阅读说明：本技术 一种检测dna甲基化酶活性的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 (Photoelectrochemical immunosensor for detecting activity of DNA methylase and preparation method and application thereof ) 是由 沈艳飞 陈开洋 薛怀佳 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用,该光电化学免疫传感器由Sb<Sub>2</Sub>Se<Sub>3</Sub>-GO-CS修饰基底电极,hDNA共价结合到修饰后的基底电极上,Dam MTase甲基化和DPn I剪切后在电极上得到ssDNA,S1-AuNPs与ssDNA特异性结合得到。本发明传感器可以增加了溶液的分散性,进一步共价偶联生物分子,通过酰胺键共价结合大量hDNA,再将hDNA用Dam MTase甲基化通过DPn I的剪切作用释放出ssDNA。本发明传感器具有良好的稳定性与灵敏性,操作简便,反应迅速,能够实现对DNA甲基化酶活性的定量检测,将为疾病的早期诊断与治疗提供新的平台。(The invention discloses a photoelectrochemical immunosensor for detecting DNA methylase activity and a preparation method and application thereof, wherein the photoelectrochemical immunosensor is prepared from Sb 2 Se 3 The GO-CS modified substrate electrode is characterized in that hDNA is covalently bonded to the modified substrate electrode, ssDNA is obtained on the electrode after Dam MTase methylation and DPn I shearing, and S1-AuNPs are specifically bonded with the ssDNA. The sensor can increase the dispersibility of the solution, further covalently couples biomolecules, covalently combines a large amount of hDNA through amido bonds, and then methylates the hDNA by Dam MTase to release ssDNA through the shearing action of DPn I. The sensor of the invention has good stability and sensitivityThe method is simple and convenient to operate and rapid in reaction, can realize quantitative detection of the activity of the DNA methylase, and provides a new platform for early diagnosis and treatment of diseases.)

一种检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器及其制备 方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的形成主要受遗传学修饰与表观遗传修饰的影响。DNA甲基化属于表观遗传修饰，在DNA甲基化转移酶(Dam MTase)催化下，对个体的生长与发育等生命过程起到调控作用。近年来有研究表明，DNA甲基化异常，也就是MTase活性的失调与肿瘤癌症等多种疾病相关。对Dam MTase活性的深入研究可以为临床诊断和肿瘤治疗提供有价值的指导。用于MTase测定的传统方法包括DNA底物的放射性标记，高效液相色谱和凝胶电泳等。然而，这些检测方法需要设定较长的测定程序，使用昂贵的仪器和不安全的同位素标记等，从而限制了它们的实际应用。因此，开发一种能够高灵敏、简洁快速检测Dam MTase活性的方法仍然是一个挑战。

Sb₂Se₃是一种带隙较窄(1.0-1.3eV)的p型半导体材料，有优异的光电性能与热电性能。最近Sb₂Se₃已成为用于太阳能转换装置的有前途的无毒且低成本的光吸收剂。现有技术中将其成功应用于薄膜太阳能电池后，还开发了Sb₂Se₃光电阴极用于PEC水分解。此外，也有报道证明了由修饰有TiO₂和Pt的Sb₂Se₃纳米针状物组成的光电阴极可用于PEC产氢。由于Sb₂Se₃光电阴极的发展历史相对较短，并且关于Sb₂Se₃作为光电阴极PEC传感器用于检测生物分子的报道很少。考虑到其巨大的潜力，迫切需要进一步深入调查。最近，半导体纳米晶体与金属纳米粒子之间的荧光共振能量转移已被证明是一种先进可行的生物测定方案。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于高光电活性物质Sb₂Se₃的光电化学免疫传感器用于DNA甲基化酶活性的检测，该光电化学免疫传感器操作步骤简便，反应快速，灵敏度高，能够实现对DNA甲基化酶活性的定量检测。

本发明的另一个目的是提供所述光电化学免疫传感器的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述光电化学免疫传感器的应用。

本发明中技术术语的缩写如下：

硒化锑：Sb₂Se₃；氧化石墨烯：GO；发卡DNA：hDNA；Dam甲基转移酶：Dam Mtase(购置于NEB公司)；限制性核酸内切酶：DPn I(购置于NEB公司)；单链DNA：ssDNA；壳聚糖：CS；三氯化锑：SbCl₃；2-甲氧基乙醇：2-ME；巯基乙酸：TGA；乙醇胺：EA；2-巯基乙醇：MCH；氧化铟锡半导体电极：ITO；激子能量转移：EET。

本发明中hDNA和S1均由生工生物工程(上海)合成。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器，由Sb₂Se₃-GO-CS修饰基底电极，hDNA(5’-CAGAGATCCATATACGTTTTTCGTATATGGATCTCTGAAAAA(CH₂)₆-NH₂-3’)(SEQ ID NO.1)共价结合到修饰后的基底电极上，Dam MTase甲基化和DPn I剪切后在电极上得到ssDNA(5’-TCTCTGAAAAA(CH₂)₆-NH₂-3’)(SEQ IDNO.2)，S1(5’-TTTTTCAGAGA(CH₂)₆-SH-3’)(SEQ ID NO.3)-AuNPs与ssDNA特异性结合得到。

作为优选，所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。

其中，所述Sb₂Se₃-GO-CS中CS的质量浓度为0.01wt％-0.5wt％，优选为0.05wt％；CS溶液的溶剂为乙酸。

其中，所述的Sb₂Se₃-GO由0.8mg/mL GO水溶液与0.8mg/mL Sb₂Se₃水溶液混合，超声2-3h即得；Sb₂Se₃水溶液与GO水溶液的体积比为1：(0.01-1)，优选为1:0.75；超声功率为60-100Hz，优选为80Hz。

其中，所述Sb₂Se₃由Se的前驱体溶液与含有SbCl₃的2-ME溶液混合加热反应，洗涤干燥即得。具体的，称取0.3-0.5g Se于TGA和EA的混合液中，后将上述溶液与含有0.05-0.2M SbCl₃的2-ME溶液混合，60-90℃加热反应12-14h，洗涤干燥，即得。

其中，所述的S1-AuNPs由AuNPs与S1搅拌反应即得；所述AuNPs由HAuCl₄的水溶液加热至沸腾，后加入柠檬酸钠溶液，继续反应，后冷却至室温即得。具体的，所述的S1-AuNPs由以下方法制备而成：移取5-10μL 50-200μM的S1于0.5-2mL AuNPs中，3.8-4.2℃下磁力搅拌反应10-14h，即得。所述的AuNPs由以下方法制备而成：取30-40mL 0.005-0.02％的HAuCl₄溶液于圆底烧瓶中加热煮沸，后加入35.0-40.0mM柠檬酸钠溶液，反应10-20min，冷却至室温，即得。

本发明所述的检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)信号层固定：将Sb₂Se₃-GO与CS的混合溶液滴加在基底电极表面，干燥的室温下晾干，后50–100℃再干燥，用去离子水清洗，晾干；

(2)锚定识别分子：向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS混合溶液，室温放置1-2h，用PBS溶液清洗，清洗后将识别分子hDNA滴加到基底电极上，25-37℃孵育2-3h，然后用PBS溶液清洗；

(3)非特异性位点封闭：向步骤(2)得到的基底电极表面滴加MCH溶液，封闭0.5-1h，然后用PBS溶液清洗；

(4)甲基化反应：将Dam Mtase溶液滴涂在步骤(3)得到的基底电极表面，25-37℃孵育1-2h，然后用PBS溶液清洗；

(5)剪切酶作用：将Dpn I溶液滴涂在步骤(4)得到的基底电极表面，25-37℃下反应1-2h，然后用PBS溶液清洗；

(6)光电化学免疫传感器的构建：向步骤(5)得到的基底电极表面滴加S1-AuNPs溶液进行特异性反应，25-37℃孵育1-2h，然后用PBS溶液清洗，晾干，即得光电化学免疫传感器。

其中，步骤(1)中，Sb₂Se₃-GO-CS溶液是过量的。所述过量为滴加的量比实际起作用的量要多，所以反应完要清洗。

其中，步骤(2)中NHS浓度为5-20mg/mL，优选为10mg/mL，溶剂为0.01M，pH＝6PBS。EDC浓度为10-30mg/mL，优选为20mg/mL，溶剂为0.01M，pH＝6PBS。hDNA的浓度为0.1-0.5μM，优选为0.4μM，溶剂为0.01M，pH＝7.4PBS。洗涤PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。EDC/NHS和hDNA是过量的。

其中，步骤(3)中MCH的浓度为1-4mM。优选为2mM，溶剂为H₂O。洗涤PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。MCH溶液是过量的。

其中，步骤(4)中Dam Mtase的浓度5-20U·mL^-1，优选为10U·mL^-1，溶剂为Dam甲基化酶缓冲液。洗涤PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。Dam Mtase是过量的。

其中，步骤(5)中Dpn I的浓度为5-20U·mL^-1,优选为10U·mL^-1，溶剂为CutSmart缓冲液。PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。Dpn I是过量的。

步骤(6)中，S1-AuNPs溶液是过量的。PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。

本发明所述的检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器在定量检测DNA甲基化酶活性中的应用。

本发明中使用的原料和试剂，包括酶试剂均市售可得。

工作原理：Sb₂Se₃是一种带隙较窄(1.0-1.3eV)的p型半导体材料，有优异的光电性能与热电性能，本发明基于Sb₂Se₃与Au NPs之间竞争吸收光与激子能量转移(EET)的作用，开发了一种夹心型“signal-off”PEC生物传感器用于DNA MTase的灵敏检测。由于Sb₂Se₃的发射峰与Au NPs等离子体带之间有重叠，它们之间强的EET作用可以减小Sb₂Se₃的光电流信号。

本发明将Sb₂Se₃-GO-CS复合物作为PEC传感器的基底。一方面，壳聚糖(CS)可以形成渗透性较好的膜使Sb₂Se₃-GO固定在电极表面。另一方面，GO表面带有丰富的羧基活性位点，可以进一步共价偶联生物分子，同时增加了溶液的分散性，通过酰胺键共价结合大量发夹DNA(hDNA)，在将hDNA用Dam MTase甲基化后，通过限制性核酸内切酶(DPn I)的剪切作用，释放出单链DNA(ssDNA)。

当存在Au NPs功能化的DNA(S1)时，S1-AuNPs可以与剪切酶剪切后留在电极上的ssDNA进行杂交，形成的免疫复合物拉近了AuNPs与电极基底之间的距离，同时诱发了Sb₂Se₃与AuNPs之间的EET作用，从而有效地淬灭Sb₂Se₃-GO PEC信号，进而降低了光电流。此外，由于杂交形成的免疫复合物增加了空间位阻，可以进一步降低了光电流。构建的“signal-off”PEC免疫传感器具有良好的稳定性与灵敏性，将为疾病的早期诊断与治疗提供了新的平台。

为了和基底材料上的羧基结合本发明设计了hDNA序列及其官能团(-NH₂)；然后经过甲基化和剪切作用得到的ssDNA序列；同时本发明中设计的S1根据碱基互补配对原则设计的来和ssDNA特异性结合，其中S1中的官能团-SH是为了和Au连接。hDNA经甲基化，剪切后得到ssDNA，ssDNA可以和S1特异性结合，形成一种三明治型的免疫传感。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明利用淬灭剂S1-AuNPs对电极基地上的Sb₂Se₃-GO有很好淬灭作用的原理构建了三明治型光电化学免疫生物传感器，用于DNA甲基化酶活性的检测。本发明中的Sb₂Se₃是一种高效，低毒，价廉，稳定的光电活性材料，同时与GO复合后可以提高其生物相容性，基于Sb₂Se₃-GO所构建的免疫传感器与传统的光学等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速，价格低廉且易于微型化等特点，将在医学诊断方面发挥重要作用。

附图说明

图1为光电化学免疫传感器的淬灭剂响应图；

图2为光电活性检测电流-时间图；

图3为免疫传感器的组装过程中电极表面电流变化曲线图；

图4为Dam Mtase浓度与光电流强度之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。

实施例1

光电活性物质Sb₂Se₃-GO的制备

(1)Sb₂Se₃的合成：用分析天平准确称取0.405g硒粉，并将其溶于0.46mL的TGA与7.54mL的EA的混合溶液中得到Se的前驱体溶液；接着将上述Se的前驱体溶液与12mL溶有0.1M SbCl₃的2-ME溶液共同转移至圆底烧瓶中，80℃搅拌12h。后依次用乙醇、超纯水多次离心洗涤，干燥。

(2)Sb₂Se₃-GO复合物的合成：将100μL 0.8mg/mL Sb₂Se₃水溶液和75μL0.8mg/mLGO水溶液混合超声2h，超声功率为80Hz，即可制得Sb₂Se₃-GO复合物。

(3)AuNPs的合成：取34mL 0.1mg/mL的HAuCl₄溶液于100mL圆底烧瓶中，在温度稳定为100℃后，加入850μL的38.8mM柠檬酸钠溶液，继续反应15min，冷却至室温，4℃冰箱中保存。

(4)S1-AuNPs的合成：取1mL步骤(3)中的AuNPs置于玻璃瓶中，再加入5μL 100μM的单链DNA(S1)，4℃下磁力搅拌反应12h，4℃冰箱中保存待用。

实施例2

光电化学免疫传感器的制备方法

(1)信号层固定

向0.16cm²的ITO上滴加10μL Sb₂Se₃-GO(实施例1制备)与CS(0.05wt％)的混合溶液，室温下过夜，然后于80℃下干燥1h，后用去离子水清洗，晾干，得Sb₂Se₃-GO/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(20mg·mL^-1)与NHS(10mg·mL^-1)的混合溶液于步骤(2)得到的基底电极，以活化GO表面的羧基，后向上述电极上滴加10μL 0.4μM的hDNA溶液，37℃孵育2h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的hDNA。

(3)非特异性位点封闭：为了覆盖电极表面除抗体以外还能与hDNA结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL 2mM MCH溶液(溶剂为H₂O)，37℃孵育40min，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的MCH溶液。

(4)甲基化反应

滴加10μL Dam Mtase(10U·mL^-1)溶液于步骤(3)得到的基底电极，37℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的Dam MTase溶液。

(5)剪切酶作用

滴加10μL Dpn I(10U·mL^-1)溶液于步骤(4)得到的基底电极，37℃下反应2h，释放出ssDNA，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的DpnI溶液。

(6)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(5)所得的基底电极滴加10μL S1-AuNPs溶液(实施例1制备)，37℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的S1-AuNPs，晾干，即得光电化学免疫传感器。

将制备好的传感器放入0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液中检测电极在剪切酶作用后与结合S1-AuNPs后两步的光电流变化，分析结果。

实施例3

猝灭剂的光电活性检测

(1)仪器：上海辰华电化学工作站(chi660e软件)，氙灯光源，万用电表

(2)材料及试剂：

ITO：氧化铟锡半导体电极，规格为0.4cm×0.4cm

电解液：0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液

试剂：S1-AuNPs，S1

(3)方法：

电极处理：ITO电极置于丙酮，乙醇，超纯水中各超声20min，氮气吹干，用万用电表测试正反并做标记待用。

电极制备：按照实施例2的步骤(1)-(5)制备电极Dpn I/Dam/hDNA/Sb₂Se₃-GO/ITO，后于上述电极上分别孵育10μL S1-AuNPs(实施例1制备)与10μL 100μM S1，37℃，2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的S1-AuNPs和S1，最后检测电极光电流强度。

测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，观察电极表面电流在光照下的强度与其无光照时的差异，比较对基底Sb₂Se₃-GO光电强度的猝灭效果。

(4)结果：

S1-AuNPs的猝灭效果如图1所示，从图中可以看出S1-AuNPs修饰电极的ΔI/I₀明显高于S1的ΔI/I₀，表明AuNPs可以作为该传感器的淬灭剂，同时也说明构建的“signal-off”免疫传感器是可行的。本实施例证明所选取的AuNPs对Sb₂Se₃的光电有优异的淬灭作用。

实施例4

光电化学免疫传感器组装过程中电极表面光电流监测

(1)仪器：同实施例3

(2)材料及试剂：

ITO：同实施例3

电解液：同实施例3

试剂：Sb₂Se₃-GO(实施例1制备)、0.05wt％CS、20mg·mL^-1EDC、10mg·mL^-1NHS、0.4μM hDNA、2mM MCH、10U/mL Dam MTase、10U/mL Dpn I、S1-AuNPs(实施例1制备)

(3)方法：

电极处理：同实施例3

传感器组装：按照实施例2进行光电免疫传感器的组装。

测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，依次于0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液中检测观察电极表面电流在光照下的强度与其无光照时的差异，探究所构建的免疫传感器的可行性。

(4)结果：

图2为光电活性检测电流-时间图：a为基底电极Sb₂Se₃-GO/ITO(实施例2步骤1)，b为hDNA/Sb₂Se₃-GO/ITO(实施例2步骤2)，c为Dpn I/Dam/hDNA/Sb₂Se₃-GO/ITO(实施例2步骤5)，d为S1-AuNPs/Dpn I/Dam/hDNA/Sb2Se3-GO/ITO(即本发明实施例2光电传感器)。从图2可以看出，当Sb₂Se₃-GO固定在ITO电极上后，显示出明显的光电流，表明Sb₂Se₃-GO是用于构建PEC传感器优异的光电活性材料。然后继续向电极上固定hDNA，发现光电流明显降低，由于hDNA属于生物大分子，阻碍了AA与电极之间电子之间的传递。当进一步组装Dam MTase和Dpn I后，光电流稍稍增加，表明Dpn I成功将甲基化的hDNA剪切为ssDNA，降低了电极表面空间位阻。当修饰S1-AuNPs后，发现光电流显著降低，这是因为DNA杂交拉近了AuNPs与电极基底的距离，诱发了AuNPs与Sb₂Se₃-GO之间EET作用，再加上空间位阻的增加，传感器的光电流大大降低，说明构建的光电免疫传感器的可行性。

实施例5

光电化学免疫传感器组装过程中电极表面电流监测

(1)仪器：上海辰华电化学工作站(chi660e软件)

(2)材料及试剂：

ITO：同实施例3

电解液：2mM铁***，溶剂0.01M PBS，pH＝7.4

试剂：同实施例4

(3)方法：

电极处理：ITO电极处理同实施例2

传感器组装：按照实施例2进行光电免疫传感器的组装。

测试：依次于2mM铁***的磷酸盐缓冲液中检测其CV图(Cyclic voltammetry,CV)，比较各步骤电极表面与溶液界面电流的变化，监测传感器组装的正常进行。

(4)结果：

传感器组装过程中电极表面电流监测，见图3，a至d曲线为电极层层组装过程中的电极表面电流变化曲线。当电极上修饰基底Sb₂Se₃-GO后，出现一对明显的氧化还原峰(a曲线)。当在电极上进一步修饰hDNA时，观察到峰电流的明显降低(b曲线)，这是由于hDNA自身位阻很大，阻碍了电极表面的电子转移。随后，在电极上继续组装MCH、Dam MTase和Dpn I(c曲线)后，氧化还原峰电流比hDNA稍微增强，因为在Dam MTase和Dpn I共同作用下，hDNA被剪切为ssDNA，位阻减小，从而使氧化还原峰电流有所增加。最后，当电极进一步与S1-AuNPs(d曲线)孵育时，氧化还原峰电流再次增加，这是因为AuNPs有助于[Fe(CN)₆]^3-/4-与ITO电极之间的电子传递。本实施例是为了说明该光电化学免疫传感器已成功组装。

实施例6

Dam MTase浓度与光电流降低比率之间的线性关系

(1)仪器：同实施例3

(2)材料及试剂：

ITO：同实施例3

电解液：同实施例3

试剂：Sb₂Se₃-GO(摩尔比1:0.75)、0.05wt％CS、20mg·mL^-1EDC、10mg·mL^-1NHS、0.4μM hDNA、2mM MCH、0.001-100U/mL Dam MTase、10U/mL Dpn I、S1-AuNPs

(3)方法：

电极处理：ITO电极处理同实施例3。

传感器组装：按照实施例2行光电免疫传感器的组装，不同的是步骤(4)配制不同浓度的Dam MTase溶液(0.001-100U·mL^-1)进行测定。

测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，观察电极表面电流在光照下的强度，比较在剪切酶作用后与结合S1-AuNPs后两步间的光电流变化，分析光电流强度变化率与Dam MTase浓度关系。

图4为Dam MTase浓度与光电流强度之间的线性关系图。从图4可以看出，光电流的降低比率与Dam MTase浓度呈线性相关关系，y＝0.0234x+0.375，相关系数R²＝0.988，检测范围为1mU/mL-100U/mL。本实施例说明本发明的光电免疫传感器可以定量检测DNA甲基化酶活性，并且检测效果好，检测范围宽，操作简便，反应迅速。

实施例7

实施例7与实施例1制备相同，Sb₂Se₃-GO复合物制备不同之处在于：称取0.3g Se于TGA和EA的混合液中，后将上述溶液与含有0.05M SbCl₃的2-ME溶液混合，60℃加热反应14h，洗涤干燥，即得Sb₂Se₃；GO水溶液与Sb₂Se₃水溶液混合，超声3h超声功率为60Hz，Sb₂Se₃与GO的体积比为1：0.01，即可制得Sb₂Se₃-GO复合物。

S1-AuNPs的合成不同之处在于：取30mL 0.02％的HAuCl₄溶液于圆底烧瓶中加热煮沸，后加入35.0mM柠檬酸钠溶液，反应10min，冷却至室温，即得AuNPs，4℃冰箱中保存；移取5μL 50μM的S1于0.5mL AuNPs中，3.8℃下磁力搅拌反应14h，即得S1-AuNPs，4℃冰箱中保存待用。

实施例8

实施例8与实施例1制备相同，Sb₂Se₃-GO复合物制备不同之处在于：称取0.5g Se于TGA和EA的混合液中，后将上述溶液与含有0.2M SbCl₃的2-ME溶液混合，90℃加热反应12h，洗涤干燥，即得Sb₂Se₃；GO水溶液与Sb₂Se₃水溶液混合，超声2h超声功率为100Hz，Sb₂Se₃与GO的体积比为1：1，即可制得Sb₂Se₃-GO复合物。

S1-AuNPs的合成不同之处在于：取40mL 0.005％的HAuCl₄溶液于圆底烧瓶中加热煮沸，后加入40.0mM柠檬酸钠溶液，反应20min，冷却至室温，即得AuNPs，4℃冰箱中保存；移取10μL 200μM的S1于0.5mL AuNPs中，4.2℃下磁力搅拌反应10h，即得S1-AuNPs，4℃冰箱中保存待用。

实施例9

(1)信号层固定

向0.16cm²的ITO上滴加10μL Sb₂Se₃-GO(实施例7制备)与CS(0.01wt％)的混合溶液，室温下过夜，然后于80℃下干燥1h，后用去离子水清洗，晾干，得Sb₂Se₃-GO/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(5mg·mL^-1)与NHS(10mg·mL^-1)的混合溶液于步骤(1)得到的基底电极，以活化GO表面的羧基，后向上述电极上滴加10μL 0.1μM的hDNA溶液，25℃孵育2h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的hDNA。

(3)非特异性位点封闭：为了覆盖电极表面除抗体以外还能与hDNA结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL 1mM MCH溶液(溶剂为H₂O)，37℃孵育40min，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的MCH溶液。

(4)甲基化反应

滴加10μL Dam Mtase(5U·mL^-1)溶液于步骤(3)得到的基底电极，25℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的Dam MTase溶液。

(5)剪切酶作用

滴加10μL Dpn I(5U·mL^-1)溶液于步骤(4)得到的基底电极，25℃下反应2h，释放出ssDNA，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的Dpn I溶液。

(6)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(5)所得的基底电极滴加10μL S1-AuNPs溶液(实施例7制备)，25℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的S1-AuNPs，晾干，即得光电化学免疫传感器。

实施例10

(1)信号层固定

向0.16cm²的ITO上滴加10μL Sb₂Se₃-GO(实施例8制备)与CS(0.5wt％)的混合溶液，室温下过夜，然后于80℃下干燥1h，后用去离子水清洗，晾干，得Sb₂Se₃-GO/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(20mg·mL^-1)与NHS(30mg·mL^-1)的混合溶液于步骤(1)得到的基底电极，以活化GO表面的羧基，后向上述电极上滴加10μL 0.5μM的hDNA溶液，37℃孵育1h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的hDNA。

(3)非特异性位点封闭：为了覆盖电极表面除抗体以外还能与hDNA结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL 4mM MCH溶液(溶剂为H₂O)，37℃孵育40min，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的MCH溶液。

(4)甲基化反应

滴加10μL Dam Mtase(20U·mL^-1)溶液于步骤(3)得到的基底电极，37℃孵育1h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的Dam MTase溶液。

(5)剪切酶作用

滴加10μL Dpn I(20U·mL^-1)溶液于步骤(4)得到的基底电极，37℃下反应1h，释放出ssDNA，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的Dpn I溶液。

(6)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(5)所得的基底电极滴加10μL S1-AuNPs溶液(实施例8制备)，37℃孵育1h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的S1-AuNPs，晾干，即得光电化学免疫传感器。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种检测DNA甲基化酶活性的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagagatcca tatacgtttt tcgtatatgg atctctgaaa aa 42

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<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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