阅读说明：本技术 可控性上调Ang-(1-7)靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体 (Controllable up-regulation Ang- (1-7) targeting expression vector for preventing and treating hypoxic pulmonary hypertension ) 是由 刘曼玲 董明清 李志超 董海莹 赵澎涛 张博 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可控性上调Ang-(1-7)靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体。本发明构建了HRE增强、Tie2启动子驱动的Ang-(1-7)表达载体,通过Tie2启动子特异定位于血管内皮细胞,同时,利用HIF-1α只在低氧的肺血管内皮细胞表达特异性激活HRE,从而上调Ang-(1-7)的表达。本发明发现所构建的表达载体不仅具有靶向性,而且可以根据缺氧程度可控和有效地上调Ang-(1-7)在低氧的肺微血管内皮细胞中的表达,进而调控肺动脉平滑肌细胞,实现低氧可控性、靶向性地抑制肺动脉的收缩和逆转肺动脉的结构重建,为防治低氧性肺动脉高压等疾病提供有效手段和策略。(The invention discloses an expression vector for controllably up-regulating Ang- (1-7) targeting prevention and treatment of hypoxic pulmonary hypertension. The invention constructs an Ang- (1-7) expression vector driven by HRE enhanced and Tie2 promoter, which is specifically positioned in vascular endothelial cells through a Tie2 promoter, and simultaneously, the HRE is specifically activated by using HIF-1 alpha only expressed in hypoxic pulmonary vascular endothelial cells, thereby up-regulating the expression of Ang- (1-7). The invention discovers that the constructed expression vector not only has targeting property, but also can controllably and effectively up-regulate the expression of Ang- (1-7) in hypoxic pulmonary microvascular endothelial cells according to the degree of hypoxia so as to further regulate and control pulmonary artery smooth muscle cells, realize the controllability of hypoxia and the targeted inhibition of pulmonary artery contraction and the structural reconstruction of reversal pulmonary artery, and provide effective means and strategies for preventing and treating diseases such as hypoxic pulmonary hypertension and the like.)

可控性上调Ang-(1-7)靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达 载体

技术领域

本发明涉及应用基因重组技术治疗低氧性肺动脉高压领域，具体涉及HRE增强的Tie2启动子驱动的血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]表达载体的构建方法。

背景技术

低氧性肺动脉高压(HPH)是多种呼吸系统疾病、慢性高原疾病和与低氧血症相关的各类疾病的共同发病环节。低氧引起的低氧性肺血管收缩是机体重要的生理性反应之一，在维持低氧的肺泡周围的通气/血流比例，减少功能性分流，提高血氧饱和度方面具有重要意义。但长期、广泛的低氧性肺血管收缩，可导致肺血管结构重建。肺血管结构重建是造成肺动脉压力持续增高，及促进肺源性心脏病发生发展的关键因素。因此特异性舒张肺动脉、抑制或逆转肺血管重建是防治低氧性肺动脉高压及其并发症的主要目标。

研究表明肺内肾素-血管紧张素(RAS)系统参与低氧性肺动脉高压的发生发展。低氧性肺动脉高压时，RAS的主要效应蛋白血管紧张素II(AngII)不仅强烈收缩肺血管，还显著促进肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖、肥大，是造成肺血管阻力持续增加的重要因素之一。RAS的其他成员，如肾素、血管紧张素原等也以各种途径参与到HPH的发生发展过程中。因此低氧性肺动脉高压时，肺内RAS的功能异常可能是造成低氧性肺血管收缩和结构重建的重要原因之一。最近发现RAS的新成员Ang-(1-7)，是一种具有心血管保护作用的七肽，能够显著对抗AngII的缩血管、促增殖的作用，从而发挥舒血管、利尿、降血压和抑制细胞增殖的作用。因此增加肺循环内的Ang-(1-7)表达，将有利于改善肺内RAS的功能紊乱，抑制低氧性肺血管收缩和逆转肺血管结构重建，进而起到有效防治低氧性肺动脉高压的作用。

但是常规的给药途径缺乏特异性，导致体循环血压降低的副作用。而且长期、单一扩张肺血管，还可以导致静脉血掺杂，加重低氧血症。如何使Ang-(1-7)只特异性定位于肺血管中，并只在低氧时的肺血管中表达增多，而且还可根据低氧的程度实现可控性的调节，是防治低氧性肺动脉高压的重点和关键。

中国专利CN101532027(公开日：2009年9月16日)公开了一种缺氧诱导真核基因表达载体及其用途，通过对pcDNA3.1进行的改造，将其增强子用缺氧诱导的增强子替代，构建了缺氧诱导基因表达载体；为了检测缺氧诱导基因表达载体的功能，将hVEGF165的cDNA***到载体中，构建了含hVEGF165的缺氧诱导真核基因表达载体p6HRE-hVEGF165，并将该载体转入BHK细胞中，表达hVEGF的BHK细胞在缺氧环境下培养，用ELISA的方法检测培养上清液中hVEGF的含量，结果证明缺氧诱导后hVEGF的表达量增加；将p6HRE-hVEGF165用于家兔肢体缺血性疾病的基因治疗，可有效地促进患肢新生血管和侧支循环的形成，使患肢胫动脉压恢复。

但是肺循环血管与上述专利中的体循环血管具有明显不同的特性。肺血管在短期低氧时发生低氧性收缩，以维持低氧的肺泡周围的通气/血流比例，减少功能性分流，提高血氧饱和度；长期低氧则造成内皮素、5-羟色胺血管、内皮生长因子(VEGF)等血管活性物质分泌过多进而参与肺血管重构，加重肺部缺血缺氧程度，这是造成低氧性肺动脉高压的病理生理学特征。体循环血管在低氧时则明显舒张，增加血流以减轻缺血缺氧的症状。因此低氧性肺动脉高压(HPH)需要根据缺氧程度给予更精确的表达调控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可控性上调Ang-(1-7)靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种Ang-(1-7)重组表达载体(简称HTSFCAng(1-7))，包括低氧反应元件、启动子、信号肽(Signal Peptide)序列及Ang-(1-7)编码序列，其中，所述低氧反应元件选自HRE序列，在发挥HRE作用的同时，利用启动子使Ang-(1-7)的表达具有血管内皮细胞特异性。

优选的，所述HRE序列的重复排列次数为1～100。

优选的，所述启动子选自Tie2基因启动子。

优选的，所述表达载体具体包括依次排列的6×HRE序列、Tie2基因启动子序列、信号肽及hIgG1Fc融合标记序列和Ang-(1-7)编码序列。

优选的，所述表达载体构建于腺相关病毒载体骨架或真核表达载体骨架上。

上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：合成6×HRE序列、Tie2基因启动子序列、信号肽序列及hIgG1Fc融合标记序列和Ang-(1-7)编码序列；将合成的各个序列克隆到表达载体骨架(例如，pAAV-MCS)中，并将得到的重组质粒称为HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)(简称HTSFCAng(1-7))。将不含Ang-(1-7)编码序列的重组质粒作为对照质粒，称为HRE-Tie2-FC(简称HTSFC)。

上述表达载体(HTSFCAng(1-7))在制备用于预防和/或治疗低氧性肺动脉高压和/或低氧性肺动脉高压并发症的药物中的用途。

优选的，所述表达载体具有细胞靶向性，常氧(21％O₂浓度)条件下仅在转染后的肺微血管内皮细胞(PMVECs)中使Ang-(1-7)特异性地高表达。

优选的，所述表达载体具有低氧(氧浓度低于21％，即缺氧)可控性，在不同浓度的低氧(10％、5％和1％O₂)刺激下，转染后的PMVECs上清中Ang-(1-7)的含量显著增加，并且其增加率随着氧浓度的降低而升高。

优选的，所述表达载体具有抑制PASMCs增殖的有效性，例如，PMVECs转染HTSFCAng(1-7)后给予10％氧浓度的低氧刺激，继续培养24h后收集的PMVECs细胞上清即为含表达载体HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液，该PMVECs低氧条件培养液对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖有明显的抑制作用。

优选的，所述表达载体可在器官水平上抑制低氧性肺小动脉收缩，例如，含有表达载体HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液能够减轻大鼠肺小动脉环受低氧影响而产生的收缩反应，舒张肺小动脉环，该舒张作用能被Mas受体阻断剂A-779阻断。

优选的，包装为腺相关病毒的HTSFCAng(1-7)表达载体以滴鼻方式一次性作用于低氧性肺动脉高压大鼠后，能够降低大鼠右心室压，减轻右心室肥厚程度，抑制肺小动脉的结构改变，改善肺动脉结构重建，并且该病毒进入大鼠体内后使得Ang-(1-7)只在肺组织表达增多，具有组织特异性。

上述表达载体(HTSFCAng(1-7))在制备用于预防和/或治疗糖尿病坏疽、深静脉血栓、缺血性心脏病等与低氧和/或缺血相关的一系列疾病的药物中的用途。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用启动子驱动表达定位于血管内皮细胞的特异性、HRE的低氧条件性表达和Ang-(1-7)具有舒血管、抗增殖的特点，构建HRE增强、Tie2基因启动子驱动的Ang-(1-7)表达载体，能够使Ang-(1-7)靶向地、可控地和有效地在低氧的PMVECs中高表达，进而调控PASMCs，抑制肺动脉的收缩和结构重建，起到防治低氧性肺动脉高压的作用，为研究低氧性肺动脉高压及其并发症的基因治疗提供新策略和重要的实验依据，具有良好的应用前景。

进一步，本发明通过使用Tie2基因启动子(Tie2启动子)，提高了表达的组织特异性，解决了现有真核表达载体启动子导致的体循环血压降低的副作用，避免了长期、单一降低肺血管压力引发的静脉血掺杂，及加重患者低氧血症的问题。同时提高了表达可控性、精确性。

进一步的，本发明通过优化确定的HRE序列重复次数，保证缺氧的时候与后续序列的充分结合，并提高了表达可控性、精确性。

进一步的，本发明实验验证了重组质粒HTSFCAng(1-7)能够在低氧的肺动脉内皮细胞中高表达，进而调控肺动脉平滑肌细胞，实现低氧可控性、靶向性地抑制肺动脉的收缩和逆转肺动脉的结构重建。该重组质粒也同样适用于糖尿病坏疽、深静脉血栓、缺血性心脏病等与低氧或/和缺血相关的一系列疾病。

附图说明

图1为重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒结构示意图。

图2为重组质粒HTSFCAng(1-7)的酶切鉴定结果；泳道M为marker，泳道1为HTSFCAng(1-7)。

图3为对照质粒HTSFC的酶切鉴定结果；泳道M为marker，泳道1、2为HTSFC。

图4为常氧(21％O₂)条件下不同类型细胞转染HTSFCAng(1-7)后对细胞上清中Ang-(1-7)含量的影响；＊P<0.05vs.untransduced PMVECs cells,n＝5。

图5为重组质粒HTSFCAng(1-7)对常氧(21％O₂)及不同程度低氧(10％、5％和1％O₂)刺激的PMVECs上清液中Ang-(1-7)含量的影响；＊P<0.05vs.untransduced PMVECscells,n＝5。

图6为重组质粒HTSFCAng(1-7)对常氧(21％O₂)及不同程度低氧(10％、5％和1％O₂)刺激的PMVECs上清液中Ang-(1-7)含量增加率的影响；＊P<0.05vs.Normoxia+transduced HTSFCAng(1-7)组,n＝5，％P<0.05vs.10％Hypoxia+transduced HTSFCAng(1-7)组,n＝5。

图7为含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对常氧(21％O₂)及不同程度低氧(10％、5％和1％O₂)刺激的PASMCs增殖变化的影响；其中：(A)为常氧(21％O₂)及不同程度低氧(10％、5％和1％O₂)的刺激对PASMCs增殖变化的影响，＊P<0.05vs.Normoxia组,n＝5；(B)为常氧(21％O₂)条件下含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对PASMCs增殖变化的影响；(C)为不同程度低氧(10％、5％和1％O₂)条件下含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对PASMCs增殖变化的影响，＊P<0.05vs.Untransduced组,n＝5；(D)为10％低氧的条件下，不同浓度的含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对PASMCs增殖变化的影响，＊P<0.05vs.Untransduced组,n＝5。

图8为含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液及A779对低氧诱导的肺小动脉环张力变化的影响；其中：(A)为肺小动脉环在低氧条件下的张力变化示意图；(B)为含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对低氧诱导的肺小动脉环张力变化的影响；(C)为含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液和A779对低氧诱导的肺小动脉环张力变化的影响；(D)为含有HTSFC的PMVECs低氧条件培养液(对照条件培养液)对低氧诱导的肺小动脉环张力变化的影响；(E)为含有HTSFC的PMVECs低氧条件培养液和A779对低氧诱导的肺小动脉环张力变化的影响；(F)为最大舒张(Maximum vasodilation)的统计结果；(G)为延迟的持续收缩(Phase II vasoconstriction)的统计结果；＊P<0.05，#P<0.05。

图9为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；泳道M为marker，泳道1为AAV-HTSFC(541bp)，泳道2为HTSFCAng(1-7)(562bp)。

图10为腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)改善低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉结构重建进程的结果；其中：(A)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠平均左颈总动脉压(mean carotidarterial pressure，mCAP)的影响；(B)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠右心室压(RightVentricular Systolic Pressure,RVSP)的影响，(C)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠右心肥厚指数[RV/(LV+S)]的影响；(D)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠肺组织学的影响作用；(E)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠肺小动脉的面积比(WA％)的影响；(F)为AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠肺小动脉的管径比(WT％)的影响；*P<0.05,n＝8。

图11为腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)增加低氧性肺动脉高的大鼠肺组织匀浆中Ang-(1-7)的含量的结果；*P<0.05vs.hypoxia组,n＝8。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

一、重组质粒HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)的构建、鉴定和测序验证

全基因合成6×HRE序列(大鼠HRE为：5'GACTCCACAGTGCATACGTGGGCTTCCACAGGTCGTCTC3')和Tie基因(Tyrosine kinase with Id EGF homology domains)的启动子(Mus musculus receptor tyrosine kinase Tie2 gene,5'-flanking region,accessnumbe r AF022456.1,location:AF022456.1:1–223，简称Tie2启动子)。同时，合成信号肽及hIgG1Fc融合标记(SPFc:5'ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC3'，信号肽和融合标记是融合在一段序列里的，序列具有对应的两种功能)和大鼠Ang-(1-7)编码序列(5'GACCGGGTGTACATACACCCC3')，并将上述序列克隆至pUC57(深圳百恩维生物科技有限公司)得到模板质粒pUC57-HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)；然后使用Amp⁺的pAAV-MCS载体质粒(深圳百恩维生物科技有限公司)与模板质粒pUC57-HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)进行MluI和BamHI双酶切，回收的pAAV-MCS载体质粒大片段与含有Ang-(1-7)的重组目的基因(HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)，其中的Tie2代表Tie2启动子，FC代表SPFc)进行连接、转化和摇菌过夜，筛选细菌阳性克隆，抽提细菌中质粒。在重组目的基因片段中Ang-(1-7)的表达受HRE和Tie2启动子的控制，同时利用信号肽及hIgG1Fc融合标记实现Ang-(1-7)在PMVECs中的分泌并在该标记位点切割下来，因此，重组质粒以上述重组目的基因HRE-Tie2-FC-Ang-(1-7)命名(简称HTS FCAng(1-7))。将不含Ang-(1-7)编码序列的重组质粒作为对照质粒，命名为HRE-Tie2-FC(简称HTSFC)，表达载体结构如图1所示。

重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC均用MluI及BamHI做双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳，分别得到562bp和541bp的目的基因条带(图2和图3)。分别回收质粒pAAV-MCS酶切大片段和重组目的基因，进行测序验证，结果与原始序列完全一样，重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC合成成功。

二、细胞实验

1.大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)和大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的原代培养和鉴定

根据改良组织块法培养原代PMVECs。具体步骤为：麻醉、处死大鼠(购自第四军医大学动物中心)，迅速取出肺组织，在超净工作台内取肺外边缘的肺组织块，预冷的无血清DMEM培养液漂洗肺组织块数次，剪成体积约1mm³的组织块均匀种植于培养瓶中。加入2ml左右的含20％FBS、90U/ml肝素钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养液，竖直放置培养瓶1h后翻瓶，让培养液慢慢浸没、覆盖组织块。继续培养24h后换液，吸掉血细胞。观察ECs形态，采用差速消化及差速贴壁法去除混杂细胞。待瓶底细胞基本单层汇合后进行传代。用Ⅷ因子免疫组化染色鉴定PMVECs。

采用组织块贴壁法培养原代PASMCs。具体步骤为：麻醉、处死大鼠，迅速取出肺组织，在超净工作台内迅速分离出肺动脉主干及二、三级肺内动脉，用预冷的无血清DMEM培养液漂洗，剥离血管外膜，破坏血管内膜，剪成1mm³大小的组织块均匀种植于培养瓶中。加入2ml含15％胎牛血清DMEM培养液，竖直放置培养瓶2-4h后翻瓶，让培养液慢慢浸没、覆盖住组织块。继续培养24h后换液，同时显微镜下观察PASMCs的生长状况。大约7-10d左右可观察到有细长梭形的PASMCs从组织块周围爬出。待PASMCs长至80％融合时传代，免疫组化法检测PASMCs中抗α-SM-actin的表达，进行PASMCs鉴定。

2.常氧(21％O₂)条件下瞬时转染不同类型细胞检测细胞上清中Ang-(1-7)的含量

分别将50μl含有重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC的菌液加入到含有Amp⁺LB培养基的无菌锥形瓶中，250rpm、37℃摇床过夜培养，测定OD600值约0.4-0.6。根据试剂盒说明书提取质粒，测OD值，定量，并保存于-20℃待用。

复苏A549、293和NIH-3T3细胞(购自美国ATCC公司)，用含有10％FBS的DMEM培养液进行培养。使用2-3代的PASMCs、PMVECs、A549、293和NIH-3T3细胞。按10⁵/ml浓度接种入6孔板内继续培养。待细胞长至80％进行转染。每种细胞分别转染(transduce)重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC(具体过程：质粒4μg、8μl Lipofectamine^TM 2000转染试剂和5ml无血清培养基充分混合，加入6孔板中)，并且做3个复孔。转染过程严格按照Invitrogen公司Lipofectamine^TM 2000转染试剂说明书进行操作。转染12h后收取细胞上清，使用ELISA法检测不同类型细胞的上清液中Ang-(1-7)的含量，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，计算待测细胞的上清液中Ang-(1-7)浓度。

以上实验的结果为：常氧条件下(21％O₂浓度)A549细胞、293细胞、肺动脉微血管内皮细胞(PMVECs)和肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的细胞上清中均含有表达的Ang-(1-7)，而在成纤维细胞(NIH-3T3)的细胞上清中Ang-(1-7)的含量较少。上述四种细胞在常氧条件下(21％O₂浓度)转染重组质粒HTSFCAng(1-7)后，细胞上清中Ang-(1-7)的含量在A549、293、NIH-3T3和PASMCs细胞中增加不明显，但是在PMVECs中显著增加(图4)。而转染对照质粒后对各类型细胞上清Ang-(1-7)的含量均无显著影响。实验结果说明重组质粒HTSFCAng(1-7)只在转染后的PMVECs中特异性地高表达，具有细胞靶向性。

3.重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC分别转染PMVECs后，给予不同低氧(10％、5％和1％O₂)刺激后检测细胞上清中Ang-(1-7)的含量

选取第3-4代培养的PMVECs按10⁵/ml浓度接种入6孔板中，待细胞长至80％进行转染(具体过程：质粒4μg、8μl Lipofectamine^TM 2000转染试剂和5ml无血清培养基充分混合，加入6孔板中)，分别转染重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFC，并且做5个复孔。转染后立即将PMVECs放入三气培养孵箱，给予常氧(21％O₂)及不同浓度的低氧(10％、5％和1％O₂)刺激，继续培养24h。收取细胞上清，用ELISA法检测PMVECs上清中Ang-(1-7)的含量变化。

以上实验的结果为：未转染质粒的情况下PMVECs细胞上清中Ang-(1-7)的含量随着氧浓度的降低逐渐减少。分别转染重组质粒HTSFCAng(1-7)后，PMVECs上清中Ang-(1-7)的含量显著增加(图5)，并且Ang-(1-7)含量的增加率随着氧浓度的降低而升高(图6)。转染对照质粒后对PMVECs上清中Ang-(1-7)的含量无明显影响。因此重组质粒HTSFCAng(1-7)在细胞水平具有低氧可控性。

4.制备PMVECs低氧条件培养液，加入到PASMCs中观察常氧(21％O₂)及不同浓度的低氧(10％、5％和1％O₂)刺激后PASMCs的增殖变化

PMVECs按10⁵/ml浓度接种入6孔板中培养，待长至80％后进行转染(具体过程：质粒4μg、8μl Lipofectamine^TM 2000转染试剂和5ml无血清培养基充分混合，加入6孔板中)，转染重组质粒HTSFCAng(1-7)并且做5个复孔。转染后立即将PMVECs放入三气培养孵箱，给予10％的低氧刺激，继续培养24h后立即收取PMVECs上清，即为PMVECs低氧条件培养液。PMVECs低氧条件培养液现用现制备，不能冻存，以免Ang-(1-7)降解。对照质粒HTSFC转染PMVECs后同样给予10％的低氧刺激，继续培养24h后立即收取上清，即为对照条件培养液。

取生长状态良好的PASMCs，按5×10³个/孔均匀接种于96孔板内，加入含10％FBS的DMEM培养液。待细胞长满60％时，更换无血清DMEM培养液培养24h，使其同步化。将新制备好的含有重组质粒HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液或含有对照质粒HTSFC的对照条件培养液与含有10％FBS的DMEM培养液按不同比例混合后加入孔中，PMVECs低氧条件培养液或对照条件培养液的混合比例分为0％，25％，50％和75％：

①0％组：每孔加入200μL 10％FBS的DMEM培养液+0μL PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液；

②25％PMVECs低氧条件培养液组/对照条件培养液组：每孔加入150μL 10％FBS的DMEM培养液+50μL PMVECs低氧条件培养液或对照条件培养液；

③50％PMVECs低氧条件培养液组/对照条件培养液组：每孔加入100μL 10％FBS的DMEM培养液+100μL PMVECs低氧条件培养液或对照条件培养液；

④75％PMVECs低氧条件培养液组/对照条件培养液组：每孔加入50μL 10％FBS的DMEM培养液+150μL PMVECs低氧条件培养液或对照条件培养液；

再将含有PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液的PASMCs置于不同氧浓度(21％、10％、5％和1％O₂)下继续培养，每个氧浓度做5个复孔。加入MTT(5mg/mL)继续孵育4h，然后每孔加入150μl的DMSO溶液，震荡5min，于全自动酶标仪上490nm波长处测定各孔的吸光度OD值，每孔取3次测量结果，计算平均值。

以上实验的结果为：肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)在常氧(21％O₂)及不同浓度的低氧刺激下(10％、5％和1％O₂)培养48小时后，PASMCs随着氧浓度的降低出现不同程度的增殖，提示低氧诱导PASMCs增殖(图7A)。PMVECs转染重组质粒HTSFCAng(1-7)，给予10％氧浓度的低氧刺激24h后，收集的PMVECs细胞上清即为PMVECs低氧条件培养液。将新鲜的PMVECs低氧条件培养液立即加到PASMCs中，接着在不同浓度的低氧条件下(常氧21％、10％、5％和1％O₂)继续培养48小时后检测PASMCs的增殖变化。含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对常氧(21％O₂)条件下培养的PASMCs增殖无明显影响(图7B)。但是在不同浓度的低氧条件下(10％、5％和1％O₂)，含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液对低氧诱导的PASMCs增殖有明显的抑制作用(图7C)，并且其抑制作用呈剂量依赖性，按照25％比例加入的PMVECs低氧条件培养液就能够显著抑制低氧诱导的PASMCs增殖(图7D)。PMVECs转染对照质粒HTSFC，给予10％氧浓度的低氧刺激24h后，收集的PMVECs细胞上清即为对照条件培养液。对照条件培养液无上述抑制PASMCs增殖的作用。

以上细胞实验结果说明重组质粒HTSFCAng(1-7)能够只在PMVECs中使Ang-(1-7)的表达量按照低氧的程度增高，而且含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液以剂量依赖性的方式减少PASMCs增殖，具有细胞水平的靶向性、低氧可控性和有效性。

二、离体血管环实验

1.制备PMVECs的低氧条件培养液

使用状态良好的3-4代的PMVECs，按10⁶/ml浓度接种入25cm²的一次性无菌塑料培养瓶内(每瓶PMVECs的总液体量为5ml)继续培养。待细胞长至80％时，转染重组质粒HTSFCAng(1-7)，转染后给予PMVECs 10％的低氧刺激，培养24h后立即收取5ml的PMVECs细胞上清，即PMVECs低氧条件培养液。PMVECs低氧条件培养液现用现制备，不能冻存，以免Ang-(1-7)降解。对照质粒HRE-TIE2-FC转染PMVECs后同样给予10％的低氧刺激，继续培养24h后立即收取上清，即对照条件培养液。

2.制备三级大鼠离体肺动脉环

分离大鼠肺动脉，具体步骤为：麻醉大鼠，腹主动脉放血处死大鼠，立即剖开胸骨，迅速将气管连同心、肺组织一起取出，置于含有预冷饱和的Kreb’s液(液体中持续通入含95％O₂+5％CO₂混合气)的烧杯中，漂净血液，解剖显微镜下，沿着肺动脉主干向肺内方向分离肺动脉血管，取下肺动脉第三级血管(直径约1-1.5mm)，截成长约3mm左右的血管环，置于预冷饱和的Kreb’s液中备用。向血管环管腔内***2根金属细丝来回刮擦以去除血管内皮，制备得到无内皮的大鼠三级肺小动脉环。

检测分离的小动脉环活性，具体步骤为：解剖显微镜下，向血管环管腔内***2根金属细丝，然后将血管环悬挂在含有Kreb’s液(5ml)的37℃恒温浴槽中，持续通以95％O₂+5％CO₂的混和气体，以维持浴槽内常氧状态。悬挂血管环的挂钩另一端经张力换能器与Power Lab生物信号采集系统连接，记录血管环张力变化情况。精细天平测量血管环的重量，来设置血管环的基础张力。基于预实验结果和血管环的重量，将基础张力设为750mg。离体肺血管环在Kreb’s中平衡1h，每15min换液1次。用1μmol/L的苯肾上腺素(Phenylephrine,PE)预收缩血管环观察张力变化。PE预收缩后血管张力上升幅度小于300mg的血管环活性不足，弃用。

3.离体肺动脉血管环的低氧刺激

待血管活性检测完毕后，选择血管活性好的去内皮血管环，继续在Kreb’s中平衡血管环1h，每15min换液1次。然后在5ml的浴槽中加入1μmol/L PE预收缩血管环，当血管环张力上升到平台期后，立即将浴槽中的气体换为95％N₂+5％CO₂的气体，造成低氧环境约2h，记录血管环在低氧条件下的张力变化。

以上实验的结果为：肺小动脉环在低氧和苯肾上腺素(PE，1μmol/L)的作用下出现双相收缩(图8A)，即低氧诱导肺小动脉环先出现一个起始瞬时收缩，继而出现短暂舒张(Maximum vasodilation)，最后为延迟的持续收缩(Phase II vasoconstriction)。

4.PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液对低氧诱导的肺小动脉血管环的作用

分别向浴槽内加入新鲜制备的PMVECs低氧条件培养液3.5ml和Kreb’s液1.5ml，或对照条件培养液3.5ml和Kreb’s液1.5ml，预孵育20min，1μmol/L PE预收缩血管环，血管环张力上升到平台期后，立即改通95％N₂+5％CO₂的气体约2h，记录血管环在PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液和低氧条件的下张力变化。

以上实验的结果为：将新鲜的含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液立即加到血管浴槽中预孵育肺小动脉环20分钟，然后再给予低氧和1μmol/L PE刺激的情况下，在观察期内可见低氧诱导的肺小动脉环最早出现的起始瞬时收缩消失，最大舒张(Maximumvasodilation)幅度显著增加，而延迟的持续收缩(Phase II vasoconstriction)幅度则显著减少，血管被逆转为舒张，出现二相舒张(Phase II vasodilation)，提示血管环被舒张，收缩性减弱(图8B、F、G)。含有HTSFC的PMVECs对照条件培养液无上述作用。

5.A-779和PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液对低氧诱导的肺小动脉血管环的作用

分别加入Mas受体拮抗剂A-779(1μmol/L)、新鲜制备的PMVECs低氧条件培养液3.5ml和Kreb’s液1.5ml，或A-779(1μmol/L)、对照条件培养液3.5ml和Kreb’s液1.5ml，共同预孵育20min，1μmol/L PE预收缩血管环，血管环张力上升到平台期后，立即改通95％N₂+5％CO₂的气体约2h，记录血管环在A-779、PMVECs低氧条件培养液/对照条件培养液和低氧条件的下张力变化。

以上实验的结果为：在同时预孵育A-779和PMVECs低氧条件培养液，再经1μmol/LPE预收缩血管环和低氧刺激的情况下，在观察期内可见低氧诱导的肺小动脉环起始瞬时收缩消失，最大舒张(Maximum vasodilation)幅度虽然有所增加，但是与不加A-779时相比，舒张幅度还是相对减少的；接着血管环会出现持久的收缩(Phase II vasoconstriction)，与不加A-779时相比，收缩幅度显著增加；二相舒张(Phase II vasodilation)消失，因此血管环表现为舒张性减弱，收缩性增强(图8C、F、G)。含有HTSFC的PMVECs对照条件培养液无上述作用(图8D、E、F、G)。

以上离体血管环实验(分别检测肺小动脉环在低氧、加入含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液以及加入Mas受体拮抗剂A-779(1μmol/L)等条件下的张力变化)的实验结果说明新鲜的含有HTSFCAng(1-7)的PMVECs低氧条件培养液能够减轻肺小动脉环受低氧影响而产生的收缩反应，抑氧制低性肺小动脉收缩，舒张肺小动脉环，该作用能被Mas受体阻断剂A-779阻断。

三、在体动物实验

1.腺相关病毒AAV-HRE-TIE2-FC-Ang-(1-7)构建、收集和病毒滴度测定

复苏冻存的293AAV细胞(深圳百恩维生物科技有限公司)，用10％FBS的DMEM培养液培养，接种于10cm培养皿中，调整293AAV细胞数，约1～5×10⁶左右，继续培养使细胞长达80％融合以上。转染前2h细胞换液，然后按深圳百恩维公司的HET转染试剂盒说明书进行质粒DNA转染293AAV细胞，将转染后的293AAV细胞继续培养4-6h后换液。转染12-18h后，用移液器吸掉培养皿中的培养液，加入新鲜的含1％双抗的完全培养液10ml继续培养。培养48h后收集细胞混合液放入离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融3次，3000rpm离心10min，收集上清，浓缩和纯化，于-80℃保存。

设计Real time PCR引物：

hGHpolyA Forward：5'-CAAGCGATTCTCCTGCCTCA-3'

hGHpolyA Reverse：5'-ACGCCTGTAATCCCAGCAAT-3'

根据实验要求，各取待检测的AAV-HTSFCAng(1-7)和AAV-HTSF浓缩病毒液20ul，分别做10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷稀释，然后构建Realtime PCR反应体系，进行PCR反应，根据测定到的Ct值，计算AAV样品中的拷贝数。

2.腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)/AAV-HTSFC鉴定

病毒基因组DNA的提取：293细胞培养至80％以上融合，分别加入AAV-HTSFCAng(1-7)或者AAV-HTSFC病毒的冻存液各200μl继续培养36h。当细胞变圆但尚未漂起时，用移液器吸出培养液并用PBS漂洗细胞一次。给每瓶分别加入800μl细胞裂解液(含有0.6％SDS，10mMEDTA和100μg/ml蛋白酶K)，在56℃孵育1h，接着每瓶细胞分别加入200μl 5M NaCl，充分混匀，放置于冰上冰浴1h，然后收集细胞在4℃，12000rpm条件下离心10min。吸取上清，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液(按25:24:1的比例混合)，12000rpm离心15min，收集上清，并且加入1/9体积的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇，在-20℃放置30min。然后12000rpm离心15min，弃上清，真空抽干水份。再加入1ml 70％乙醇重悬，10000rpm离心10min，弃上清。将EP管放置于室温10min，以晾干水份，然后再加入去离子水40ul溶解提取好的DNA，放在-20℃保存。

PCR鉴定：构建PCR反应体系，进行PCR反应，分别取5mL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检查PCR结果。

根据以上实验，重组质粒HTSFCAng(1-7)和对照质粒HTSFCAng(1-7)分别转染293AAV细胞，收集细胞混合液，离心，包装成腺相关病毒并测定病毒滴度。提取病毒基因组DNA进行Real-time PCR，分别取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，进行病毒鉴定。PCR产物鉴定结果如图9所示，腺相关病毒滴度如表1所示。结果显示病毒包装成功，病毒滴度较好，可以用于动物体内。

表1.AAV病毒的滴度

3.复制大鼠低氧性肺动脉高压模型、实验分组及各项指标检测

SD大鼠随机分为4组，每组8只：

①常氧组(Normoxia)：大鼠置于常氧环境中28d。

②低氧组(Hypoxia)：大鼠每天置于氧浓度为10％的低压低氧舱内8h，连续28d，复制大鼠低氧性肺动脉高压模型。

③低氧+AAV-HTSFCAng(1-7)组：大鼠每天置于氧浓度为10％的低压低氧舱内8h，第15d以滴鼻方式一次性滴入腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)，继续低压低氧至28d。

④低氧+AAV-HTSFC组：大鼠每天置于氧浓度为10％的低压低氧舱内8h，第15d以滴鼻方式一次性滴入腺相关病毒AAV-HTSFC，继续低压低氧至28d。

大鼠滴鼻时，麻醉后仰卧位固定，将头部抬高，用移液器吸取特定量的重组腺相关病毒，慢慢滴入大鼠鼻孔中，滴鼻时要保证嘴巴关闭，保证液体吸入。每只大鼠的病毒量约为3×10¹¹μg/ml。滴鼻后待大鼠自然醒来，观察大鼠状态，状态良好者继续低氧处理。

常氧组大鼠置于动物室中，自然条件下饲养(西安地区大气压约为718mm Hg，pO₂为150.6mmHg，氧浓度约为21％)；低氧组大鼠放置于低压低氧舱中(舱内压力为380mm Hg，pO₂减至79.6mmHg，相当于海拔5540米的氧含量，氧浓度降低约为10％)每天8d，连续28天；低压低氧舱中用碱石灰和干燥剂除臭，吸收CO₂。待28d后检测各组大鼠肺动脉高压相关指标。

血流动力学指标检测：麻醉、固定大鼠，做颈部正中做切口，分离、结扎左侧颈总动脉和右侧颈外静脉的远心端，夹闭血管的近心端，在二者之间用眼科剪剪开一个小口，将管内充满0.5％肝素溶液的聚乙烯导管分别***左侧颈总动脉和右侧颈外静脉中，导管的一端留在血管内并且打结、固定，而另一端与压力换能器连接，记录大鼠的平均左颈总动脉压(mCAP)和右心室收缩压峰值(RVSP)。

右心室肥厚指数RV/(LV+S)×100％的测量：剪开大鼠胸骨，暴露心脏；去除心脏周围的组织和血管，以及左、右心房、心耳等，找到肺动脉圆锥，沿着肺动脉圆锥向下剪开右心室(RV)并称重。剩余的组织也称重，即为左心室和室间隔(LV+S)的重量。根据测量值来计算右心室肥厚指数[RV/(LV+S)×100％]，以反映右心室肥厚的程度。

ELISA法检测Ang-(1-7)的含量：剩余心脏、肺组织，连同肝、肺、肾等组织标本，每种组织在统一部位剪取一小块组织，准确称量100mg组织，放入EP管中，并加入1ml生理盐水，用手持匀浆器研磨，制备组织匀浆。然后EP管在4℃条件下4500rpm离心10min，吸取上清。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测心、肝、肺和肾等组织匀浆中Ang-(1-7)的含量。

肺组织石蜡切片制作及HE染色：沿肺门横断取材，剪取大鼠右肺上叶大约1cm×2cm的组织块，置于包埋框中，连同包埋框一起放入10％中性甲醛缓冲液中固定24h后，取出包埋框放于70％乙醇溶液中。然后脱水、包埋，并制成石蜡块。石蜡块切片，脱蜡至水后进做行HE染色，检测肺小动脉的变化。

肺组织切片图像分析：显微镜下观察HE染色切片，挑选外径为小于50-100μm的肺小动脉，用图像分析软件进行血管图像的采集和分析并且分别测量血管的内、外径、管壁厚度和血管面积，然后根据测量值分别计算反映血管管壁增厚的二个指标，即WT％(管壁厚度/外径×100％)和WA％(管壁面积/血管总面积×100％)。

以上实验的结果为：在复制4周的低氧性肺动脉高压大鼠模型，并在第2周时将腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)或者对照病毒AAV-HTSFC以滴鼻方式一次性作用于大鼠，然后持续低氧到第4周后，结果显示，4周低氧使得大鼠右心室收缩压峰值(RVSP)显著增高(图10B)，反映右心肥厚指标[RV/(LV+S)]％明显增加(图10C)，并且低氧4周大鼠的肺小动脉平滑肌层增厚，管腔明显狭窄(图10D)，代表肺小动脉增厚的指标WA％、WT％均有明显的增加(图10E、F)。给予腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)大鼠的RVSP、[RV/(LV+S)]％、WA％和WT％显著降低(图10B、C、E、F)，而且肺小血管形态发生明显改变，小动脉肌层略增厚，管腔狭窄不明显(图10D)。这部分实验充分说明了腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)对低氧性肺动脉高压大鼠起到了明显的治疗作用，降低右心室压，减轻右心室肥厚程度，抑制肺小血管的结构改变，并且腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)对大鼠的平均左颈总动脉压(mean carotidarterial pressure，mCAP)无明显影响(图10A)。给予对照病毒AAV-HTSFC的大鼠无上述表现。

此外，通过ELISA法检测大鼠心、肝、肺、肾等组织中Ang-(1-7)的含量，结果表明4周低氧可以降低肺组织的Ang-(1-7)的含量，给予腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)后，Ang-(1-7)的含量仅在肺组织中显著升高，在其他组织中变化不明显(图11)，提示腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)进入大鼠体内后使得Ang-(1-7)只在肺组织表达增多，具有一定的组织特异性。给予对照病毒AAV-HTSFC的大鼠无上述表现。

以上在体动物实验的结果表明，腺相关病毒AAV-HTSFCAng(1-7)在动物水平上改善低氧性肺动脉高压的进展。

总之，本发明利用基因重组技术，结合Ang-(1-7)具有舒血管、抗增殖的特点，Tie2基因的表达具有血管内皮细胞的特异性、低氧反应元件(HRE)受HIF-1α调控(低氧时低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达增加与氧分压降低相关，并且低氧时HIF-1α表达只在肺血管增加，而在体循环增加较少)等特点，构建HRE增强的Tie2启动子驱动的Ang-(1-7)表达载体，使Ang-(1-7)在低氧的肺动脉内皮细胞中高表达，通过旁分泌作用，进而调控肺动脉平滑肌细胞，实现低氧可控性、靶向性地抑制肺动脉的收缩和逆转肺动脉的结构重建，为防治低氧性肺动脉高压提供新手段和新策略，同时也为糖尿病坏疽、深静脉血栓、缺血性心脏病等与低氧或/和缺血相关的一系列疾病的防治提供思路和策略。

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 可控性上调Ang-(1-7)靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体

<160> 5

<210>1

<211>39

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

gactccacag tgcatacgtg ggcttccaca ggtcgtctc 39

<210>2

<211>57

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcc 57

<210>3

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

gaccgggtgt acatacaccc c 21

<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

caagcgattc tcctgcctca 20

<210>5

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 5

acgcctgtaa tcccagcaat 20