分子各自包含核酸和有机聚合物；进一步添加包含核酸的触发剂分子，并触发自组装聚合，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、结合分枝、延伸分枝。在其它实施方式中，核酸触发剂包括分析物结合剂。在其它实施方式中，该方法包括通过结合与另一分子互补的标记多核苷酸来产生可检测的信号，其中，该标记多核苷酸包括标记试剂。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，并且将至少一种核酸触发剂与分析物结合剂偶联，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的核酸茎和结合分枝互补。在其它实施方式中，该方法包括通过将标记多核苷酸结合至延伸分枝而产生可检测的信号，其中，标记多核苷酸包括标记试剂。
附图说明
图1体系组件。示出了两种互补的树枝状单体，各自包含发夹环、茎和核酸分枝(结合分枝和延伸分枝)的三分结构以及有机聚合物间隔物(图1A和图1B)。示出了核酸触发剂(图1C)。核酸结构域结合分枝1-发夹环1'、茎2-茎2'和结合分枝3-发夹环3'是互补的(即，1-1'、2-2'和3-3'是互补的，并且可以杂交)。结构域5-6是延伸分枝。结构域4(红色)是由有机聚合物组成的间隔元件，其对保持单体稳定性和促进分枝功能至关重要。触发剂(图1C)可结合至区域1并通过分支迁移打开图1A中的第一个分子的发夹环(序列3'-2'的类似发夹也可以用于打开图1B的第二个分子)。当发夹A打开时，这会暴露序列3'-2'，该序列可作为发夹B的触发剂而引起序列1'-2'的暴露。以这种方式，通过单体单元的经触发的自组装来形成树枝状聚合物。
图2组装时的组件。通过触发剂(1)与互补的树枝状单体(2)之间的化学相互作用产生的树枝状聚合物(4)。注意到从聚合物(3)延伸的延伸分枝。
图3自组装机制。核酸触发剂可直接使用(图3A)，或附着至另一核酸寡核苷酸/通过另一核酸寡核苷酸延伸(图3B)，或附着至固体底物(如珠或蛋白质/肽)(图3C)。触发剂可以包含分析物结合剂，此类结合剂可以对多核苷酸、肽、蛋白质、抗体而言是特异性的，从而使图1和图2的放大、聚合过程成为与基础的“检测”技术分隔开的不相连的组成步骤，其中，分析物与分析物结合剂相结合。
图4多模式分枝附着物。通过与延伸分枝(3)杂交而将标记(5)直接附着至树枝状聚合物(4)的实例。需注意的是每个分枝最终将被标记，但为清楚起见，此处仅示出一个。标记可以包括荧光团、量子点、色原体、寡核苷酸等。再次强调的是，此处的“标记”步骤与图1和图2的放大、聚合过程分开。
图5用于降低成本的通用标记策略。在标记方法的变型中，接头寡核苷酸(5)由“地址”(分支的互补序列)和标记结合序列(绿色)组成。由于对于任何数量的体系而言它仅需要一种经标记的寡核苷酸(6)，该策略引起费用的显著节省。
图6二次放大策略的示例。将包含“地址”和二级触发序列(5中的蓝色)的接头寡核苷酸(5)用于引发第二聚合事件，并因此引发另一轮的放大。这引起二次放大(即，n个分析物分子的平方乘数(squared multiplier))。
图7琼脂糖凝胶电泳。从左起：dna梯度(ladder)，仅单体，单体与引发剂(即触发剂)之比为1/10，单体与引发剂之比为1/50，单体与引发剂之比为1/100，dna梯度。注意到在凝胶的顶部于泳道4-5存在大量高分子量分子，而在底部则没有单体(现在所有单体都已掺入聚合物中)。相比之下，在泳道2(仅单体)，仅发生了背景信号放大，且大多数单***于凝胶的底部。
图8体内标记。图8A用树枝状聚合物标记的果蝇胚胎(含有alexa-488荧光团作为二级标记)，并揭示了分节基因even-skipped的表达域。图8B用通过二次放大产生的荧光信标标记的果蝇胚胎(含有alexa-488荧光团)，并揭示了分节基因even-skipped的表达域。
图9体内标记。用树枝状聚合物标记的果蝇胚胎(具有包含铕151的二级标记)，并揭示了分节基因even-skipped的表达域。
图10基于抗体的检测。在另一实施方式中，此处证明了可以产生源自与聚合触发剂/引发剂缀合的抗体的树枝状聚合物。放大是特异性的，因为在未缀合的抗体泳道上未观察到聚合(高分子量条带)，而仅观察到低分子量单体。
图11条形码检测方案。图11A标记-擦除-标记策略通过使与MUSE分枝(3)互补且包含额外6-10个核苷酸长度的突出端的标记寡核苷酸(6)交替来工作。与标记寡核苷酸序列完全互补的擦除物(eraser)寡核苷酸(6')可用于通过分支迁移来移除标记寡核苷酸。这使得能够添加具有不同的荧光团的新的标记寡核苷酸(7)。图11B在标记-淬灭-标记技术中，与树枝状聚合物上的分枝序列互补的、用于标记的包含另外的15个核苷酸的“突出端”序列的第一寡核苷酸构成了第一条形码标记。“突出端”用于锚定包含两个突出端的dsDNA“淬灭基团”标记，一个突出端与第一个标记的突出端互补，且第二个突出端用于锚定下一个标记。“淬灭基团”标记寡核苷酸包含短距离淬灭基团，例如dabcyl和荧光团。淬灭基团标记与在先的标记的突出端的杂交使淬灭基团和在先的荧光团相距很近，从而使第一个荧光团的荧光被淬灭，并且只有在“淬灭基团”标记上包含的荧光团可以发射信号。以这种方式，随后的“淬灭基团”标记可以彼此杂交n次以产生条形码。
图12标记-淬灭-标记示例。对照显示出，当不存在“淬灭基团”标记的情况下，检测用此处的树枝状聚合物标记的转录物需要3％的激光功率。淬灭的结果显示出，必须将激光功率增加到30％来检测淬灭的信号。Alexa 647结果证实，除淬灭基团外，还向该结构添加第二个荧光团。
图13免疫muse。图13A用缀合至MUSE触发剂的抗GFP抗体检测到的GFP融合蛋白。图13B用树枝状聚合物(含有alexa-488荧光团作为二级标记)标记的果蝇胚胎，并显示出even-skipped外显子。
图14量子点标记。用树枝状聚合物(含有QDot 655标记)标记的果蝇胚胎，并显示出分节基因even-skipped的表达域。
图15免疫MUSE。图15A表达GFP融合蛋白(以绿色示出)的果蝇胚胎。图15B使用针对GFP的抗体和带有alexa-594荧光团的MUSE放大的免疫荧光测定(红色显示)。
发夹稳定性的空间位阻。
图16空间位阻。MCP缀合发夹。(泳道1)在无引发剂的情况下放大，而未缀合的发夹保持稳定(泳道3)。这表明MCP强烈干扰了发夹的亚稳定性。此外，无论是否不存在(泳道1)或存在(泳道2)引发剂，相较于未缀合的发夹(泳道4)，放大都是无效的。
图17非常短的MUSE发夹的出色稳定性的证据。非常短的MUSE发夹(此处为6nt立足点(toehold)、10nt茎、16nt分枝)在存储条件下保持其发夹构象，从而使得在无快速冷却的情况下，在没有引发剂的情况下它们不会放大(泳道1)，但在有引发剂的情况下(泳道2)完全放大。相比之下，HCR发夹实际上不是储存的发夹，从而使得在临进行实验之前未迅速冷却为发夹构象时，它们会非特异性地放大(泳道3)以及欠佳地放大(泳道4)。
图18MUSE发夹的快速放大。短的MUSE发夹(此处为10nt立足点、15nt茎、12nt分枝)在45分钟内完全放大(泳道2)，但在无引发剂的情况下不放大(泳道1)。
图19MUSE发夹的非常快速的放大。极短的MUSE发夹(此处为6nt立足点、8nt茎、10nt分枝)在4分钟内完全放大(泳道2)，但在无引发剂的情况下不放大(泳道1)。
具体实施方式
如上所述，MUSE(多模式通用信号增强)是一种纳米技术，能够在检测到感兴趣的分析物后使信号放大。相较于现有技术中的其它检测和标记技术，MUSE是高度通用的。首先，MUSE可以检测多种分析物，并且几乎完全与检测方案无关。对于所讨论的分析物按惯例进行检测(例如，DNA和RNA分析物的原位杂交，蛋白质和肽的免疫组织化学)。其次，MUSE与不同的标记(例如荧光团、量子点和元素标记)广泛相容。这两个特征允许检测几乎所有类型的生物大分子，其信号通过任意数量的所选标记输出。MUSE通过三个组成步骤实现了这种多功能性：检测、放大和标记。传统的分析物检测方案涉及这些组成步骤的不利重叠。例如，RNA原位杂交涉及通常以线性方式直接连接至标记输出的检测。PCR涉及用于检测的杂交之间的重叠、重复的杂交赋予放大、以及经由重复的杂交步骤的放大直接与输出信号相关之间的重叠。相比之下，MUSE通过利用自组装核酸聚合物的特性，分离为检测、放大和标记的组成步骤。通过所设计的将单体自组装成树枝状聚合物的能力来实现放大。结果是，以传统分析物检测方案无法实现的方式，将输出信号的产生和传播与放大分离。
所描述的依赖树枝状聚合物的组合物和方法可用于揭示多种分析物的存在，包括特定的核酸分子、小分子、蛋白质和肽，从而提供检测不同生物部分的灵活性。该组合物和方法包括：i)由核酸发夹环、茎和核酸分枝组成的三分分子，其进一步包含如图1所示的有机聚合物“间隔物”；ii)包含单链核酸寡核苷酸的聚合触发剂；iii)用于分析物检测的亲和配体(即，分析物结合剂)，其组成可在核酸寡核苷酸、蛋白质、肽等之间变化。
三分单体是该技术的关键创新，其使得能够在保持单体功能的同时实现标记的灵活性。先前已经通过杂交链反应(HCR)实现了从单体生成核酸聚合物。然而，尽管设想了支化单体作为实现二次放大的手段(即，n个分析物分子的平方乘数)，但是现有的单体检测体系仅由核酸组成。基于立足点-分支的相互作用，核酸发夹可能会不稳定或锁定(locked-in)。因此，HCR方法受到基础的核酸化学的严格限制，以限制立足点-分支的相互作用。
据发明人所知，用核酸支化发夹进行的二次放大尚未成功。另外，没有现有的形式将两种树枝状聚合物用于二级标记附着，并因此无法使多模式检测变得容易。在开发所述组合物和方法时，发明人还发现核酸骨架的刚性降低了二级标记杂交的效率，突出了核酸支化聚合物的另一局限。
为了修正支化的核酸聚合物的局限，重要的创新是开发了在核酸发夹的茎与核酸分支之间的有机聚合物“间隔物”。间隔物使立足点和分支之间的相互作用最小化，使发夹的稳定性最佳化，使杂交过程中的空间位阻最小化，改变了单体的化学性质，并且可以被进一步官能化(例如，通过选择可光解的间隔物或亲水性间隔物)。此外，该间隔物通过向分枝提供更大的灵活性和移动自由度来分隔开树枝状聚合物的茎和分枝，从而限制了空间位阻以及聚合物的茎与标记之间的其它潜在相互作用。相较于HCR时，MUSE的设计优势提供了极为优越的方法。
可变的试剂纯度的稳健公差(robust tolerance)
例如，支化核酸策略(例如HCR)通常要求DNA寡核苷酸的纯度接近100％，因为截短的单体可能终止反应。如果将1/10的单体截短，平均10单位之后会导致聚合物中止生长。只有非常细致的变性PAGE电泳才允许纯度水平接近100％。然而，电泳纯化中，可将分子附着至单体寡聚体。某些alexa荧光团的附着化学物(氨基、硫醇)受到PAGE变性过程中使用的试剂(尿素、过硫酸铵)的强烈影响，从而使得不可能同时具有100％纯的寡核苷酸和100％缀合(标记)的寡核苷酸。这是现有的支化核酸技术的缺点，并且是标记物与寡核苷酸的附着未与放大步骤分离的直接结果。
MUSE通过将放大和标记相分离提供了一种解决方案。通过使PAGE变性，可以容易地对树枝状单体进行纯化。我们用作标记的寡核苷酸可以通过HPLC以约80％的纯度提供。在大多数情况下，截短的标记被全长的标记比下去，从而使得能够对试剂的可变纯度具有稳健的耐受性。另外，由于经MUSE标记的寡核苷酸已经具有最小长度，因此截短的寡核苷酸可能根本不杂交，从而防止了分支反应的过早终止。因此，截短的标记寡核苷酸不像截短的单体那样显著地影响信号放大。
降低标记成本
MUSE的另一优点是它将单体成本与标记成本分开。传统的支化核酸技术(例如HCR)包含长而昂贵的单体。PAGE纯化的必要性进一步影响产率。该方法的严重缺点是，由于随后需要的苛刻的纯化步骤，仍然使所需的附着化学修饰和标记分子不能实现。分隔开单体和标记合成也有助于提高产率，这也降低了总成本。
当需要研究成组的标记或多重标记时，传统的支化DNA技术的缺点加重。传统的支化DNA技术(例如HCR)针对想要使用的任何alexa-fluor而言需要完整的检测-放大-标记体系。相比之下，MUSE通过将附着化学修饰和标记的成本与发夹的成本分开，从而控制成本。通过将放大体系保持恒定，可以通过标记交换来实现成组的标记或多重标记。鉴于与引发剂呈递分子相关的额外费用，这是特别有利的。对于MUSE，引发剂呈递分子与一个放大体系相关。用传统的支化DNA技术(例如HCR)改变alexa-fluor颜色(或最终改变所使用的标记的化学性质)需要全新的检测-放大-标记体系。
PEG间隔物的优点
聚合的PEG间隔物通过破坏DNA磷酸酯骨架的连续性进一步用于分隔开放大和标记。这增加了在分枝-发夹弯曲点处的灵活性，并使立足点和分枝之间的潜在的碱基配对相互作用最小化。可以改变MUSE分枝而不修饰发夹序列(反之亦然)来替代尝试对仅由DNA组成的工程化树枝状发夹(受可用的核酸设计空间限制)进行工程化。这极大地简化了MUSE体系的设计，从而使得我们可以设想拥有数百个并行运行的体系。此外，它允许彼此独立地优化发夹和分枝序列，从而使得可以设计最佳的发夹和最佳的分枝。在无间隔物的情况下，这并不总是可能的。
标记交换
相较于传统的支化DNA技术，放大后交换标记的可能性是MUSE的重要优势。鉴于它们使得能够同时分析数千个目标，序列条形码方案(例如seqFISH或MERFISH)正变得越来越流行。在seqFISH中，将HCR用于提供信号放大。在各条形码回合之间，每种HCR聚合物都必须用DNA酶消化。因此，每个回合花费大约24小时。
相比之下，例如用我们的标记-擦除-标记方法，也可以通过降低缓冲液中的盐浓度或提高温度，或使用降低杂交能量的试剂(例如甲酰胺)，将MUSE标记从分枝中去除。在每个周期大约2个小时中可以除去MUSE标记并进行交换。由于条形码方案需要很多回合(多至30回合)，这引起显著缩短程序。标记交换的另一实例将涉及多模式标记交换实例。在这里，使用者可以用荧光标记开始实验以获得其样品的高分辨率图像，然后将荧光标记与MCP快速交换，以针对同一样品获得高度复用的数据。
亚稳定性
相较于包括HCR在内的其它支化DNA技术，MUSE发夹具有显著的热稳定性优势。HCR单体被描述为“亚稳定的”(即，可以在溶液中以其使用浓度将它们的发夹构型保持相当长的时间)。然而，经过一段时间后，特别是在存储和运输过程中，它们放弃发夹二级结构，并采用了更加稳定和热力学上有利的均二聚体构型。
发明人发现，短的MUSE发夹、包括非常短的MSUE发夹(6-10个核苷酸的立足点，少于15个核苷酸的茎)表现出不同且优越的化学特征。这些MUSE发夹超过亚稳态，因为它们采用的唯一构象是发夹结构。一些支化DNA技术(例如HCR)要求在实验之前对发夹进行快速冷却，以确保成形。这通过如下来实现：在95℃下使同二聚体变性2-5分钟，然后冷却至室温30分钟。最新的MUSE发夹可以直接从存储中使用。结合下面描述在放大速度方面的增长，这种变化比HCR反应节省多于18个小时。这对使用者也很重要，因为它使MUSE成为可以在一个工作日内使用的技术。
放大速度
HCR聚合物需要大约12个小时以达到其最终尺寸。当前的MUSE体系需要1小时到15分钟。
本文中描述的是组装体，其包含至少两种分子(各自包含核酸和有机聚合物)和包含核酸的触发剂分子，其中，所述至少两种分子和触发剂分子被配置用于自组装聚合，进一步地，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。在其它实施方式中，至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、结合分枝、延伸分枝。在其它实施方式中，核酸触发剂包括分析物结合剂。
本文进一步描述了组装体，其包含至少两种分子和偶联至分析物结合剂的至少一种核酸触发剂，其中，每种分子包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)、以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的核酸茎和结合分枝互补。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约6-10个核苷酸。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约10-24个核苷酸。例如，发夹序列和结合分枝包含6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在其它实施方式中，发夹序列和结合分枝序列为约11-13个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含10-25个核苷酸、包括16-25个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含约10-20个核苷酸。例如，延伸分枝包含16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在其它实施方式中，延伸分枝包含约13-16个核苷酸。在其它实施方式中，核酸触发剂包含约12-48个核苷酸。在其它实施方式中，核酸触发剂包含约34-38个核苷酸。在其它实施方式中，茎为约6-15个核苷酸。在其它实施方式中，核酸茎包含约12-30核苷酸。例如，核酸茎包含6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施方式中，核酸茎包含约24个核苷酸。在其它实施方式中，有机聚合物包括聚乙二醇。被配置用于自组装聚合的上述序列的组装体的实例包含至少两种分子，每种分子包含6个核苷酸的发夹序列和结合分枝、10个核苷酸的核酸茎和16个核苷酸的延伸分枝，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。被配置用于自组装聚合的上述序列的组装体的另一实例包含至少两种分子，每种分子包含8个核苷酸的发夹序列和结合分枝、10个核苷酸的核酸茎和18个核苷酸的延伸分枝，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。被配置用于自组装聚合的上述序列组装体的另外的实例包含至少两种分子，每种分子包含10个核苷酸的发夹序列和结合分枝、15个核苷酸的核酸茎和25个核苷酸的延伸分枝，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。
在其它实施方式中，聚乙二醇包含约16-20个碳的长度。在其它实施方式中，聚乙二醇包括约2nm的长度。在其它实施方式中，聚乙二醇包括约3-8个碱基对的长度。在其它实施方式中，聚乙二醇包括约4个碱基对的长度。在各个实施方式中，聚合物将核酸茎连接至分枝。在各个实施方式中，所述至少两种分子各自是以下单体，该单体包含：约6-10个核苷酸的发夹序列，约6-15个核苷酸的核酸茎，约6-10个核苷酸的结合分枝，约10-25个、包括16-25个核苷酸的延伸分枝，以及约16-20个碳的长度的聚合物。在各个实施方式中，所述至少两种分子各自是以下单体，该单体包含约11-13个核苷酸的发夹序列、约22-26个核苷酸的核酸茎、约11-13个核苷酸的结合分枝、约13-16个核苷酸的延伸分枝、以及约16-20个碳的长度的聚合物。在其它实施方式中，感兴趣的分析物包括核酸。在其它实施方式中，感兴趣的分析物包括小分子。在其它实施方式中，感兴趣的分析物包括聚合物。在其它实施方式中，感兴趣的分析物包括肽或蛋白质。
在其它实施方式中，分析物结合剂包括多核苷酸。在其它实施方式中，分析物结合剂包括肽或蛋白质。在其它实施方式中，分析物结合剂包括抗体。在其它实施方式中，分析物结合剂包括肽或蛋白质。在其它实施方式中，分析物结合剂包括肽核酸。在其它实施方式中，分析物结合剂包括锁核酸。
在其它实施方式中，组装体包括与延伸分枝互补的标记多核苷酸。在其它实施方式中，标记多核苷酸包括荧光团、发色团、色原体、量子点、荧光微球、纳米颗粒、元素标记、金属螯合聚合物、条形码和/或序列条形码，包括本领域普通技术人员已知的任何数量的其它标记试剂。
在各个实施方式中，荧光团包括荧光素、罗丹明、Alexa Fluors、DyLight fluors、ATTO染料或者其任何类似物或衍生物。在一些实施方式中，本发明的标记物包括但不限于荧光素和荧光素的化学衍生物；伊红；羧基荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；Fluoresceinamidite(FAM)；赤藓红；玫瑰红；铜绿假单胞菌细菌分泌的荧光素；亚甲蓝；激光染料；罗丹明染料(例如罗丹明、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明123、金胺O、Sulforhodmine 101、酸性桃红和德克萨斯红)。在各个实施方式中，本发明的标记包括Alexa Fluor家族的荧光染料，包括Alexa-350、Alexa-405、Alexa-430、Alexa-488、Alexa-500、Alexa-514、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-555、Alexa-568、Alexa-594、Alexa-610、Alexa-633、Alexa-647、Alexa-660、Alexa-680、Alexa-700或Alexa-750。
在各个实施方式中，量子点包括半导体纳米晶体。在各个实施方式中，半导体由周期表的II-VI族、III-V族和IV族的元素构成。在各个实施方式中，量子点包括ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlAs、AlSb、PbS、PbSe、Ge和Si以及它们的三元和四元混合物。在各个实施方式中，量子点包括具有较大带隙的半导体的外覆层。在各个实施方式中，半导体纳米晶体的特征在于它们的均匀的纳米尺寸。“纳米”尺寸意味着小于约
在各种实施方式中，组装体还包含另外的至少两种分子和接头分子，所述接头分子包含与初始的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补的核酸序列地址(address)和用于另外的至少两种分子的二级触发剂，其中，另外的至少两种分子和接头分子被配置用于自组装聚合。在各种实施方式中，初始的至少两种分子和触发剂是第一自组装聚合，并且另外的至少两种分子和接头分子是第二自组装聚合。在各种实施方式中，第一和第二自组装聚合是二次放大。在其它实施方式中，组装体包括与另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。
本文进一步描述了试剂盒，该试剂盒具有组装体和使用试剂盒的说明书，所述组装体包含至少两种分子以及偶联至分析物结合剂的至少一种核酸触发剂，其中，每种分子包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)、以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的核酸茎和结合分枝互补。在各种实施方式中，至少两种分子和触发剂被配置用于自组装聚合。在各种实施方式中，该组装体能够产生包含25-50单位的第一分子、第二分子和核酸触发剂子组装体的聚合物，包含约50-100单位的第一分子、第二分子和核酸触发剂子组装体的聚合物，包含约100-150单位的第一分子、第二分子和核酸触发剂子组装体的聚合物，包含约150-200单位的第一分子、第二分子和核酸触发剂子组装体的聚合物，或包含200单位以上的第一分子、第二分子和核酸触发剂子组装体的聚合物。
在各种实施方式中，所述试剂盒进一步包括引入另外的至少两种分子以及接头分子，所述接头分子包含与初始的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补的核酸序列地址和用于另外的至少两种分子的二级触发剂，其中，另外的至少两种分子和接头分子被配置用于自组装聚合。在各种实施方式中，该组装体能够产生包含25-50单位的另外的第一分子、第二分子和接头子组装体的聚合物，包含约50-100单位的另外的第一分子、第二分子和接头子组装体的聚合物，包含约100-150单位的另外的第一分子、第二分子和接头子组装体的聚合物，包含约150-200单位的另外的第一分子、第二分子和接头子组装体的聚合物，或包含200单位以上的另外的第一分子、第二分子和接头子组装体的聚合物。
在其它实施方式中，试剂盒包含与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。在各种实施方式中，试剂盒包含两种以上的标记多核苷酸，每种标记多核苷酸与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补。
本文描述了聚合的方法，该方法包括：添加至少两种分子，所述分子各自均包含核酸和有机聚合物；进一步添加包含核酸的触发剂分子，并触发自组装聚合，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、结合分枝、延伸分枝。在其它实施方式中，核酸触发剂包括分析物结合剂。在其它实施方式中，通过结合与另一分子互补的标记多核苷酸产生可检测的信号，其中，所述标记多核苷酸包含标记试剂。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，并且所述至少一种核酸触发剂与分析物结合剂偶联，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的结合分枝和核酸茎互补。在其它实施方式中，产生可检测的信号包括将标记多核苷酸结合至延伸分枝，其中，所述标记多核苷酸包含标记试剂。在其它实施方式中，标记试剂包括荧光团、发色团、色原体、量子点、荧光微球、纳米颗粒、元素标记、金属螯合聚合物、条形码和/或序列条形码，包括本领域普通技术人员已知的任何数量的其它标记试剂。在各种实施方式中，聚合物将核酸茎连接至分枝。在各种实施方式中，所述至少两种分子各自是以下单体，该单体包含：约6-10个核苷酸的发夹序列，约6-15个核苷酸的核酸茎，约6-10个核苷酸的结合分枝，约10-25个、包括16-25个核苷酸的延伸分枝，以及约16-20个碳的长度的聚合物。在各种实施方式中，至少两种分子各自是以下单体，该单体包含约11-13个核苷酸的发夹序列、约12-30个核苷酸的核酸茎、约11-13个核苷酸的结合分枝、约13-16个核苷酸的延伸分枝、以及约16-20个碳的长度的聚合物。在其它实施方式中，核酸触发剂包含约12-48个核苷酸。在各种实施方式中，聚合物将核酸茎连接至分枝。在各种实施方式中，以与核酸触发剂的约1:25、1:50、1:100、1:200以及其间的所有范围的比例，添加所述至少两种分子。
例如，如图1所示，图1A中的第一分子的结合分枝1与图1B中的第二分子的发夹1′互补。第一分子和第二分子各自包含茎，所述茎包含互补的核酸序列2-2'。图1A中的第一分子的发夹序列3与图1B中的第二分子的结合分枝3'互补。图1A中的第一分子包含延伸分枝5；图1B中的第二分子包含另一延伸分枝6。图1A和图1B中的第一分子和第二分子两者分别包含间隔域4，间隔域4可以包含有机聚合物。第三分子(图1C的核酸触发剂)可以结合至图1A的第一分子的结合分枝1，并将第一分子打开(也可以使用序列3’-2’的类似发夹)。图1A的第一分子的打开暴露了发夹3′和茎2′的序列，其作为图1B的第二分子的发夹3和茎2′的触发剂而工作。第二分子的发夹1′和茎2′的暴露与初始的核酸触发剂类似地工作，再次打开另一第一分子，引起另一第二分子打开。以这种方式，通过触发的自组装形成树枝状聚合物。组装的第一分子和第二分子以及触发剂的所得聚合物如图2所示。延伸分枝5和/或6可以各自直接结合至分析物、标记或额外的聚合物，或两者直接结合至分析物、标记或额外的聚合物。
在各种实施方式中，该方法进一步包括引入另外的至少两种分子、以及接头分子，所述接头分子包含与初始的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补的核酸序列地址和用于另外的至少两种分子的二级触发剂，其中，另外的至少两种分子和接头分子被配置用于自组装聚合。在各种实施方式中，初始的至少两种分子和触发剂是第一自组装聚合，并且另外的至少两种分子和接头分子的引入是第二自组装聚合。在各种实施方式中，第一和第二自组装聚合是二次放大。在其它实施方式中，组装体包含与另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。例如，使用延伸分枝5和/或6产生额外的聚合物支持了二次放大，如图6所示。
在各种实施方式中，自组装聚合包括将至少两种分子和触发剂分子孵育1分钟至60分钟、1小时至12小时、12小时至24小时、24小时以上。在各种实施方式中，这包括孵育1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、5-10分钟、10-30分钟、30-60分钟、1-2小时或2小时以上。在各种实施方式中，孵育2小时至24小时。在各种实施方式中，其中，另外的接头分子包括与一个或多个延伸分枝互补的地址和用于另外添加的至少两种分子的触发剂，对该接头分子和另外添加的至少两种分子的二级孵育为1分钟至60分钟、1小时至12小时、12小时至24小时、24小时以上。在各种实施方式中，这包括孵育1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、5-10分钟、10-30分钟、30-60分钟、1-2小时或2小时以上。在各种实施方式中，孵育2小时至24小时。
本文描述了聚合的方法，所述方法包括将至少两种分子(各自包含核酸和有机聚合物)添加至包含至少一种触发剂分子(包含核酸)的材料，并触发自组装聚合，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、结合分枝、延伸分枝。在其它实施方式中，至少一种核酸触发剂分子包括分析物结合剂。在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、核酸分枝(包括结合分枝和延伸分枝)以及有机聚合物，并且进一步地，其中，至少一个第一分子的核酸发夹序列与至少一个第二分子的核酸结合分枝序列互补，并且其中，至少一个第二分子的核酸发夹序列与至少一个第一分子的核酸结合分枝序列互补，并且所述至少一种核酸触发剂与分析物结合剂偶联，其中，所述核酸触发剂与至少一个第一分子的结合分枝和核酸茎互补。
在各种实施方式中，材料包括基底，例如固体基底或液体基底。在各种实施方式中，固体基底包括玻璃、组织培养表面或本领域技术人员已知的任何类似基底。在各种实施方式中，至少一种触发剂分子附着至固体表面，例如一种或多种触发剂分子中的多个沉积在所述表面(例如，阵列)。在各种实施方式中，至少一种触发剂分子分散在液体基底内。
在各种实施方式中，材料包括感兴趣的分析物。在各种实施方式中，材料是生物样本，包括整体装片、组织切片、一个或多个组织和细胞等。在各种实施方式中，将感兴趣的分析物与触发剂分子的分析物结合剂结合。在各种实施方式中，生物样本沉积在固体基底的表面上。在各种实施方式中，生物样本分散在液体基底内。
在其它实施方式中，该方法包括通过结合与另一分子互补的标记多核苷酸来产生可检测信号，其中，该标记多核苷酸包括标记试剂。在其它实施方式中，产生可检测的信号包括将标记多核苷酸结合至延伸分枝，其中，所述标记多核苷酸包括标记试剂。在其它实施方式中，该方法包括与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。在各种实施方式中，该方法包括两个以上的标记多核苷酸，每个标记多核苷酸与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补。
在各种实施方式中，该方法与溶液中的核酸序列的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与固相(ISH)中的核酸序列的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与溶液中的小分子的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与固相中的小分子的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与溶液中的肽和蛋白质的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与固相中的肽和蛋白质的检测和/或信号放大或两者组合使用。在各种实施方式中，该方法与来自第一抗体的信号放大(例如ELISA和免疫荧光)组合使用。在各种实施方式中，该方法与来自第二抗体的信号放大(例如ELISA和免疫荧光)组合使用。
本文还描述了如下的方法，该方法包括提供包含感兴趣的分析物的样品。在各种实施方式中，该方法包括：添加至少两种分子，每种分子包含核酸和有机聚合物；进一步添加包含核酸的触发剂分子，并触发聚合，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。在其它实施方式中，该方法包括使样品与触发剂结合，并添加至少两种分子，每种分子包含核酸和有机聚合物，进一步添加包含核酸的触发剂分子，并触发聚合，其中，每种分子包含与另一分子互补的一个或多个序列。
在其它实施方式中，所述至少两种分子各自包含核酸发夹、核酸茎、结合分枝、延伸分枝。在各种实施方式中，聚合物将核酸茎连接至分枝。在其它实施方式中，核酸触发剂包括分析物结合剂。在其它实施方式中，该方法包括通过结合与另一分子互补的标记多核苷酸来产生可检测信号，其中，该标记多核苷酸包含标记试剂。
在各种实施方式中，该方法进一步包括引入另外的至少两种分子、以及接头分子，该接头分子包含与初始的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补的核酸序列地址和用于另外的至少两种分子的二级触发剂，其中，另外的至少两种分子和接头分子被配置用于自组装聚合。在各种实施方式中，初始的至少两种分子和触发剂是第一自组装聚合，并且另外的至少两种分子和接头分子的引入是第二自组装聚合。在各种实施方式中，第一和第二自组装聚合是二次放大。在其它实施方式中，组装体包含与另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。
在其它实施方式中，该方法包括通过结合与另一分子互补的标记多核苷酸来产生可检测信号，其中，该标记多核苷酸包含标记试剂。在其它实施方式中，产生可检测的信号包括将标记多核苷酸结合至延伸分枝，其中，所述标记多核苷酸包括标记试剂。在其它实施方式中，该方法包括与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的延伸分枝互补的标记多核苷酸。在各种实施方式中，该方法包括两个以上的标记多核苷酸，每个标记多核苷酸与初始的至少两种分子和/或另外的至少两种分子的一个或多个延伸分枝互补。
在各种实施方式中，该方法包括条形码序列的生成。在各种实施方式中，该方法包括添加包含突出端序列、信号标记和与延伸分枝互补的序列的第一寡核苷酸，以及引入dsDNA寡核苷酸，该dsDNA寡核苷酸包含含有两个突出端的淬灭基团标记、与第一寡核苷酸的突出端互补的第一dsDNA突出端和第二dsDNA突出端。在各种实施方式中，dsDNA寡核苷酸淬灭基团标记包括短距离淬灭基团，例如dabcyl和荧光团。在各种实施方式中，可将一种或多种dsDNA淬灭基团标记彼此杂交n次以产生条形码。
在各种实施方式中，该方法包括至少两种寡核苷酸，该寡核苷酸包括标记寡核苷酸和擦除物寡核苷酸。在各种实施方式中，标记寡核苷酸包括与延伸分枝互补的第一突出端序列和第二突出端序列。在各种实施方式中，擦除物寡核苷酸是与标记寡核苷酸互补的序列。在各种实施方式中，该方法包括通过将擦除物寡核苷酸引入至用标记寡核苷酸标记的分析物来进行擦除，清理擦除物-标记dsDNA寡核苷酸二聚体，以及添加额外的标记寡核苷酸。在各种实施方式中，将标记-擦除-标记循环重复n次以产生条形码。
实施例
实施例1
分子机制
本发明人的方法以下列方式起作用：树枝状单体的互补对可用于在聚合触发剂的存在下经分支迁移和核酸杂交的链式反应，以可控的方式通过自组装产生树枝状聚合物(图1和图2)。触发剂可以直接使用，也可以与亲和配体组合使用(图3和图4)。亲和配体的性质决定了待检测的分析物的类型。例如，可将聚合物的每个分枝用于附着所选的标记，例如荧光团、量子点或金属螯合聚合物(图5)。每种树枝状聚合物包含约两百个分枝。因此，可将大量标记最终连接至感兴趣的靶标，从而极大地倍增其信号并使其检测迅速而明确。聚合后，可以通过直接将核酸单体与分枝杂交(在放大之前或之后)或通过形成包含独特序列的核酸双链体来完成标记，该独特序列与靶标分枝和标记的核酸单体互补(图6)。第二种方法的附加优势是显著降低多重标记的成本，因为单个标记的核酸单体可以与任何特定的互补标记结合，从而使所需的昂贵部分的数量除以待同时标记的元素的数量(图6)。相较于诸如HCR的类似技术，以相对低的成本同时标记和放大大量配体的信号的潜力是该方法的重要优势。通过与单独体系的触发剂序列相邻，二级标记也可用于执行二次放大。该方法的主要优点是使涉及分析物结合/标记和信号放大的过程分开，因为常规技术整合或紧密依赖于这两个步骤。
实施例2
优势
另一考虑因素：由于二级结构效应(例如空间位阻)，某些荧光团和其它信号标记与发夹寡核苷酸不相容。相对于直接附着至可以采用二级结构的长的寡核苷酸，互补的探针标记消除了这些影响并提高了合成产率。相较于能够实现类似目标的其它方法，发明人的方法具有以下数个优势：
-通过生成树枝状聚合物而不是裸露的直接标记的结构(例如，在HCR中)，发明人的方法在可被使用且其信号将被放大的标记的性质方面提供了更大的灵活性和模块性。这将使得使用者能够根据具体情况选择所选的最合适的标记。这为使用者提供了灵活性，从而使得可以与本文所述的方法正交使用的各种检测方法提供补充信息。
-相较于HCR，发明人的方法通过使发夹的复杂性保持较低并使得能够组合使用标记的核酸单体来标记各种信标，从而显著降低了成本。
-相较于支化DNA方法，发明人的方法自主地生成树枝状DNA结构，从而使得使用者不必进行数轮核酸杂交。
-传统方法繁琐且容易出错，从而使该技术对使用者不友好。
-相较于支化DNA方法，发明人的方法采用了更易于合成的组分，这将显著节省成本并提高产量。在某些情况下，例如整体装片样品的检测，与较大的结构相比，所使用的相对较小的发夹结构在扩散能力方面更优异，从而提供了信号生成优势。
-相较于色原体/酪酰胺方法，该技术允许更大程度的多路复用。此外，由于该技术依赖于核酸化学，因此其是生物相容的并且对感兴趣的样品的影响最小。因此，它更简单，且更加允许对相同样品进行平行或顺序研究，例如免疫组织化学、免疫荧光和核酸测序。
实施例3
树枝状放大器设计考虑因素
所描述的方法允许极其大量的序列设计用于标记组合。例如，对于具有12个核苷酸长度的立足点/环、24个核苷酸长度的茎和15个核苷酸长度的分枝的体系而言，存在412×424×412×415＝463＝8.5×1037种可能的序列。这种难以置信的大的设计空间提供了生成非常大量或正交的体系的可能性。发明人已经建立了用于产生最佳的放大体系的设计标准。
例如，理想的序列组合满足某些设计标准，该标准包括：优选的发夹二级结构的替代构象最小化，立足点和分枝之间的相互作用最小化，以及茎的稳定性最大化。更详细地，选择序列以使关键位置中(例如，立足点的前缘，立足点的最后位置和茎的前两个位置、通常在茎内，以及分枝的前缘处)的碱基堆积相互作用最大化。示出了满足这些设计标准的各种示例序列。
实施例4
自组装树枝状聚合体系的示例序列
体系1
触发剂1 GTCCCACTCTCACCTCACCCGCACCATTTCATTTCC[SEQ ID NO：1]
触发剂2 CCTTATCTATTCGTCCCACTCTCACCTCACCCGCAC[SEQ ID NO：2]
单体1 GGAAATGAAATGGTGCGGGTGAGGTGAGAGTGGGACCCTTATCTATTCGTCCCACTCTCACCTCACCCGCAC[SEQ ID NO：3]-间隔物-ACTAACCCTAAACAC[SEQ ID NO：4]
单体2 CTCCACTCATACACC[SEQ ID NO：5]-间隔物-GTCCCACTCTCACCTCACCCGCACCATTTCATTTCCGTGCGGGTGAGGTGAGAGTGGGACGAATAGATAAGG[SEQ ID NO：6]
体系2
触发剂1 CACCGTCCCATCCATCCCAGCCTCCAATACAATACC[SEQ ID NO：7]
触发剂2 CCTAATCAAATCCACCGTCCCATCCATCCCAGCCTC[SEQ ID NO：8]
单体1 GGTATTGTATTGGAGGCTGGGATGGATGGGACGGTGCCTAATCAAATCCACCGTCCCATCCATCCCAGCCTC[SEQ ID NO：9]-间隔物-ATCTCATCTCATCCC[SEQ ID NO：10]
单体2 TTCCACTTACTCCCG[SEQ ID NO：11]-间隔物-CACCGTCCCATCCATCCCAGCCTCCAATACAATACCGAGGCTGGGATGGATGGGACGGTGGATTTGATTAGG[SEQ ID NO：12]
体系3
触发剂1 CTGCCTCACCTACTACCCTCGCTCCAAATCAAATCC[SEQ ID NO：13]
触发剂2 CCTAAACTAATCCTGCCTCACCTACTACCCTCGCTC[SEQ ID NO：14]
单体1 GGATTTGATTTGGAGCGAGGGTAGTAGGTGAGGCAGCCTAAACTAATCCTGCCTCACCTACTACCCTCGCTC[SEQ ID NO：15]-间隔物-ACCCTTACCTCTACC[SEQ ID NO：16]
单体2 CTCCATCCATCTCAC[SEQ ID NO：17]-间隔物-CTGCCTCACCTACTACCCTCGCTCCAAATCAAATCCGAGCGAGGGTAGTAGGTGAGGCAGGATTAGTTTAGG[SEQ ID NO：18]
体系4
触发剂1 CTCGCCCTTACACCTCACCCGCTCCTAAACTAAACC[SEQ ID NO：19]
触发剂2CCTTTACTTTACCTCGCCCTTACACCTCACCCGCTC[SEQ ID NO：20]
单体1 GGTTTAGTTTAGGAGCGGGTGAGGTGTAAGGGCGAGCCTTTACTTTACCTCGCCCTTACACCTCACCCGCTC[SEQ ID NO：21]-间隔物-ATTCCCATACTCTTC[SEQ ID NO：22]
单体2 CTTCCAATCATCCCG[SEQ ID NO：23]-间隔物-CTCGCCCTTACACCTCACCCGCTCCTAAACTAAACCGAGCGGGTGAGGTGTAAGGGCGAGGTAAAGTAAAGG[SEQ ID NO：24]
体系5
触发剂1 CTGCCTCACCTCCAACTCCCGCTCCTATTCATTTCC[SEQ ID NO：25]
触发剂2 CCTTTACTATTCCTGCCTCACCTCCAACTCCCGCTC[SEQ ID NO：26]
单体1 GGAAATGAATAGGAGCGGGAGTTGGAGGTGAGGCAGCCTTTACTATTCCTGCCTCACCTCCAACTCCCGCTC[SEQ ID NO：27]-间隔物-ACACTCTACAACTAC[SEQ ID NO：28]
单体2 CCAATCAATCCCTAC[SEQ ID NO：29]-间隔物-CTGCCTCACCTCCAACTCCCGCTCCTATTATTTTTTCCGAGCGGGAGTTGGAGGTGAGGCAGGAATAGTAAAGG[SEQ ID NO：30]
体系6
触发剂1 CACCGACCATCCATACACCGCCACCTTTACATTTCC[SEQ ID NO：31]
触发剂2 CCTTTACTATTCCACCGACCATCCATACACCGCCAC[SEQ ID NO：32]
单体1 GGAAATGTAAAGGTGGCGGTGTATGGATGGTCGGTGCCTTTACTATTCCACCGACCATCCATACACCGCCAC[SEQ ID NO：33]-间隔物-TCACTAACTAAACTC[SEQ ID NO：34]
单体2 TTCAATCATCACCAG[SEQ ID NO：35]-间隔物-CACCGACCATCCATACACCGCCACCTTTACATTTCCGTGGCGGTGTATGGATGGTCGGTGGAATAGTAAAGG[SEQ ID NO：36]
体系7
触发剂1 CAGCCTCACCATAACATCACCGACCTAAACTAAACC[SEQ ID NO：37]
触发剂2 CCTTTACATTTCCAGCCTCACCATAACATCACCGAC[SEQ ID NO：38]
单体1 GGTTTAGTTTAGGTCGGTGATGTTATGGTGAGGCTGCCTTTACATTTCCAGCCTCACCATAACATCACCGAC[SEQ ID NO：39]-间隔物-AATCCAATCACATCC[SEQ ID NO：40]
单体2 CTTCAATCTCACCCG[SEQ ID NO：41]-间隔物-CAGCCTCACCATAACATCACCGACCTAAACTAAACCGTCGGTGATGTTATGGTGAGGCTGGAAATGTAAAGG[SEQ ID NO：42]
体系8
触发剂1 CTCCGACCTCTACTACCCTGCCTCCATAACAATTCC[SEQ ID NO：43]
触发剂2 CCAAATCTAAACCTCCGACCTCTACTACCCTGCCTC[SEQ ID NO：44]
单体1 GGAATTGTTATGGAGGCAGGGTAGTAGAGGTCGGAGCCAAATCTAAACCTCCGACCTCTACTACCCTGCCTC[SEQ ID NO：45]-间隔物-ACCCTACTCTCACTC[SEQ ID NO：46]
单体2 TCACTTATACTCCTG[SEQ ID NO：47]-间隔物-CTCCGACCTCTACTACCCTGCCTCCATAACAATTCCGAGGCAGGGTAGTAGAGGTCGGAGGTTTAGATTTGG[SEQ ID NO：48]
体系9
触发剂1 CAGCCACTTTCACCATACACCGACCTTTACTTTACC[SEQ ID NO：49]
触发剂2CCAAATCAATACCAGCCACTTTCACCATACACCGAC[SEQ ID NO：50]
单体1 GGTAAAGTAAAGGTCGGTGTATGGTGAAAGTGGCTGCCAAATCAATACCAGCCACTTTCACCATACACCGAC[SEQ ID NO：51]-间隔物-AATCCCAATCCAAAC[SEQ ID NO：52]
单体2 CTTTCATACTACTCC[SEQ ID NO：53]-间隔物-CAGCCACTTTCACCATACACCGACCTTTACTTTACCGTCGGTGTATGGTGAAAGTGGCTGGTATTGATTTGG[SEQ ID NO：54]
体系10
触发剂1 CTCGCCCACTCACCTCACCCGCACCTTATCATTTCC[SEQ ID NO：55]
触发剂2 CCAAATCAAATCCTCGCCCACTCACCTCACCCGCAC[SEQ ID NO：56]
单体1 GGAAATGATAAGGTGCGGGTGAGGTGAGTGGGCGAGCCAAATCAAATCCTCGCCCACTCACCTCACCCGCAC[SEQ ID NO：57]-间隔物-TACCCTAACCTCTAC[SEQ ID NO：58]
单体2 CCTTTACTACTCCCG[SEQ ID NO：59]-间隔物-CTCGCCCACTCACCTCACCCGCACCTTATCATTTCCGTGCGGGTGAGGTGAGTGGGCGAGGATTTGATTTGG[SEQ ID NO：60]
体系11 10立足点-15茎-12分枝
引发剂1 CACGCTCCACTCCACCTAACTAACC[SEQ ID NO：61]
引发剂2 CCATACATACCACGCTCCACTCCAC[SEQ ID NO：62]
发夹1 GGTTAGTTAGGTGGAGTGGAGCGTGCCATACATACCACGCTCCACTCCAC[SEQ ID NO：63]-间隔物-ATCATCTCATCC[SEQ ID NO：64]
发夹2 CCTAAATCTCTA[SEQ ID NO：65]-间隔物-CACGCTCCACTCCACCTAACTAACCGTGGAGTGGAGCGTGGTATGTAT[SEQ ID NO：66]
体系12 8立足点-10茎-18分枝
引发剂1 ATCGCCTAGCCTTAATCC[SEQ ID NO：67]
引发剂2 CCTTTATCATCGCCTAGC[SEQ ID NO：68]
发夹1 AACGCCAACCCAAATACC[SEQ ID NO：69]-间隔物-ATCGCCTAGCCTTAATCCGCTAGGCGATGATAAAGG[SEQ ID NO：70]
发夹2 GGATTAAGGCTAGGCGATCCTTTATCATCGCCTAGC[SEQ ID NO：71]-间隔物-CCTATTTCAACGCCAACC[SEQ ID NO：72]
体系13 6立足点-10茎-16分枝
引发剂1 AACCCGAACCTAAAGC[SEQ ID NO：73]
引发剂2 GCTTTAAACCCGAACC[SEQ ID NO：74]
发夹1 GCTTTAGGTTCGGGTT[SEQ ID NO：75]-间隔物-GCTTTAAACCCGAACCATACCCACACCACAACCC[SEQ ID NO：76]
发夹2 CCCAACCACCACCAATAACCCGAACCTAAAGC[SEQ ID NO：77]-间隔物-GGTTCGGGTTTAAAGC[SEQ ID NO：78]
体系14 6立足点-8茎-10分枝
引发剂1 CGCCACCCTAAACC[SEQ ID NO：79]
引发剂2 CCATTTCGCCACCC[SEQ ID NO：80]
发夹1 GGTTTAGGGT[SEQ ID NO：81]-间隔物-GGCGCCATTTCGCCACCCATCTCTTCCC[SEQ ID NO：82]
发夹2CCCTCTACTACGCCACCCTAAACCGGGT[SEQ ID NO：83]-间隔物-GGCGAAATGG[SEQID NO：84]
实施例5
示例性标记技术：果蝇胚胎方案
本文描述了用于标记果蝇胚胎的示例性技术。从固定在4％PFA中并在-20℃下于甲醇中储存的胚胎开始，按如下操控样品。
1.复水
a.处于PBS中的80％甲醇，5分钟，
b.处于PBS中的50％甲醇，5分钟，
c.处于PBS中的25％甲醇，5分钟。
2.ProK处理
a.在处于PBST中的3μg/ml ProK中孵育13分钟，
b.在冰上转移1小时，
c.用2mg/ml甘氨酸封闭proK 2分钟，
d.重复甘氨酸封闭，
e.用PBST冲洗2×，
f.在PBST中洗涤3×5分钟。
3.后固定
a.伴随着振荡，在处于PBST中的4％PFA中固定20分钟，
b.在PBST中洗涤3×5分钟。
4.探针杂交
a.添加100μl经预热的(45℃)杂交缓冲液，
b.在45℃下孵育30分钟，
c.通过将0.1μl(0.5pM)的每种1μM探针储备液添加至100
μl经预热的(45℃)杂交缓冲液来制备探针溶液，
d.除去“预杂交”缓冲液，
e.样品此时可以储存(1-2周)，
f.添加100μl上面制备的杂交缓冲液+探针，
g.在45℃下孵育4小时或过夜，
h.用经预热的(45℃)洗涤缓冲液洗涤，
i.4×15分钟。
5.树枝状聚合物的生成
a.在上述最后一个洗涤步骤期间，开始快速冷却：
i.将2μl的每种发夹溶液置于分开的eppi中，
ii.在95℃下熔融90秒，
iii.在RT下置于抽屉中30分钟，
iv.在此期间，用100μl放大缓冲液更换洗涤缓冲液，保持在
RT下，
v.除去“预放大”缓冲液(至少10分钟后)，
vi.向H1添加100μl RT放大缓冲液，然后转移至H2，且最后
转移至样品，
vii.在RT下孵育1小时或长达过夜，避光，
viii.用5×SSCT洗涤，
1.2×5分钟，
2.2×30分钟。
6.标记
i.在100μl 5×SSCT中添加1pmol标记，
ii.在RT下杂交1小时，
iii.在5×SSCT中洗涤4×15分钟。
7.装片并成像。
II.FFPE载玻片方案
1.除去石蜡
添加500μl二甲苯，3分钟，
添加500μl二甲苯，3分钟，
添加500μl 1:1的二甲苯乙醇，3分钟，
用500μl乙醇洗涤3分钟，
用500μl乙醇洗涤3分钟。
2.复水
95％乙醇，3分钟，
70％乙醇，3分钟，
50％乙醇，3分钟，
PBST，3分钟，
PBST，3分钟。
3.蛋白酶K消化
在37℃下将载玻片浸入10μg/mL蛋白酶K溶液中40分钟，
在室温下在PBST中洗涤载玻片2×3分钟。
4.预杂交
对两个加湿腔室进行预热，一个在45℃下预热，且另一个在
65℃下预热，
通过在Kimwipe上吸干边缘来干燥载玻片，
在组织样品的顶部加入400μL探针杂交缓冲液，
在65℃加湿腔室内预杂交10分钟，
通过将0.2pmol的每种探针(每种探针1μL的1μM储备液)
添加至100μL的45℃的探针杂交缓冲液来制备探针溶液，
除去预杂交溶液，并通过在Kimwipe上吸干边缘来排掉载玻片
上的多余的缓冲液，
在组织样品的顶部添加400μL探针溶液，
将盖玻片置于组织样品上，并在45℃的加湿腔室中孵育2-4小
时或过夜，
在1ml的45℃的洗涤缓冲液中洗涤4×。
5.清洗探针
用在45℃下预热的洗涤缓冲液洗涤4×15分钟，
用5×SSCT洗涤两次。
6.制备单体
每100μl反应体积需要2μl发夹1和发夹2，
快速冷却：在95℃下3分钟->在冰上3分钟->在RT下25分钟。
7.预放大
添加400μl放大缓冲液，在RT下10分钟，
吸干预放大缓冲液，
在放大缓冲液中添加发夹，
在RT下孵育1小时或长至过夜。
8.洗涤单体
在RT下用5×SSCT洗涤4×15分钟，
添加标记(1pmol标记)，
杂交1小时，
在RT下用5×SSCT洗涤4×15分钟。
9.装片并成像
III.抗体放大方案
继续进行正常的抗体染色方案，直到在PBST中对第一抗体进行洗涤之后。
1.制备单体：
每100μl反应体积需要2μl单体1和单体2，
分别快速冷却各2μl的单体，
快速冷却：在95℃下3分钟->在冰上3分钟->在RT下25分钟。
2.放大
将单体与适量的5×SSCT混合，
向样品添加适量的在5×SSCT中的预制备的单体，
在RT下孵育1小时或长至过夜。
3.洗涤单体
在RT下用5×SSCT洗涤4×15分钟，
添加标记(1pmol标记)，
杂交1小时，
在RT下用5×SSCT洗涤4×15分钟。
4.装片并成像
缓冲液：
5×SSCT-750mM氯化钠、75mM柠檬酸三钠、0.1％吐温20、
1升双蒸水。
缓冲液：
5×SSC-750mM氯化钠、75mM柠檬酸三钠、0.1％吐温20、1升双蒸馏水。
5×SSCT
5×SSC-0.1％吐温20
杂交缓冲液-50％甲酰胺、5×SSC、9mM柠檬酸(pH 6)、50
μg/mL肝素、1×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、0.1％吐温20。
洗涤缓冲液-50％甲酰胺、5×SSC、9mM柠檬酸(pH 6)、50
μg/mL肝素、0.1％吐温20。
放大缓冲液-5×SSCT、10％硫酸葡聚糖。
实施例6
条形码标记方法
多模式设计允许使用不同的标记试剂，包括其本身并入了组合方法的标记技术的进一步变化。例如，序列条形码方法使得能够生成Sn条形码，其中，S是不同信号种类的数量(例如，以不同波长发射的荧光团)，且n是序列标记运行的数量。
可将树枝状聚合物用于产生条形码序列。发明人已经设计出两种方法，它们通过使得能够在对所研究的样品而言温和的缓冲液中进行荧光标记的快速和环境温度交换而对传统方法进行改进。在标记-淬灭-标记技术中，与树枝状聚合物上的分枝序列互补的、用于标记的包含另外的15个核苷酸的“突出端”序列的第一寡核苷酸构成了第一条形码标记。“突出端”用于锚定包含两个突出端的dsDNA“淬灭基团”标记，一个突出端与第一个标记的突出端互补，且第二个突出端用于锚定下一个标记。“淬灭基团”标记寡核苷酸包含短距离淬灭基团，例如dabcyl和荧光团。淬灭基团标记与在先的标记的突出端的杂交使淬灭基团和在先的荧光团相距很近，从而使第一个荧光团的荧光被淬灭，并且只有在“淬灭基团”标记上包含的荧光团可以发射信号。以这种方式，随后的“淬灭基团”标记可以彼此杂交n次以产生条形码。
标记-擦除-标记方法需要两种寡核苷酸。该标记与分枝互补，并包含12个碱基对的突出端。擦除物与标记完全互补，包含12个碱基对的突出端。为了开始标记替换，将擦除物寡核苷酸添加至在先标记的样品。擦除物与标记的突出端的杂交将触发分支迁移事件，从而使得当标记从分枝脱离时，将产生擦除物-标记dsDNA寡核苷酸二聚体。然后可以将擦除物-标记二聚体洗掉。最后，将新标记添加至样品。这些标记-擦除-标记循环可以重复n次以生成条形码。与标记-淬灭-标记方法相比，该方法更简单且更便宜。
实施例7
另外的方案
如所述的，MUSE包括三个组成步骤：检测、放大和标记。通常作为对所谈论的分析物以及所研究的样品的类型而言的惯例进行检测(例如，对DNA和RNA分析物进行的原位杂交，对蛋白质和肽进行的免疫组织化学法)。在检测分析物之后，常见的放大过程涉及核酸单体的自组装。MUSE与所选择的不同标记相容；因此，标记方案将根据所使用标记的类型而变化。以下是另外的检测、放大和标记方案，以及代表性结果。
实施例8
检测方案
检测方案独立于MUSE放大和标记步骤。为了相容性，唯一的要求是在MUSE放大步骤之前样品处于相容的缓冲液(例如5×SSCT，PBS)中。
以下是用于DNA、RNA和蛋白质检测的检测方案的示例。
实施例9
在FFPE载玻片上的DNA原位杂交
1.在92℃下，在2×SSCT+50％甲酰胺中孵育3分钟，
2.在60℃下转移到具有2×SSCT+50％甲酰胺的科普林缸，
3.孵育20分钟，
4.移出载玻片并使其冷却至RT，
5.添加25μl的由2×SSCT、50％甲酰胺、10％(w/v)硫酸葡聚糖、10μg RNase A和10-20pmol的探针组成的杂交缓冲液，
6.盖上盖玻片并用橡胶胶水密封，
7.使橡胶胶水在室温下风干5’，
8.在92℃下变性3分钟，
9.将载玻片转移到加湿腔室，在37℃下杂交过夜，
10.移出盖玻片并在60℃下在具有2×SSCT的经预热的科普林缸中清洗载玻片15分钟，
11.在RT下转移至容纳有2×SSCT的科普林缸中，以及
12.孵育10分钟，
13.在室温下将载玻片转移至容纳有0.2×SSC的科普林缸中，以及
14.孵育10分钟，
15.在滤纸上吸干边缘以去除大部分缓冲液，不使载玻片变干，
16.添加装片介质并装片。
实施例10
果蝇胚胎上的RNA原位杂交。
1.处于PBS中的80％甲醇，5分钟，
2.处于PBS中的50％甲醇，5分钟，
3.处于PBS中的25％甲醇，5分钟，
4.在处于PBST中的3μg/ml ProK中孵育13分钟，
5.在冰上转移1小时，
6.用2mg/ml甘氨酸封闭proK 2分钟，
7.重复，
8.用PBST冲洗2×，
9.在PBST中清洗3×5分钟，
10.后固定，
11.随着振荡在处于PBST中的4％PFA中固定20分钟，
12.在PBST中洗涤3×5分钟，
13.添加100μl经预热的(45℃)杂交缓冲液，
14.在45℃下孵育30分钟，
15.通过将0.1μl(0.5pM)的每种1μM探针储备液添加至100μl经预热的(45℃)杂交缓冲液来制备探针溶液，
16.除去“预杂交”缓冲液，
17.添加100μl上面制备的杂交缓冲液+探针，
18.在45℃下孵育过夜，
19.用经预热的(45℃)洗涤缓冲液洗涤4次，
20.添加1mL 5×SSCT。
实施例11
Ffpe载玻片上的RNA原位杂交
1.添加500μl二甲苯，3分钟，
2.添加500μl二甲苯，3分钟，
3.添加500μl 1:1的二甲苯乙醇，3分钟，
4.用500μl乙醇洗涤3分钟，
5.用500μl乙醇洗涤3分钟，
6.用500μl 95％乙醇洗涤3分钟，
7.用500μl 70％乙醇洗涤3分钟，
8.用500μl 50％乙醇洗涤3分钟，
9.用500μl PBST洗涤3分钟，
10.用500μl PBST洗涤3分钟，
11.在37℃下，将载玻片浸入2μg/mL蛋白酶K溶液中40分钟，
12.在PBST中于室温下将载玻片洗涤2×3分钟，
13.通过在Kimwipe上吸干边缘来干燥载玻片，
14.在组织样品的顶部添加400μL探针杂交缓冲液，
15.在45℃的加湿腔室内预杂交10分钟，
16.制备探针溶液(使用1μl的1μM探针混合物)，
17.除去预杂交溶液，并通过在Kimwipe上吸干边缘来排掉载玻片上的多余缓冲液，
18.在组织样品的顶部添加100μL探针溶液，
19.将盖玻片放在组织样品上，并在45℃的加湿腔室中孵育4小时，
20.用在45℃下经预热的洗涤缓冲液洗涤4×15分钟，
21.用5×SSCT洗涤2×。
实施例12
免疫荧光缀合策略
能够以多种方式(包括例如氨基、马来酰亚胺和双砜交联剂)将抗体/亲和配体与ssDNA MUSE触发剂缀合。
缀合方案(以双砜-PEG4-DBCO为例)
1.制备PBS+10mM EDTA，
2.在100KDA柱中将200μg泛Ras抗体进行缓冲液更换至PBS-EDTA 2×中，
3.重悬于70μl PBS+EDTA中，
4.保留10μl用于对照，
5.使用超过10×的TCEP，
6.向抗体添加适量的1mM TCEP，
7.在RT下还原抗体1小时，
8.以PBS+10mM EDTA在amicon 50中将抗体进行2次缓冲液更换，
9.重悬于60μl PBS+10mM EDTA中，
10.添加超过5倍摩尔量双砜-PEG4-DBCO试剂，
11.通过移液混合均匀，
12.在RT下孵育过夜，
13.在30KDa柱中将缓冲液更换为PBS 3×，
14.重悬于50μl PBS中，
15.保留25μl用于对照，
16.使用处于PBS中的超过2倍量的低聚azyde，
17.在4℃下孵育过夜，
18.在30KDa柱中以PBS 3×进行缓冲液交换，
19.在100μl PBS中回收。
实施例13
免疫染色方案
使用者能够以任何优选的方式进行免疫染色，只要最终的洗涤在PBS中即可。
1.在RT下用适当稀释的一抗孵育样品2小时(或在4℃下过夜)，
2.在PBS+0.1％吐温-20中洗涤3×10分钟，
3.在3％热灭活山羊血清中封闭30分钟，
4.在RT下用适当浓度的二抗(通常为1/500)孵育1小时，
5.在PBS中清洗3×10分钟。
实施例14
放大方案
出于所描述的原因，利用了涉及核酸单体的自组装体的常见的放大方法。
1.在95℃下，将MUSE发夹(2μl/100μl反应溶液)变性3分钟，
2.在冰上放置10分钟，
3.在RT下放置20分钟，
4.将发夹与放大混合物混合，
5.置于预先杂交的免疫染色样品上，
6.在RT下放大过夜，
7.在5×SSCT中洗涤4×15分钟。
实施例15
标记方案-荧光
荧光标记缀合策略
能够以多种方式将荧光团与寡核苷酸缀合，所述方式包括(但不是穷举)氨基、马来酰亚胺或点击介导的缀合。提供了示例性的缀合方案：
标记可能性
可以使用与荧光团缀合的ssDNA寡核苷酸作为标记。但是，也可以使用包含多至4个荧光团(在各5'、3'端)的dsDNA标记来进一步使信号增强。
荧光团标记方案
从ISH或IF开始：
1.每100μl杂交溶液添加2μl荧光团标记，
2.在杂交缓冲液中于RT下杂交2小时，
3.在5×SSCT中洗涤2×15分钟，
4.在PBS中洗涤2×15分钟，
5.装片并成像。
实施例16
标记方案-量子点
量子点缀合策略
能够以多种方式将量子点与寡核苷酸缀合。提供了示例性的缀合方案：
量子点标记方案
1.从ISH或IF开始，
2.每100μl杂交溶液添加2μl量子点标记，
3.在RT下杂交2小时，
4.在5×SSCT中洗涤2×15分钟，
5.在PBS中洗涤2×15分钟，
6.装片并成像。
实施例17
标记方案-元素
元素标记缀合策略
元素标记是通过马来酰亚胺化学将金属螯合聚合物(Fluidigm Corp.)与含有硫醇或二硫醇部分的寡核苷酸缀合而产生。缀合的方案可见于如下。
元素标记生成方案
1.将寡核苷酸重悬于TE缓冲液中至200μM，
2.混合：将50μL(200μM)寡核苷酸与20μl TE缓冲液混合，
3.添加30μl的0.5M TCEP，
4.在RT下放置至少两个小时，
5.用纯同位素预加载MCP，
6.在第II步之后等待30分钟，
7.快速离心聚合物管10秒钟，
8.用95μL的L-缓冲液重悬聚合物，
9.通过移液混合均匀，
10.添加5μL同位素溶液(总计2mM)，
11.通过移液混合均匀，
12.在37℃下孵育30-40分钟，
13.35分钟后，
14.向3K UF柱添加200μL L-缓冲液，
15.将容纳有L缓冲液的3K UF柱添加装载有同位素的MCP溶液，
16.在RT下全速旋转25分钟，
17.向3K UF柱添加300μL C-缓冲液，
18.在RT下全速旋转30分钟，
19.回收还原的二硫醇-寡核苷酸，
20.与第15步同时使用1台离心机，
21.向3K UF柱添加300μL C-缓冲液，
22.向3K UF柱添加处于TCEP中的经还原的二硫醇寡核苷酸，
23.在RT下全速旋转15分钟，
24.向3K UF柱添加300μL C-缓冲液，
25.在RT下全速旋转20分钟，
-收回经装载的MCP和经还原的二硫醇-寡核苷酸-，
26.收回容纳有经纯化的装载有同位素的MCP的3K UF柱，
27.收回容纳有经纯化的还原的二硫醇-寡核苷酸的3K UF柱，
-用经还原的二硫醇-寡核苷酸缀合经装载的MCP，
28.在3K UF柱中将经装载的MCP重悬于60μL C缓冲液中，
29.通过移液混合均匀，
30.将处于C-缓冲液中的经装载的MCP转移到容纳有经还原的二硫醇-寡核苷酸的3K UF柱中，
31.在37℃下孵育2小时，
32.添加5mM TCEP(1μl的0.5M TCEP)，
33.再孵育30分钟，
34.将处于C-缓冲液中的经装载的MCP和经还原的二硫醇寡核苷酸转移到容纳有经还原的二硫醇寡核苷酸的10K UF柱中，
-洗涤同位素缀合的寡核苷酸，
35.向容纳有MCP的10K UF柱添加300μL W-缓冲液，
36.在RT下全速旋转10分钟，
37.用500μl超纯水洗涤4次，
-回收MCP-，
38.向容纳有MCP的10K UF柱添加30μL 5×SSCT，
39.冲洗UF柱的壁，
40.将UF柱倒置入新的收集管中，
41.在1000G下旋转2分钟，
42.重复一次，
43.用Qubit ssDNA试剂盒测量，
44.制备1μM储备液。
元素标记方案
1.从ISH或IHC开始，
2.每100μl杂交溶液添加2μl元素标记，
3.在RT下杂交2小时，
4.在5×SSCT中洗涤2×15分钟，
5.在PBS中洗涤2×15分钟，
6.在ddH2O中快速冲洗，
7.风干，
8.用Fluidigm Hyperion单元或适用于MIBI的nanoSIMS装置成像。
实施例18
二次放大
可以进行二次放大以进一步放大核酸原位杂交和免疫组织化学测定的信号。
二次放大方案
1.在95℃下，将MUSE发夹(2μl/100μl反应溶液)变性3分钟，
2.在冰上放置10分钟，
3.在RT下放置20分钟，
4.将发夹与放大混合物混合，
5.置于预先杂交的免疫染色样品上，
6.在RT下放大过夜，
7.在5×SSCT中洗涤4×15分钟，
8.将2μl二次适配体与100μl杂交溶液混合，
9.在RT下杂交2小时，
10.在5×SSCT中洗涤4×15分钟，
11.在洗涤过程中，重复二级放大体系的发夹形成(步骤1-4)，
12.在RT下放大过夜，
13.在5×SSCT中洗涤4×15分钟，
14.将2μl标记与100μl杂交溶液混合，
15.在RT下杂交2小时，
16.在5×SSCT中洗涤2×15分钟，
17.用PBS洗涤2×15分钟，
18.装片并成像。
实施例19
条形码
光谱条形码
例如，光谱条形码在每个放大体系使用两种不同的标记(例如：Muse1A alexa488+Muse1B alexa594)来生成与5种荧光团的52种组合。对于光谱条形码，需要如同荧光标记一样进行(如前所述)。
序列条形码
序列条形码方法使得能够生成Sn条形码，其中，S是不同的信号种类的数量(例如发出不同波长的荧光团)，并且n是序列标记运行的数量。
树枝状聚合物可用于产生条形码序列。发明人已经设计出两种方法，它们通过使得能够在对所研究的样品在温和的缓冲液中进行荧光标记的快速和环境温度交换来对已公开的方法进行改进。
在标记-淬灭-标记技术中，与树枝状聚合物上的分枝序列互补的、用于标记的包含另外的15个核苷酸的“突出端”序列的第一寡核苷酸构成了第一条形码标记。“突出端”用于锚定包含两个突出端的dsDNA“淬灭基团”标记，一个突出端与第一个标记的突出端互补，且第二个突出端用于锚定下一个标记。“淬灭基团”标记寡核苷酸包含短距离淬灭基团，例如dabcyl和荧光团。淬灭基团标记与在先的标记的突出端的杂交使淬灭基团和在先的荧光团相距很近，从而使第一个荧光团的荧光被淬灭，并且只有在“淬灭基团”标记上包含的荧光团可以发射信号。以这种方式，随后的“淬灭基团”标记可以彼此杂交n次以产生条形码。
标记-擦除-标记方法需要两种寡核苷酸。该标记与分枝互补，并包含12个碱基对的突出端。擦除物与标记完全互补，包含12个碱基对的突出端。为了开始标记替换，将擦除物寡核苷酸添加至在先的标记的样品中。擦除物与标记的突出端的杂交将触发分支迁移事件，使得当标记从分枝脱离时，将产生擦除物-标记dsDNA寡核苷酸二聚体。然后可以将擦除物-标记二聚体洗掉。最后，将新标记添加至样品。这些标记-擦除-标记循环可以重复n次以生成条形码。与标记-淬灭-标记方法相比，该方法更简单且更便宜。
标记-淬灭-标记方案
假设样品在5×SSCT中
1.每100μl添加2μl的1μM标记1，
2.在RT下杂交2小时，
3.在5×SSCT中洗涤3×10分钟，
4.成像，
5.每100μl添加2μl的1μM标记2，
6.在RT下杂交2小时，
7.在5×SSCT中洗涤3×10分钟，
8.成像。
标记-擦除-标记方案
假设样品在5×SSCT中
1.每100μl添加2μl的1μM标记1，
2.在RT下杂交2小时，
3.在5×SSCT中洗涤3×10分钟，
4.成像，
5.每100μl添加2μl的1μM标记2和擦除物，
6.在RT下杂交2小时，
7.在5×SSCT中洗涤3×10分钟，
8.成像。
上述各种方法和技术提供了多种实施本发明的方式。当然，将理解的是，并不需要根据本文所述的任何特定实施方式可实现所描述的所有目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，能够以实现或优化本文所教导的一个优点或成组优点、而无需实现本文所教导或表明的其它目的或优点的方式执行该方法。本文提到了多种有利和不利的替代方案。将理解的是，一些优选的实施方式具体地包括一个、另一个或多个有利特征，而其它优选的实施方式具体地排除一个、另一个或多个不利特征，而又一些优选的实施方式通过包含一个、另一个或多个有利的特征而减轻所存在的不利特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的各种特征的适用性。类似地，本领域的普通技术人员可以将上面讨论的各种要素、特征和步骤，以及每个这样的要素、特征或步骤的其它已知等效物进行混合和匹配，以执行根据本文所述的原理的方法。在各种实施方式中，各种要素、特征和步骤中的一些将被具体地包括，而其它将被具体地排除。
尽管已经在某些实施方式和实施例的上下文中公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明的实施方式超越了具体公开的实施方案，延伸到其它替代实施方式和/或用途和修改及其等同物。
在本发明的实施方式中已经公开了许多变体和替代要素。然而其它变体和替代要素对于本领域技术人员而言是显而易见的。不受限制地，这些变体包括输卵管上皮、细胞、类器官及其组织产物，产生输卵管上皮的方法，包括与诸如卵巢癌的癌症相关的核酸、肽和蛋白质序列的预后和/或诊断测试组，以及与通过本发明的教导产生的产品的特定用途相关的技术。本发明的各种实施方式可以具体地包括或排除这些变体或要素中的任一者。
在一些实施方式中，表示用于描述和要求保护本发明某些实施方式的成分量、性质(例如浓度)、反应条件等的数字将被理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，在所书写的描述和所附的权利要求中阐述的数字参数是近似值，其可以根据特定实施方式试图获得的期望特性而变化。在一些实施方式中，应该根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来解释数字参数。尽管阐明本发明的一些实施方式的宽的范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中列出的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方式中出现的数值可能包含某些误差，这些误差是由见于它们各自的测试测量中的标准偏差而必然导致的。
在一些实施方式中，在描述本发明特定实施方式的上下文中(尤其是在如下的一些权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“所述/该”和类似的提法可被解释为涵盖单数和复数。本文列举的值的范围仅意在用作单独提及的落在该范围内的各单独值的速记方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值均被并入本说明书，就像在本文中单独列举一样。除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序实施。关于本文的一些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，并不对本发明另外保护的范围造成限制。本说明书中的语言不应解释为是表示实践本发明所必需的任何未请求保护的要素。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可单独或者与本文出现的该组的其它成员或其它要素任意组合而被提及和请求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可被包含在组中或从组中删除。当任何此类包含或删除发生时，认为本文的说明书包含经修饰的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文对这一发明的优选实施方式进行了描述，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在本领域的普通技术人员阅读上述说明时，这些优选实施方式的变型将变得显而易见。在考虑之列的是，技术人员可在适当时采用此类变型，并且本发明可按本文具体描述之外的方式加以实践。因此，如可适用的法律所允许的，这一发明的许多实施方式包括所附权利要求书中列出的主题的所有修改物和等同物。此外，除非在本文中另外指明，或除非与上下文明显冲突，本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。
此外，在贯穿这一说明书中对专利和印刷出版物进行了许多参考。以引用的方式将上述引用的参考文献和印刷出版物中的各自以其整体并入本文。
最后，将理解的是，本文所公开的发明的实施方式是对本发明的原理的说明。可采用的其它修改形式可在本发明的范围内。因此，举例来说，而非加以限制，本发明的实施方式的替代构造可根据本文的教导而使用。因此，本发明的实施方式不限于如精确地示出和描述的内容。
序列表
<110> 南加利福尼亚大学(UNIVERSITY OF SOUTHERN CALIFORNIA)
<120> 生成用于具有多模式标记和信号放大的分析物检测的生物相容的树枝状聚合物的方法
<130> 065715-000090WO00
<150> 62/486,364
<151> 2017-04-17
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 1
gtcccactct cacctcaccc gcaccatttc atttcc 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 2
ccttatctat tcgtcccact ctcacctcac ccgcac 36
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 3
ggaaatgaaa tggtgcgggt gaggtgagag tgggaccctt atctattcgt cccactctca 60
cctcacccgc ac 72
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 4
actaacccta aacac 15
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 5
ctccactcat acacc 15
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<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 6
gtcccactct cacctcaccc gcaccatttc atttccgtgc gggtgaggtg agagtgggac 60
gaatagataa gg 72
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
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caccgtccca tccatcccag cctccaatac aatacc 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 8
cctaatcaaa tccaccgtcc catccatccc agcctc 36
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 9
ggtattgtat tggaggctgg gatggatggg acggtgccta atcaaatcca ccgtcccatc 60
catcccagcc tc 72
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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<220>
<223> 单体2A
<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 12
caccgtccca tccatcccag cctccaatac aataccgagg ctgggatgga tgggacggtg 60
gatttgatta gg 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
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ctgcctcacc tactaccctc gctccaaatc aaatcc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 14
cctaaactaa tcctgcctca cctactaccc tcgctc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 15
ggatttgatt tggagcgagg gtagtaggtg aggcagccta aactaatcct gcctcaccta 60
ctaccctcgc tc 72
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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acccttacct ctacc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctccatccat ctcac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 18
ctgcctcacc tactaccctc gctccaaatc aaatccgagc gagggtagta ggtgaggcag 60
gattagttta gg 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
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ctcgccctta cacctcaccc gctcctaaac taaacc 36
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 20
cctttacttt acctcgccct tacacctcac ccgctc 36
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 21
ggtttagttt aggagcgggt gaggtgtaag ggcgagcctt tactttacct cgcccttaca 60
cctcacccgc tc 72
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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attcccatac tcttc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cttccaatca tcccg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 24
ctcgccctta cacctcaccc gctcctaaac taaaccgagc gggtgaggtg taagggcgag 60
gtaaagtaaa gg 72
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 25
ctgcctcacc tccaactccc gctcctattc atttcc 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 26
cctttactat tcctgcctca cctccaactc ccgctc 36
<210> 27
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 27
ggaaatgaat aggagcggga gttggaggtg aggcagcctt tactattcct gcctcacctc 60
caactcccgc tc 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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<220>
<223> 单体2A
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 30
ctgcctcacc tccaactccc gctcctattc atttccgagc gggagttgga ggtgaggcag 60
gaatagtaaa gg 72
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 31
caccgaccat ccatacaccg ccacctttac atttcc 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 32
cctttactat tccaccgacc atccatacac cgccac 36
<210> 33
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 33
ggaaatgtaa aggtggcggt gtatggatgg tcggtgcctt tactattcca ccgaccatcc 60
atacaccgcc ac 72
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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tcactaacta aactc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
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ttcaatcatc accag 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 36
caccgaccat ccatacaccg ccacctttac atttccgtgg cggtgtatgg atggtcggtg 60
gaatagtaaa gg 72
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
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cagcctcacc ataacatcac cgacctaaac taaacc 36
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 38
cctttacatt tccagcctca ccataacatc accgac 36
<210> 39
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 39
ggtttagttt aggtcggtga tgttatggtg aggctgcctt tacatttcca gcctcaccat 60
aacatcaccg ac 72
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<212> DNA
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<220>
<223> 单体1B
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<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 42
cagcctcacc ataacatcac cgacctaaac taaaccgtcg gtgatgttat ggtgaggctg 60
gaaatgtaaa gg 72
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 43
ctccgacctc tactaccctg cctccataac aattcc 36
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 44
ccaaatctaa acctccgacc tctactaccc tgcctc 36
<210> 45
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 45
ggaattgtta tggaggcagg gtagtagagg tcggagccaa atctaaacct ccgacctcta 60
ctaccctgcc tc 72
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 46
accctactct cactc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 47
tcacttatac tcctg 15
<210> 48
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 48
ctccgacctc tactaccctg cctccataac aattccgagg cagggtagta gaggtcggag 60
gtttagattt gg 72
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 49
cagccacttt caccatacac cgacctttac tttacc 36
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 50
ccaaatcaat accagccact ttcaccatac accgac 36
<210> 51
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 51
ggtaaagtaa aggtcggtgt atggtgaaag tggctgccaa atcaatacca gccactttca 60
ccatacaccg ac 72
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 52
aatcccaatc caaac 15
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 单体2A
<400> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 54
cagccacttt caccatacac cgacctttac tttaccgtcg gtgtatggtg aaagtggctg 60
gtattgattt gg 72
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<212> DNA
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<220>
<223> 触发剂1
<400> 55
ctcgcccact cacctcaccc gcaccttatc atttcc 36
<210> 56
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<212> DNA
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<220>
<223> 触发剂2
<400> 56
ccaaatcaaa tcctcgccca ctcacctcac ccgcac 36
<210> 57
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 57
ggaaatgata aggtgcgggt gaggtgagtg ggcgagccaa atcaaatcct cgcccactca 60
cctcacccgc ac 72
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 58
taccctaacc tctac 15
<210> 59
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 59
cctttactac tcccg 15
<210> 60
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 60
ctcgcccact cacctcaccc gcaccttatc atttccgtgc gggtgaggtg agtgggcgag 60
gatttgattt gg 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 61
cacgctccac tccacctaac taacc 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 62
ccatacatac cacgctccac tccac 25
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 63
ggttagttag gtggagtgga gcgtgccata cataccacgc tccactccac 50
<210> 64
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 64
atcatctcat cc 12
<210> 65
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 65
cctaaatctc ta 12
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 66
cacgctccac tccacctaac taaccgtgga gtggagcgtg gtatgtat 48
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 触发剂1
<400> 67
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<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 68
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<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 69
aacgccaacc caaatacc 18
<210> 70
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 71
ggattaaggc taggcgatcc tttatcatcg cctagc 36
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 72
cctatttcaa cgccaacc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 73
aacccgaacc taaagc 16
<210> 74
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 74
gctttaaacc cgaacc 16
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
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<220>
<223> 单体1A
<400> 75
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<210> 76
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 76
gctttaaacc cgaaccatac ccacaccaac cc 32
<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 77
cccaaccacc accaataacc cgaacctaaa gc 32
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 78
ggttcgggtt taaagc 16
<210> 79
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂1
<400> 79
cgccacccta aacc 14
<210> 80
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 触发剂2
<400> 80
ccatttcgcc accc 14
<210> 81
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1A
<400> 81
ggtttagggt 10
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体1B
<400> 82
ggcgccattt cgccacccat ctcttccc 28
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2A
<400> 83
ccctctacta cgccacccta aaccgggt 28
<210> 84
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体2B
<400> 84
ggcgaaatgg 10
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