循环肿瘤细胞阴性富集检测方法
阅读说明：本技术 循环肿瘤细胞阴性富集检测方法 (Negative enrichment detection method for circulating tumor cells ) 是由 温冬 金炜翔 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法,所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合,以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞,以实现循环肿瘤细胞阴性富集。基于本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法可以有效提高单核细胞层中CTCs的纯度,从而降低后续鉴定工作的复杂程度,提高鉴定的效率和准确率。(The invention provides a circulating tumor cell negative enrichment detection method, which comprises the following steps: adding a combination of red blood cell-specific antibodies and white blood cell-specific antibodies to a first centrifuge tube containing a whole blood sample to couple red blood cells and white blood cells in the whole blood sample together; and removing the red blood cells and the white blood cells which are coupled together in the whole blood sample by using a density gradient centrifugation method so as to realize negative enrichment of the circulating tumor cells. The circulating tumor cell negative enrichment detection method based on the invention can effectively improve the purity of CTCs in the monocyte layer, thereby reducing the complexity of subsequent identification work and improving the efficiency and accuracy of identification.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating Tumor Cells，CTCs)阴性富集检测方法是指通过剔除血液中除CTCs以外其他血细胞来达到富集血液中CTCs的目的，剔除方法主要采用的是密度梯度离心方式，即将血液与一种介质(密度梯度离心液)混合后，通过离心力使血液中细胞根据自己的密度达到分离分层的目的，经过梯密度离心的血液样本会分成4层，由上至下依次为：血浆、单核细胞、分离液 (密度梯度离心液)以及红细胞和白细胞；CTCs作为单核细胞会处于单核细胞层，所以只需再将单核细胞层提取出来，即达到了血液中CTCs的富集目的。
但是现有的CTCs阴性富集检测方法存在以下不足：
1)现有方法中CTCs阴性富集会将单核细胞层的样本全部提取出来，这一层里含有大量的白细胞，所以CTCs的富集纯度不够高，会对后续的鉴定工作增加复杂程度，影响鉴定效率和准确率；
2)CTCs阴性富集分层效果和血液样本有关，尤其是红细胞，在密度梯度离心后，有些血液样本会出现红细胞上窜，与单核细胞层无法严格区分开来，导致最终CTCs富集纯度降低，并严重干扰后续的鉴定工作；
3)在血液样本出现红细胞上窜时，通常采取裂红的方式将单核细胞层里的混入的红细胞去除掉，这样操作对其他单核细胞的完整性会产生副作用，并且因为裂红而增加了清洗步骤，使得最终细胞的回收率受影响；
4)由于CTCs阴性富集检测方法包含从血液中富集CTCs，以及后续的染色鉴定过程，流程较长，需要多个环节的清洗和更换试管，在这一完整流程中，会导致细胞的丢失，影响最终检测的灵敏度。
针对现有技术中CTCs阴性富集检测方法存在的不足，本领域技术人员一直在寻找解决的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，以解决使用现有技术中CTCs阴性富集检测方法存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明提供一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括如下步骤：
S1：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；
S2：利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，执行S2具体包括如下步骤：
将所述第一离心管放在摇床上孵育；
向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；
将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；
将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在执行S2之后，还包括如下步骤：
S3：利用细胞荧光抗体悬浮染色来标记CTCs，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色和形态来鉴定CTCs。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在S3中，所述细胞荧光抗体包括：抗人EpCAM的细胞表面上皮细胞黏附分子抗体、抗人CK的细胞角蛋白抗体、细胞核染料DAPI和抗人CD45的白细胞特异性抗体。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在S3中，通过荧光扫描仪进行荧光信号的采集，并根据细胞染色和形态鉴定CTCs。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，将符合DAPI+且 CK/EpCAM+且CD45-染色特征和细胞形态学特征的细胞定义为CTCs。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，执行S3具体包括如下步骤：
向所述第三离心管中加入细胞稀释液，并依次进行混匀，离心；
将进行离心后的第三离心管中样本去上清后，加入细胞固定液进行固定、透化，然后加入细胞洗液，进行离心；
弃上清，向所述第三离心管中加入细胞核染料、细胞角蛋白、EpCAM、 CD45避光孵育染色；
向所述第三离心管中再次补充细胞洗液，进行离心；
弃上清，将所述第三离心管中样本转移到96孔读数板中，进行扫描和图像分析。
可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，所述细胞核染料为 DAPI。
在本发明所提供的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。基于本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法可以有效提高单核细胞层中CTCs的纯度，从而降低后续鉴定工作的复杂程度，提高鉴定的效率和准确率。
附图说明
图1是本发明一实施例中循环肿瘤细胞阴性富集检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例中所有样本结果数据的线性回归分析结果示意图；
图3是本发明一实施例中检出下限实验拟合曲线；
图4是本发明一实施例中高、低浓度样本检测掺入细胞回收率散点图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
为使本发明的目的、特征更明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明，然而，本发明可以用不同的形式实现，不应认为只是局限在所述的实施例。
请参考图1，其为本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法的结构示意图。如图1所示，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：
首先，执行步骤S1，向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；
接着，执行步骤S2，利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集；
其中，执行S2具体包括如下步骤：
将所述第一离心管放在摇床上孵育；
向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；
将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；
将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管，即将位于所述插件上方的单核细胞层倒入第三离心管。
其中，所述插件是一个透明，中间有微孔的塑料挡板，密度梯度离心后红细胞会在该插件下面，单核细胞层会在插件上方，可以直接将密度梯度离心管倒置，将插件上方的液体全部倒出，而插件下方的红细胞层样本会被挡住；相比于用枪头去吸取单核细胞层样本，这样带插件的离心管即方便用户提取单核细胞样本，又能最大化保证单核细胞的收集效率。
有益效果：基于S1已使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起后，采用密度梯度离心法能够让大部分白细胞随着细胞一起被隔离到第二离心管中插板下方的最底层，从而避免出现现有检测方法在密度梯度离心后，有些血液样本会出现红细胞上窜，使得红细胞混于单核细胞层中，两者无法严格区分开来的问题，有效提高单核细胞层样本纯净度。
接着，执行步骤S3，利用细胞荧光抗体悬浮染色来标记CTCs，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色和形态来鉴定CTCs。优选的，所述细胞荧光抗体包括：抗人EpCAM的细胞表面上皮细胞黏附分子抗体、抗人CK的细胞角蛋白抗体、细胞核染料DAPI和抗人CD45的白细胞特异性抗体。
对于S3中涉及的专业名词解释说明如下：
1)CTCs：Circulating Tumor Cells，循环肿瘤细胞，指从实体瘤脱落进入外周循环系统中的肿瘤细胞。
2)CD45：Cluster of differentiation 45，白细胞共同抗原，所有的白细胞都表达，是一类分子量较大的跨膜蛋白。
3)EpCAM：Epithelial cell adhesion molecule，上皮细胞粘附分子，上皮来源的癌症细胞表面标志物。
4)CK：Cytokeratin，细胞角蛋白，CK家族成员众多，分布广泛，是常用的上皮来源的肿瘤细胞的标志物。
5)DAPI：4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚，能与DNA强烈结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。
具体的，在S3中，是通过荧光扫描仪进行荧光信号的采集，并根据细胞染色和形态鉴定CTCs。本实施例中，鉴定CTCs的标准为：将符合DAPI+且 CK/EpCAM+且CD45-染色特征和细胞形态学特征的细胞定义为CTCs。这里“+”符号代表有荧光信号，即CK/EpCAM+表示CK或者EpCAM有荧光信号；“-”符号代表没有荧光信号。
进一步地，执行S3具体包括如下步骤：
向所述第三离心管中加入细胞稀释液，并依次进行混匀，离心；
将进行离心后的第三离心管中样本去上清后，加入细胞固定液进行固定、透化，然后加入细胞洗液，进行离心；
弃上清，向所述第三离心管中加入细胞核染料、细胞角蛋白、EpCAM、 CD45避光孵育染色；
向所述第三离心管中再次补充细胞洗液，进行离心；
弃上清，将所述第三离心管中样本转移到96孔读数板中，进行扫描和图像分析。
综上，本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法采用先在全血样本中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合来吸附红细胞和白细胞，并结合密度梯度离心法去除血液样本中的大部分红细胞和白细胞，可以有效解决背景技术中标号1)、2)和3)的问题。
另一方面，为了解决背景技术中提及的标号为4)的问题，本发明采用的解决方案是：在所有接触全血样本的耗材(试管、枪头等)在使用前进行了防细胞吸附处理，有效降低细胞在操作过程中的丢失率，进一步提高了基于阴性富集的CTCs检测方法的灵敏度。
此外，为了较好理解本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，列举如下实例，实例内容详情如下：
1.1使用表达EpCAM/CK的肿瘤细胞，如人乳腺癌SKBR3细胞，掺入 EDTA-2K抗凝管收集的健康人血液作为分析性能评估的样本。掺入的SKBR3 细胞数可以通过显微镜准确计数。
1.2适用于采用EDTA-2K抗凝管采集的临床全血样本
1.3准确度验证和测量范围的确定
采用回收实验评价检测方法的准确度，即将已知数量的SKBR3细胞加入到阴性基质血液，评估检测方法准确测定加入细胞数量的能力，结果用回收率表示。
通过检测不同数量的掺入细胞(0-250)，分别计算回收率，并通过线性回归分析，确定本方法的最佳测量范围。回收率＝回收到的阳性细胞数/掺入细胞数ⅹ 100％。
1.3.1验证方案
每天在5份健康捐赠者血液样本中分别加入大约为250、100、50、10及0 个SKBR3细胞，连续重复3天。将观察到的肿瘤细胞数除以加入肿瘤细胞数，得到回收率。取回收率平均值作为平均回收率。通过线性回归分析，得出 CTCs阴性富集检测方法的测量范围。
1.3.2结果判定
平均回收率大于60％，则符合验证方案要求。线性范围内能够达到预期回收率的，为该方法的测量范围。
1.3.3试验结果
各掺入细胞组所有样本的平均回收率数据请参见表1；所有样本结果数据的线性回归分析结果示意图请参见图2。
表1各掺入细胞组所有样本的平均回收率数据
组别
Mean
CV
N
250
71.1％
5.5％
3
100
72.9％
8.5％
3
50
82.3％
11.4％
3
10
83.8％
14.4％
3
0
0％
0％
3
一共完成3次验证试验，试验结果如表1所示，试验结果中最低的样本回收率为66％，所有样本的平均回收率大于70％。
将所有样本结果数据进行线性分析(线性分析结果如图2所示)，回归方程：Y＝0.706*X+2.0662；R2＝0.99。在0-250个细胞范围内，所有样本的回收率数据都超过60％，且线性关系良好，则0-250个细胞是该方法的测量范围。
1.4最低检出限验证
将不同数量的SKBR3细胞加入到阴性基质血液样本进行检测，计算每个细胞水平的检出率，将具有100％阳性(检测到CTC的数量≥1)检出率的最低细胞水平作为最低检出限。
1.4.1验证方案
在基质血液样本中分别加入大约3、2、1个SKBR3细胞，重复10次。以阳性检出率为100％的最低细胞水平作为最低检出限。
1.4.2结果判定
分别计算每个掺入细胞水平的检出率，将阳性检出率达到100％的最低细胞水平确定为最低检测限。
1.4.3试验结果
检出下限试验在8个时间段完成，每次掺入3、2、1个SKBR3细胞，3次试验共计完成10重复，试验结果如图3所示。掺入细胞为1时，所有样本的检出率为100％。
1.5特异性验证
分析特异性用“阴性检出率”表示，即多次检测无肿瘤史的健康捐赠者血样，计算检测的阴性(无CTC检出)结果数占检测总数的比例。
1.5.1验证方案
每天检测约10个健康人全血样本，分2次试验共计20个样本。本方法在富集CTCs后，进行特异性抗体组合染色，CK、EpCAM用来识别CTCs， DAPI用来确定细胞染色，CD45用来区分白细胞。因此通过多种抗体组合和细胞核染色的综合判断来排除非特异性染色。
1.5.2结果判定
10次测定结果的阴性检出率不低于90％。
1.5.3试验结果
根据实际样本情况，特异性检测一共完成2次试验共计20个样本，检测结果均为阴性，即样本的特异性为100％。
1.6重复性验证
采用回收实验评价检测方法的可重复性，即将已知数量的SKBR3细胞加入到阴性基质血液，并进行重复检测，检测细胞回收率，通过比较重复检测下回收率的CV来评估检测方法的可重复性。
1.6.1验证方案
在10份健康捐赠者血液样本中掺入约50个SKBR3细胞，并在另外10份健康捐赠者血液样本中掺入约100个SKBR3细胞，然后进行CTCs检测。分别计算高浓度(掺入100个SKBR3)和低浓度(掺入50个SKBR3)10次检测结果的平均值和方差SD，根据公式：
1.6.2结果判定
高、低浓度样本分别重复检测10次，要求检测结果的变异系数CV≤ 20％。
1.6.3试验结果
一共完成20次验证试验，试验结果如图4所示。所有样本的平均回收率大于60％。低浓度样本重复10次检测，回收率平均值为70％，变异系数CV为 13％，符合可重复性要求；高浓度样本重复10次检测，回收率平均值为71％，变异系数CV为15％，符合可重复性要求。
综上，在本发明所提供的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。由上可知，基于本发明的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法可以有效提高单核细胞层中CTCs的纯度，从而降低后续鉴定工作的复杂程度，提高鉴定的效率和准确率。
上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。