阅读说明：本技术 一种11-脱氢血栓烷b2抗原及其制备方法 (11-dehydrothromboxane B2 antigen and preparation method thereof ) 是由 邹佳信 张伯平 蔡泽浪 于 2019-11-02 设计创作，主要内容包括：本发明针对现有11-脱氢-血栓烷B<Sub>2</Sub>检测技术存在的缺陷,目的在于提供一种用于免疫竞争反应的11-脱氢-血栓烷B<Sub>2</Sub>标记抗原,以及制备方法。本发明所提供的11-脱氢-血栓烷B<Sub>2</Sub>标记抗原,其主要特征是抗原分子中同时含有六聚组氨酸和生物素结构,并在制备过程中可用Ni亲和层析柱纯化。本发明所提供的11-脱氢-血栓烷B2标记抗原具有化学结构明确、易于分离纯化、与抗体亲和能力较强等特点,适合大规模生产并可提高检测系统的性能。(The present invention is directed to the existing 11-dehydro-thromboxane B 2 The detection technology has defects and aims to provide 11-dehydro-thromboxane B for immune competitive reaction 2 Labeled antigens, and methods of preparation. The 11-dehydro-thromboxane B provided by the invention 2 The marked antigen is mainly characterized in that the antigen molecules simultaneously contain a hexahistidine and biotin structure, and can be purified by using a Ni affinity chromatography column in the preparation process. The 11-dehydrogenation-thromboxane B2 labeled antigen provided by the invention has the characteristics of definite chemical structure, easiness in separation and purification, strong affinity with an antibody and the like, is suitable for large-scale production, and can improve the performance of a detection system.)

一种11-脱氢血栓烷B2抗原及其制备方法

技术领域

本发明属体外诊断领域，具体来说是一种11-脱氢血栓烷B2抗原及其制备方法，应用于人体尿液样本中11-脱氢-血栓烷B2的定量检测。

背景技术

血栓烷A2(Thromboxane A2，TXA2)是人体血液中已知最强的血小板凝集剂，血液中TXA2含量与粥样硬化血栓的形成密切相关，其值在一定程度上可以反映患者发生心脑血管意外(如脑卒中、心肌梗死等)的风险。阿司匹林(Aspirin)类药物可以抑制血小板环氧合酶-1(COX-1)和血小板环氧合酶-2(COX-2)的活性，进而降低患者血液中TXA2的含量，减少血小板异常凝集。所以，阿司匹林成为目前心脑血管疾病治疗的一个重要药物；同时，长期服用低剂量的阿司匹林也是预防心脑血管疾病的有效手段。

然而，阿司匹林抑制血小板凝集的作用并非对所有人都有效。相关统计结果显示，约25%的患者长期服用常规计量的阿司匹林，但不能有效减少体内TXA2的生成量，此现象被称为“阿司匹林抵抗（Aspirin Resistance）”。所以，临床医生需要一种可靠的方式来分析个体对阿司匹林的特异反应，帮助医生判断治疗情况，据此调节个体的治疗方案。不幸的是，TXA2在血液中半衰期仅为30秒，临床上对血液中的TXA2含量分析非常困难。

11-脱氢-血栓烷B2(11-dehydro-thromboxane B2,11-dhTXB2)是TXA2在尿液中的代谢产物，尿液中11-dhTXB2含量能精准反映患者体内TXA2的生物合成水平。所以，可以通过测定尿液中的11-dhTXB2含量评估患者血小板活化水平，帮助医生确定抗血小板凝集治疗效果；进一步可对患者发生脑卒中等心脑血管意外的风险进行预测，以达到及时采取治疗措施的目的。

11-dhTXB2为小分子化合物，在尿液中浓度极低，临床上测定主要依靠于免疫竞争法，检测的核心定量环节是标记抗原与待检抗原被抗体“捕捉”的竞争反应。检测所使用的标记抗原一般为11-dhTXB2与酶通过偶联反应制得的偶联物。然而，使用这样的标记抗原在制备和使用过程中存在一些问题：（1）偶联反应和抗原纯化过程中，标记酶的活性可能下降；（2）偶联反应位点具有不确定性，所制得标记抗原的化学结构不一致，批次差异大，检测试剂（盒）的批间差难以调控；（3）标记抗原上会不可避免地链接多个11-dhTXB2分子，在检测过程中必然消耗大于1当量的11-dhTXB2抗体，检测系统的分析灵敏度难以达到较高的水平；（4）基于酶的抗原相对分子质量较高，其空间位阻和扩散行为相对于小分子11-dhTXB2差异明显，抗体对二者的亲和力会产生差距，限制了检测系统的线性范围。

发明内容

针对以上技术缺陷，本发明提供一种11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原及其制备方法，用于11-脱氢-血栓烷B₂的定量检测，其特征是抗原分子中同时含有六聚组氨酸和生物素结构。本发明所提供的11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原具有化学结构明确、易于分离纯化、与抗体亲和能力较强等特点，适合大规模生产并可提高检测系统的性能。

具体来说，本发明的内容包括：

[1] 一种用于11-脱氢-血栓烷B₂定量检测的标记抗原，其特征是抗原分子中同时包含11-脱氢-血栓烷B₂、六聚组氨酸、生物素三部分，其结构式为：

；

[2] 一种权利要求[1]所述的用于11-脱氢-血栓烷B₂定量检测的标记抗原的制备方法，其特征是在制备过程中使用Ni亲和层析柱纯化，包括以下步骤：

（1）在溶剂中加入11-脱氢-血栓烷B₂和加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），其混合均匀后，加入六聚组氨酸，应0.5~2小时后，用Ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷B₂与六聚组氨酸偶联物，其中，11-脱氢-血栓烷B₂和六聚组氨酸的投料比为1:1.05~1:1.4；

（2）在溶剂中加入11-脱氢-血栓烷B₂与六聚组氨酸偶联物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），其混合均匀后，加入氨基化生物素，反应0.5~2小时后，用Ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原，其中11-脱氢-血栓烷B₂与六聚组氨酸偶联物和氨基化生物素的投料比为1:1.2~1:2.0；

[3] 权利要求[1]所述的制备方法的化学反应方程式为：

附图说明

图1. 标记抗原合成反应的化学方程式

图2. 标记抗原的化学结构式

图3. 实施例3中相关性检测

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施案例中所使用的试剂如表一所示

表一：实施例中试剂来源

实施例1：11-脱氢-血栓烷B₂抗原的制备

在3ml DMF中加入1mg 11-脱氢-血栓烷B₂和0.85 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，震荡均匀，再加入2mg六聚组氨酸，震荡2h，纯化水稀释50倍，用Ni亲和层析柱纯化，浓缩，得到11-脱氢-血栓烷B₂与六聚组氨酸偶联物，产率85%；

将1mg六聚组氨酸与11-脱氢-血栓烷B₂偶联物溶解于5ml DMF，加入0.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，震荡，加入0.48mg氨基化生物素，震荡2h，纯化水稀释20倍，用Ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原，产率71%；

综合产率60%。

化学反应方程式如图1所示；产物11-脱氢-血栓烷B₂抗原的化学结构如图2所示。

实施例2：11-脱氢-血栓烷B₂抗原用于临床检测

按下表配方制备试剂，并组合为11-脱氢-血栓烷B₂检测试剂盒

按以下步骤，使用实施例1中所制备的11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原测定11-脱氢-血栓烷B₂：

[1]将50ul待检样本（标准品）加入羊抗鼠包被的96孔微量滴定板中；

[2]再依次加入50ul 11-脱氢-血栓烷B₂标记抗原和50ul鼠源11-脱氢-血栓烷B₂单克隆抗体，37℃孵育30min，清洗微孔；

[3]加入50ul链霉亲和素与碱性磷酸酶偶联物，37℃孵育30min，清洗微孔；

[4]加入150ul p-硝基苯磷酸溶液，37℃避光孵育10min；

[5]加入50ul乙二胺四乙酸溶液终止反应；

[6]在405nm出读数，绘制标准曲线。

使用HPLC法和上述方法，同时测定50例人体尿液样本中的11-脱氢-血栓烷B2含量，以检测本发明所提供的标记抗原的可靠性。实验结果如图3所示，本发明提供的标记抗原测定与HPLC法测定的结果具有良好的相关性，说明检测结果可靠。