具体实施方式

本文公开了检测AAV载体转导的增强子和抑制剂的方法，以及用于检测和/或量化抑制、降低或减少AAV载体细胞转导的AAV结合抗体(也称为中和抗体(NAb))的方法。根据本发明的方法部分依赖于用报道载体(携带报道转基因的AAV颗粒)转导AAV允许细胞系。根据本发明的方法还部分地依赖于使用空衣壳AAV颗粒来吸收来自受试者的样品中的大部分或所有AAV结合抗体，从而揭示在分析AAV NAb的样品中存在AAV载体细胞转导的增强子或抑制剂(如果有的话)。根据本发明的方法尤其可以用于更准确地确定来自受试者的样品中的AAV NAb滴度，其中增强剂或抑制剂的存在可分别导致假阴性和假阳性。

在某些实施方案中，优化了根据本发明的测定方法中的某些步骤。在某些实施方案中，测定完成的时间减少。在某些实施方案中，减少了测定变异性和/或减少了基质干扰。特别地，例如，与常规NAb测定(Meliani et al.、2015、Human Gene Therapy Methods、26:45-53、doi:10.1089/hgtb.2015.037)相比，根据本发明的测定方法可以在大约2天而不是3天执行，通过三次重复测量的变异系数(％CV)评估的测定内变异从30.5％减少到8.7％，并且对于质量控制样品，测定的测定间精密度评估显示了％CV为12.5％。

根据本发明的方法提供了一种简化的、可靠的和更准确的测定法，其能用于检测或量化在各种情况下抑制、降低或减少AAV载体细胞转导的AAV结合抗体(AAV中和抗体(NAbs))。例如，在某些实施方案中，该测定法可用于分析、检测或定量AAV NAb以支持为基因疗法治疗选择受试者或从基因疗法治疗中排除受试者。在某些实施方案中，该测定法可用于分析、检测或定量AAV NAb，以选择受试者或将受试者排除在基因治疗试验之外。在某些实施方案中，该测定可用于分析、检测或定量AAV NAb，以监测受试者在接受基因疗法治疗后抗AAV抗体的发展。在某些实施方案中，该测定法可用于分析、检测或定量AAV NAb，以监测可能需要治疗或已经接受治疗以减少AAV NAb的量的受试者中的AAV NAb。

在某些实施方案中，提供了一种用于分析、检测或量化抑制、降低或减少来自受试者的生物样品中的AAV载体细胞转导的AAV结合抗体的方法。

在某些实施方案中，提供了一种用于分析、检测或量化抑制、降低或减少来自受试者的生物样品中的AAV载体细胞转导的AAV中和抗体的方法。

腺相关病毒(AAV)载体是尤其感染灵长类动物(例如人)的病毒载体。

如本文所用且不限于此，作为载体的修饰语(诸如重组AAV(rAAV)载体)以及序列的修饰语(诸如重组多核苷酸及多肽)的术语“重组”意指组合物已以一般不存在于自然界中的方式被操控(即，经工程改造)。重组AAV载体的特定实施例将是：其中将通常在野生型AAV基因组(异源多核苷酸)中不存在的核酸插入病毒基因组内。其实施例将是：其中将编码报道转基因的核酸(例如，基因)克隆至载体中。虽然参考AAV载体以及诸如转基因之类的序列时，本文中并未始终使用术语“重组”，但尽管有任何此类省略，包括AAV载体、多核苷酸等的重组形式也明确地包括在内。

例如，“rAAV载体”通过使用分子方法以去除野生型AAV基因组的全部或一部分且经诸如编码报道蛋白之类的报道转基因的非天然(异源)核酸置换而衍生自野生型AAV基因组。通常，针对rAAV载体，保留AAV基因组的一种或两种反向末端重复(ITR)序列。因为相对于AAV基因组核酸，AAV基因组的全部或一部分已经非天然序列置换，诸如经编码报道蛋白的报道转基因置换，所以rAAV区别于AAV基因组。因此，掺入非天然(异源)序列将AAV定义为“重组”AAV载体，其可称为“rAAV载体”。

重组AAV载体序列可包装，在本文中称为“颗粒”，以用于离体、活体外或活体内细胞的后续感染(转导)。在重组载体序列衣壳化或包装至AAV颗粒中的情况下，颗粒也可称为“rAAV”、“rAAV颗粒”和/或“rAAV病毒粒子”。这种rAAV、rAAV颗粒及rAAV病毒粒子包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白。在AAV的情况下，特定实施例包括衣壳蛋白。

如本文所用，“感染性重组AAV颗粒”是指可离体、体外或体内感染或转导细胞的包装的重组AAV载体序列。如本文所用，“能被感染的细胞”是指接受感染性重组AAV颗粒的感染或转导的细胞。在某些实施方案中，本发明的方法使用能在体外被感染性rAAV颗粒感染的细胞。

可以被缩写为“vg”的“载体基因组”是指最终经包装或衣壳化以形成rAAV颗粒的重组质粒序列的部分。在重组质粒用于构建或制造重组AAV载体的情况下，AAV载体基因组不包括不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”的部分。重组质粒的该非载体基因组部分称为对于质粒的克隆及扩增至关重要的“质粒主链”，其为繁殖及重组AAV载体产生所需的过程，但自身不包装或衣壳化至rAAV颗粒中。因此，“载体基因组”是指由rAAV包装或衣壳化的核酸

空衣壳AAV颗粒(EV)或空载体(EV)是指缺乏载体基因组的AAV颗粒。空衣壳AAV颗粒可用于吸收(结合)AAV结合抗体，以分析或检测AAV载体细胞转导的增强子或AAV载体细胞转导的抑制剂的存在。空衣壳AAV颗粒也可用于以相对低的滴度(例如，小于约1:5)量化AAV NAb滴度。

如本文中所使用，关于AAV载体的术语“血清型”是指在在血清学上不同于其他AAV血清型的衣壳。血清区别性是基于与另一AAV相比，抗体与一种AAV之间缺乏交叉反应性来确定的。交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如归因于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。由于衣壳蛋白序列或相似或相同的构象表位的同源性，针对一种AAV衣壳血清型的抗体可能与一种或多种其他AAV衣壳血清型发生交叉反应。

在传统定义下，血清型是指目标病毒已经针对所有现有和特征性血清型的血清进行中和活性测试，并且未发现能中和目标病毒的抗体。由于更多天然存在的病毒分离株被发现和/或衣壳突变体的产生，因此与任何目前存在的血清型可能存在血清学差异，也可能没有血清学差异。因此，在新病毒(例如，AAV)没有血清学差异的情况下，该新病毒(例如，AAV)将是相应血清型的亚群或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以根据传统的血清型定义确定它们是否属于另一种血清型。因此，为方便起见和避免重复，术语“血清型”广义上既是指血清学上不同的病毒(例如AAV)，也是指可能在给定血清型的亚群或变体内的血清学上不同的病毒(例如AAV)。

rAAV载体和空衣壳AAV颗粒包括任何病毒株或血清型。例如，并且不限于，AAV载体基因组或颗粒(衣壳，诸如VP1、VP2和/或VP3)可基于任何AAV血清型，例如诸如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10、AA3B或AAV-2i8。这些载体和空衣壳AAV颗粒可基于相同病毒株或血清型(或亚群或变体)，或彼此不同。例如，并且不限于，基于一种血清型基因组的rAAV载体基因组或颗粒(衣壳)可与包装载体的衣壳蛋白中的一或多者一致。另外，rAAV载体基因组可基于不同于包装载体基因组的衣壳蛋白中的一或多者的AAV血清型基因组，在此情况下三种衣壳蛋白中的至少一者可以是不同的AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)或其变体。更具体而言，rAAV2载体基因组可包含除来自不同血清型的衣壳外的AAV2 ITR，诸如例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ IDNO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)或其变体。因此，rAAV载体包括与特定血清型以及也称为“假型”的“混合”血清型的基因/蛋白序列特性相同的基因/蛋白序列。

在某些实施方案中，包含报道基因的AAV载体具有与空衣壳AAV颗粒的衣壳血清型相同的衣壳血清型。然而，只要空衣壳AAV颗粒能够吸收(结合)包含报道基因的AAV载体结合的抗体，例如由于交叉反应性，空衣壳AAV颗粒的衣壳血清型不需要是与包含报道基因的AAV载体的衣壳血清型相同的血清型。

在某些实施方案中，rAAV载体或空衣壳AAV颗粒包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3序列)至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的衣壳序列或由该衣壳序列组成。在某些实施方案中，rAAV载体包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、或-rh10ITR至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的序列或由该序列组成。

在某些实施方案中，rAAV载体或空衣壳AAV颗粒包括其AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B和AAV-2i8变体(例如，衣壳变体，例如在rAAV载体背景下的氨基酸插入、添加、取代和缺失以及ITR核苷酸插入、添加、取代和缺失)，例如，如WO 2013/158879(国际申请PCT/US 2013/037170)、WO 2015/013313(国际申请案PCT/US 2014/047670)和US 2013/0059732(美国申请No.13/594,773)中所阐述的。

rAAV和空衣壳AAV颗粒(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)和变体、杂合体及嵌合序列)可使用本领域技术人员已知的重组技术构建成包括在5'和/或3'末端侧接有一或多个功能性AAV ITR序列的一或多个异源多核苷酸序列(转基因)。根据急救、复制以及将重组载体包装至rAAV载体颗粒中的需要，rAAV载体通常保留至少一种功能性侧接ITR序列。因此，rAAV载体基因组将包括对于复制和包装而言顺式需要的序列(例如，功能性ITR序列)

在某些实施方案中，AAV载体用于用报道转基因转导靶细胞，该转基因随后被转录并任选地被翻译，从而提供可检测的信号以检测或定量转基因表达。信号量与细胞转导和随后表达的效率成正比。与包装或包裹报道转基因或抑制因子的载体蛋白结合的抗体将抑制、降低或减少载体细胞转导、随后的报道基因表达以及可检测信号的量。

在本文所述的测定法中，为了分析、检测和定量抗体，对包装或包裹报道转基因的特定衣壳蛋白血清型的选择可用于鉴定NAb结合的血清型。例如，如果需要检测AAV-2抗体，报道转基因可以被AAV-2衣壳蛋白包裹。如果需要检测AAV-8抗体，报道转基因可以被AAV-8衣壳蛋白包裹。如果需要检测AAV-9抗体，报道转基因可以被AAV-9衣壳蛋白包裹。如果存在抗体，则该抗体会与包裹报道转基因的衣壳蛋白结合，从而抑制、降低或减少载体细胞转导和随后的报道转基因表达。与包膜或衣壳蛋白结合的抗体的数量或滴度越大，细胞的载体转导和随之而来的报道转基因表达和信号越少。因此，本文用于分析、检测和定量结合载体蛋白(例如病毒(例如，AAV)衣壳蛋白)的抗体的方法也可用于鉴定结合任何特定AAV衣壳血清型的抗体的存在或不存在。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地使用以指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接mRNA、rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。

核酸包括天然存在、合成以及有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以是单链、双链或三链，线性或环状，且可具有任何长度。在论述核酸时，特定多核苷酸的序列或结构可在本文中根据在5’至3’方向上提供序列的惯例描述。

“异源”转基因或核酸是指为了将多核苷酸通过载体介导转移/递送至细胞中的目的而插入至载体(AAV)中的多核苷酸。异源转基因不同于载体(AAV)核酸，即相对于病毒(AAV)核酸序列而为非天然的。一旦转移/递送至细胞中，则可表达(例如，若适宜，转录及翻译)包含于病毒粒子内的异源转基因。尽管在本文中提及转基因或核酸并不总是使用术语“异源”，但即使在修饰语“异源”不存在的情况下，提及的转基因或核酸也意指包括异源转基因或核酸，尽管有省略也如此。

如本文所用，“报道”转基因是提供可检测信号的多核苷酸。可检测信号可由报道转基因本身、转基因的转录物或由报道转基因编码的蛋白提供。

明确包括所有哺乳动物和非哺乳动物形式的转基因，包括但不限于本文公开的报道转基因和编码的蛋白的示例，无论已知的还是未知的。因此，根据本发明的方法包括来自微生物和其他生物体的报道转基因和蛋白，在如本文所述的转导或转移之后，所述报道转基因和蛋白在细胞中是可检测的。

在某些实施方案中，报道转基因编码分泌的或可分泌的蛋白。在某些实施方案中，报道转基因编码提供酶促、比色、荧光、发光、化学发光或电化学信号的蛋白。

例如但不限于，报道转基因包括编码萤光素酶蛋白的萤光素酶基因，例如但不限于海肾萤光素酶、萤火虫萤光素酶或高斯萤光素酶基因。

例如但不限于，报道转基因可编码β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)和碱性磷酸酶。

由“转基因”编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括全长天然序列，如同天然存在的蛋白，以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要该子序列、修饰形式或变体保留了天然全长蛋白的某种程度的功能即可。在本发明中，由转基因编码的这些多肽、蛋白和肽可以但不要求与野生型蛋白相同。

在某些实施方案中，报道转基因(该转基因提供可检测的信号)可包含单链或自互补基因组。自互补转基因当包装成病毒颗粒(例如AAV载体)或在病毒载体细胞转导和病毒在转导细胞内脱壳时，变为双链或双链二聚体。

术语“互补的”或“互补”当用于指核酸，例如转基因时，是指多个化学碱基，使得通过碱基配对，一个单链序列确实或能够“特异性杂交”或结合(退火)到另一个单链序列以形成双链或双链分子。两条单链序列彼此特异性杂交或结合(退火)并形成双链(或双链体)分子的能力是依靠一条链(例如，有义)上的碱基的官能团，其将与相反核酸链(例如，反义)上的另一个碱基形成氢键。能够相互结合的互补碱基通常在DNA中，是A与T，以及C与G，而在RNA中，是C与G，以及U与A。因此，自互补序列的一个示例可以是ATCGXXXCGAT，X代表非互补碱基，这样带有未杂交的X碱基的双链或双链体的结构表现为：

因此术语“互补的”和“互补”当用于指多核苷酸或核酸，例如转基因时旨在描述双链或双链体多核苷酸或核酸分子形成的物理状态，或简单地描述两个多核苷酸或核酸分子之间的序列关系，使得每个单链分子可以与另一个形成双链。因此，“互补的”和“互补”是指每个多核苷酸或核酸分子链的碱基关系，而不是指两条链必须相互以双链(或双链体)构型或物理状态存在于双链体中。

通常，对于包装单链核酸的病毒载体，例如AAV，反向末端重复(ITR)序列参与复制并形成发夹环，这有助于自引发，从而使得第二DNA链能起始和合成。在合成第二条DNA链后，AAV ITR具有所谓的末端解析位点(TRS)，这样发夹环被切割成两条单链，每条链都有5'和3'末端重复序列，以用于病毒包装。

在至少一个ITR中使用缺失的、突变的、修饰的或无功能的TRS导致形成在TRS处不被切割的双链双链体。对于自互补的报道转基因双链双链体结构，通常具有ITR，其中在两条互补链之间有缺失、突变或变异的TRS。不可切割或不可解析的TRS使得自互补报道转基因双链双链体结构能形成，因为双链形式未被切割。或者具有确失、突变或变异的TRS的不可解析ITR，或者可解析ITR可能适用于病毒包装。可解析的AAV ITR不需要是野生型ITR序列，只要ITR介导所需的功能(例如包装、自引发、复制等)即可。

可缺失、突变、修饰或改变的各种AAV血清型的ITR和TRS序列包括本文所述的或本领域技术人员已知的任何AAV血清型。例如但不限于，各种AAV血清型的ITR和TRS序列包括AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-rh74、-rh10。另一示例是不被AAV Rep蛋白加工的修饰或变异的AAV ITR。另一示例是具有缺失的D序列和/或突变、修饰或变异的末端解析位点(TRS)序列的突变、修饰或变异的AAV ITR。对于AAV2，代表性的突变TRS序列是：“CGGTTG”。

对于位于外侧的自互补报道转基因序列，例如一个或多个ITR、表达调控序列、下游序列等，报道转基因外侧的载体序列中的此类序列可以但不必是自互补的。因此，自互补可用于特定上下文，例如，用于指转基因，例如报道转基因，使得只有转基因(例如报道转基因)是自互补的，而其他非转基因序列可以但不必是自互补的。

为了自互补，并非单链中的所有碱基都必须与相对互补链的每个碱基互补。仅需要足够数量的互补核苷酸或核苷碱基以使两个多核苷酸或核酸分子能够彼此特异性杂交或结合(退火)。因此，自互补多核苷酸或核酸分子之间会存在非互补碱基的短序列区段或区域。例如但不限于，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100或100-150或更多个连续或非连续的非互补碱基可能存在，但在两个序列的长度上会存在足够的互补碱基，使得两个多核苷酸或核酸分子能够彼此特异性杂交或结合(退火)并形成双链(或双工)序列。因此，两个单链区域的序列可以小于100％彼此互补，但仍然能够形成双链双链分子。在某些实施方案中，两条单链序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多相互互补性。

自互补多核苷酸或核酸分子之间的非互补碱基的此类区段或区域可以是内部序列，使得当两个单链分子的互补部分形成双链或双链体时，非互补碱基形成环状或凸起结构，整体结构类似发夹。自互补多核苷酸或核酸分子之间的非互补碱基的此类区段或区域也可以位于互补区域的侧翼，在这种情况下，5'或3侧翼区域中的一者或两者可能不形成双链双链体。

在具有转基因的细胞中，转基因已经通过载体例如病毒载体(例如AAV)被引入/转移。该过程称为细胞的“转导”或“转染”。术语“转导”和“转染”是指将分子(例如转基因)导入细胞。

已导入了转基因的细胞被称为“转导或转染的”细胞。因此，“转导的”或“转染的”细胞是指在将外源分子例如多核苷酸(例如，包含转基因的AAV载体)掺入细胞后细胞中的变化。因此，例如，“转导的”或“转染的”细胞是其中已引入外源分子的细胞或其后代。可以繁殖细胞并且转录引入的转基因和/或表达蛋白。

可以是带有转基因的载体(例如，病毒载体)转导的靶标的细胞可以是对感染敏感或可以被该载体感染的任何细胞。这种细胞包括哺乳动物细胞。这些细胞可能对感染具有低、中或高的易感性。因此，靶细胞包括任何组织或器官类型的、任何来源(例如，中胚层、外胚层或内胚层)的细胞。可以被感染并且可以用于根据本发明的方法中的细胞的示例包括，例如但不限于，肝脏(例如肝细胞、肝窦内皮细胞)，胰腺(例如β胰岛细胞)，肺，中枢或周围神经系统，例如脑(例如神经、神经胶质或室管膜细胞)或脊柱、肾(HEK-293细胞)、眼睛(例如视网膜、细胞成分)、脾脏、皮肤、胸腺、睾丸、肺、隔膜、心脏(心脏的)、肌肉或腰大肌、或肠道(例如内分泌腺)、脂肪组织(白色、棕色或米色)、肌肉(例如成纤维细胞)、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、唾液腺细胞、内耳神经细胞或造血(例如，血液或淋巴)细胞。

在某些实施方案中，可以从冷冻细胞等分试样或从细胞库接种可以是用带有转基因的载体(例如，病毒载体)转导的靶标的细胞。在某些实施方案中，可以从培养的细胞中接种可以是带有转基因的载体(例如，病毒载体)转导的靶标的细胞。

可以作为带有转基因的载体(例如病毒载体)转导的靶标的细胞系的示例包括，例如但不限于，2V6.11、HEK-293、CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI cells、COS、BSC 1、BSC 40、BMT10、VERO、WI38、MRC5、A549、HT1080、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HER、HEK、HEL、和HeLa细胞。

在某些实施方案中，可以作为带有转基因的载体(例如，病毒载体)转导的靶标的细胞可以瞬时或稳定地表达来自腺病毒的E4基因。E4基因表达确保了AAV载体的有效细胞转导。

AAV载体和载体序列可以包括一个或多个“表达控制元件”或“表达调节元件”。通常，表达控制或调控元件是影响可操作连接的多核苷酸(例如转基因)表达的核酸序列。存在于载体中的控制元件(包括如本文所述的表达控制和调节元件，例如启动子和增强子)被包括以促进适当的转基因转录和(如果合适的话)翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持多核苷酸的正确阅读框以允许mRNA和终止密码子的框内翻译等)。这些元件通常以顺式起作用，但也可以反式起作用。

表达控制可以在转录、翻译、剪接、消息稳定性等水平上实现。通常，调节转录的表达控制元件并列在转录多核苷酸的5'末端附近(即，“上游”)。表达控制元件也可以位于转录序列的3'末端(即“下游”)或转录本内(例如内含子中)。表达控制元件可位于距转录序列一定距离处(例如，距多核苷酸100至500、500至1000、2000至5000、5000至10,000或更多个核苷酸)，甚至相当远的距离处。然而，由于多核苷酸长度的限制，因此对于AAV载体，此类表达控制元件通常在距多核苷酸1至1000个核苷酸的范围内。

在功能上，可操作地连接的转基因的表达至少部分地由元件控制，使得元件调节多核苷酸的转录，并且在适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的一个具体示例是启动子，它通常位于转录序列的5'末端。表达控制元件的另一示例是增强子，它可以位于转录序列的5'或3'末端，或位于转录序列内。

如本文所用，“启动子”可以指通常与转基因相邻的DNA序列。与不存在启动子时的表达量相比，启动子通常增加从转基因表达的量。

如本文所用，“增强子”可以指与转基因相邻的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也在DNA序列(例如，转基因)内起作用，并且可以位于DNA序列(例如，转基因)的下游或之内。因此，增强子元件可以位于转基因上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多碱基对处。增强子元件通常增加转基因的表达，其高于启动子元件提供的增加的表达。

可用于根据本发明的方法中的表达调控元件或表达控制元件的示例包括，例如但不限于，CAG(SEQ ID NO:3)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子/增强子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和延伸因子-1α(EF 1-α)启动子。

结合可用于基因治疗的重组病毒载体(例如rAAV载体)的抗体(其可称为“中和”抗体)可减少、抑制或减少病毒载体的细胞转导。结果，尽管不受理论束缚，细胞转导被降低、抑制或减少，从而减少了病毒包装的异源多核苷酸向细胞中的引入和随后的表达以及在适当情况下随后翻译成蛋白或肽。

可以在暴露于野生型病毒的受试者中产生针对野生型病毒的免疫应答，例如体液免疫。这种暴露可导致受试者体内预先存在的抗体与基于野生型病毒的病毒载体结合，甚至在使用该病毒载体的基因治疗方法治疗之前结合。替代地，在用重组病毒载体治疗后或暴露于野生型病毒后，可在受试者中产生抗体。

生物样品通常从生物有机体获得或由其产生。可以使用根据本发明的方法分析的来自受试者的生物样品的示例包括例如但不限于全血、血清、血浆等，以及它们的组合。可用于根据本发明的方法中的来自受试者的其他生物样品包括，例如但不限于，脑脊液或简单的脊髓液。生物样品可以不含细胞，或者可以包括细胞(例如，红细胞、血小板和/或淋巴细胞)。

可通过使用根据本发明的方法获得其用于分析的生物样品的合适受试者包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)，以及非人哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人类、非人类灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽(如鸡鸭)、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。合适的人类受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、少年和成人受试者。受试者还包括动物疾病模型，例如小鼠和其他动物模型，例如非人灵长类动物。

可以使用根据本发明的方法分析其生物样品的合适受试者(例如，人类)还包括，例如但不限于，具有功能丧失和功能获得性遗传疾病、病症和缺陷的那些受试者。因此，受试者(例如，人类)包括作为基因替代或补充疗法(例如蛋白/酶替代治疗)的候选者的受试者或正在接受该基因替代或补充疗法的受试者，以及作为基因敲低或敲除疗法的候选者的受试者(例如，人类)或正在接受基因敲低或敲除疗法的受试者(例如，人类)。

如本文所用，关于遗传缺陷的术语“功能丧失”是指基因中的任何突变，其中由该基因编码的蛋白(即，突变蛋白)表现出通常与野生型蛋白相关的功能的部分或完全丧失。这包括由蛋白表达或活性不足引起或导致的任何疾病、病症或缺陷。

如本文所用，关于遗传缺陷的术语“功能获得”是指基因中的任何突变，其中由该基因编码的蛋白(即，突变蛋白)获得通常与蛋白(即，野生型蛋白)不相关的功能导致或促成疾病或病症。功能获得性突变可以是基因中一个或多个核苷酸的缺失、添加或替换，其可以引起所编码蛋白的功能改变。功能获得性突变可以改变突变蛋白的功能或引起与其他蛋白的相互作用。功能获得性突变还可导致正常野生型蛋白的减少或去除，例如，通过改变的突变蛋白与正常野生型蛋白的相互作用。功能获得性突变可导致由不正常、异常或不合需要的蛋白的表达或活性引起或导致的病症或疾病。

可以使用根据本发明的方法分析其生物样品的合适的人类受试者包括，例如但不限于，患有可通过基因疗法治疗的遗传性疾病或遗传病症的受试者。基因疗法治疗或疗法包括载体(例如，病毒载体，例如AAV载体)介导的用于治疗疾病或病症的核酸递送。

可以使用根据本发明的方法分析其生物样品的合适的人类受试者还包括，例如但不限于，患有以下疾病的受试者：肺病(例如，囊肿性纤维化)、出血病症(例如，含或不含抑制剂的A型血友病或B型血友病)、地中海贫血、血液病症(例如，贫血)、阿尔兹海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)、癫痫症、溶酶体贮积病(例如，天冬氨酰糖尿症、巴顿病(Batten disease)、2型晚期婴儿型神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN2)、胱氨酸症、法布里病(Fabry disease)、I、II及III型高歇氏病(Gaucher disease)、II型肝糖贮积病、庞贝病(其由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA；催化糖原的降解)功能或表达的突变或缺失引起)、GM2-I型神经节苷脂贮积病(泰-萨克斯病(Tay Sachs disease))、GM2-II型神经节苷脂贮积病(山多夫氏病(Sandhoff disease))、I型黏脂贮积症(I和II型唾液腺病)、II型黏脂贮积症(I-细胞疾病)、III型黏脂贮积症(假贺勒病(pseudo-Hurlerdisease))以及IV型黏脂贮积症、黏多糖贮积病(贺勒病及变化形式、亨特(Hunter)、A、B、C、D型圣菲利波(Sanfilippo)、A和B型莫奎(Morquio)、马洛特-加龙省-拉米及斯利疾病(Maroteaux-Lamy and Slydisease))、A/B、C1及C2型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)、以及I和II型辛德勒病(Schindler disease))、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁积聚病症(例如，威尔森氏(Wilson’s)或门克斯(Menkes)病)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或传染性病毒(例如乙型和丙型肝炎、HIV等)、细菌或真菌疾病。可根据本发明的方法分析其生物样品的合适的人类受试者另外包括患有凝血障碍的受试者，例如但不限于患有以下疾病的受试者：血友病A、血友病B、缺乏任何凝血因子：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、血管性血友病因子或FV/FVIII联合缺乏症、地中海贫血症、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。

可以使用根据本发明的方法分析其生物样品的受试者还包括，例如但不限于，已经发展出针对出于治疗目的递送至受试者的蛋白的抑制性抗体的那些受试者，例如但不限于，分别施用GAA、因子VIII和因子IX的患有庞贝病、血友病A或血友病B的受试者可分别产生针对GAA、因子VIII和因子IX的抑制性抗体。因此，受试者包括不具有抑制性抗体的受试者以及具有针对蛋白的抑制性抗体的受试者。

可以根据本发明的方法分析其生物样品的合适的人类受试者此外包括患有感染或起源于中枢神经系统(CNS)的疾病或神经变性疾病的受试者，例如但不限于，阿尔茨海默病、亨廷顿病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、肯尼迪病、多聚谷氨酰胺重复疾病、帕金森病和多聚谷氨酰胺重复疾病，包括例如但不限于脊髓小脑性共济失调(例如，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、或SCA17)。

本发明提供了组合物，例如试剂盒，其包括包装材料和其中的一种或多种组分。试剂盒通常包括标签或包装插页，其中包括对组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用说明。试剂盒可包含此类组分的集合，例如重组载体(例如，rAAV)载体、空衣壳AAV颗粒和任选的一种或多种适用于实施本发明方法的试剂。

试剂盒是指容纳试剂盒的一种或多种组分的物理结构。包装材料可以保持组分无菌，并且可以由通常用于此类目的的材料制成(例如，纸、瓦楞纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。

标签或插页可包括其中一种或多种组分的识别信息、数量。标签或插页可以包括识别制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可以包括识别制造商信息、批号和日期的信息。标签或插页可以包括有关如何使用试剂盒组分的信息。标签或插页可包括在本发明的方法或用途中使用一种或多种试剂盒组分的说明。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料

本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献，GenBank引用和ATCC引用均通过引用整体并入本文。如有冲突，将以说明书(包括定义)为准。

本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征为等效或类似特征的类别的示例。

如本文使用的，单数形式的“一”，“一种(and)”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种核酸”包括多个这样的核酸，提及“一种载体”包括多个这样的载体，并且提及“一种病毒”或“颗粒”包括多种这样的病毒/颗粒。

如本文所用，术语“约”是指在基础参数相差在10％以内的值(即，正负10％)。例如，“约1:10”表示1.1:10.1或0.9:9.9，约5小时表示4.5小时或5.5小时等。值字符串开头的术语“约”将每个值按10％修改。

所有数值或数值范围均包括该范围内的整数以及该范围内该数值或整数的分数。因此，举例来说，提及95％或更多包括95％、96％、97％、98％、99％、100％等，以及95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、etc.、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％等等。因此，同样为了说明，提及数字范围，例如“1-4”包括1、2、3，以及1.1、1.2、1.3、1.4等，等等。例如，“1至4周”包括7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28天。

此外，提及数字范围，例如“0.01至10”包括0.011、0.012、0.013等，以及9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等，等等。例如，约“0.01至约10”的范围包括0.011、0.012、0.013、0.014、0.015等，以及9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等，等等。

提及多于(大于)或小于整数时分别包括大于或小于该参考数字的任何数字。因此，例如，提及多于2包括2.1、2.2、3、3.1、3.2、4、4.1、4.2、5、5.1、5.2等，等等。提及“两次或更多次”包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次。

进一步，提及数值范围，例如“1至90”包括1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，以及81、82、83、84、85等，等等。例如，“约1分钟至约90天之间”包括1.0分钟、1.1分钟、1.2分钟、1.3分钟、1.4分钟、1.5分钟等，以及1天、2天、3天、4天、5天…、81天、82天、83天、84天、85天等。

本文一般使用肯定性语言来公开本发明，以描述本发明的众多实施方案。本发明还具体包括其中全部或部分地排除特定主题的实施方案，特定主题为例如物质或材料，方法步骤和条件，设计方案或程序。例如，在本发明的某些实施方案中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明在本文中通常并未就本发明不包括的内容进行表述，但是本文中公开了未在本发明中明确排除的方面。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1

这是使用表达荧光素酶的AAV载体作为报道转基因来确定来自血清或血浆样品的抗AAV中和抗体(NAb)滴度的示例性基于细胞的体外测定法的描述。

本说明适用于测定来自人类临床试验受试者的血清和血浆和其他生物样品中的AAV NAb滴度，临床前或非临床研究，基因治疗治疗方法的人类候选者以及监测受试者的AAV NAb，所述受试者例如已接受基因疗法治疗的受试者或处于风险中或已发展为AAV NAb的受试者，并且其中需要在治疗之前和/或之后确定NAb的存在或数量，并任选地减少AAVNAb的数量。

使用的示例性2V6.11细胞系(Mohammadi、et al.Nucl.Acids Res.32:2652(2004))是基因修饰的人胚肾(HEK)293细胞系，其稳定表达来自腺病毒的E4基因。E4基因表达确保AAV载体的有效转导。其他细胞也适合使用。

血清样品用作潜在AAV NAb的来源，如果存在，其将降低2V6.11细胞的AAV报道载体转导并降低测量的荧光素酶活性。血清样品被稀释，例如但不限于，以一定范围的稀释度(例如1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:100和1:1000)制备并与报道载体混合，因此AAV NAb(如果存在)与AAV报道载体衣壳表面结合并发生中和作用。

一些人以及因此他们的血清(或其他生物样品)可能含有其他因子，这些因子不结合AAV衣壳，但可以正面影响(增加细胞转导)或负面影响(减少细胞转导)AAV载体细胞转导，其在本文中分别涉及增强子和抑制剂。因此，平行地，血清样品的连续稀释也与空衣壳AAV颗粒(EV)一起预孵育，然后添加AAV报道载体。

血清与空衣壳AAV颗粒(EV)的预孵育提供了一种分析低滴度(例如，小于或等于约1:5，或≤1:5)或阴性NAb样品是否存在增强子或抑制剂的方法，例如在施用AAV载体之前的受试者中进行。这使得能够识别由于抑制剂的存在而导致的假NAb阳性受试者和由于增强剂的存在而导致的假NAb阴性受试者。假NAb阳性受试者可以通过基于AAV载体的基因治疗方法进行治疗。根据NAb滴度，可以决定从基于AAV载体的基因治疗试验或方法中招募或排除假NAb阴性受试者。在AAV载体输注两周后从受试者身上采集的临床样品通常具有高NAb滴度(例如，大于或等于约1:5或≥1:5)并且使用空衣壳AAV颗粒(EV)对于在这些受试者中确定NAb滴度不是必需的。

质量控制(QC)也可用于验证测定法的完整性和/或准确性。例如，AAV NAb对照可以确认空衣壳AAV颗粒(EV)正在吸收/结合AAV NAb，以用于测定法以确定生物样品中任何增强剂或抑制剂的存在。这种质量控制在本文中被称为EV功效。

AAV NAb的来源可以通过来自一个或多个受试者的表达AAV NAb的一种或多种样品提供。通常，AAV NAb来自混合样品，以确保对照中存在AAV NAb。然而，任何形式的AAVNAb，例如在PBS溶液中，都可以作为本文公开的对照。

首先将2V6.11细胞用制备的AAV报道载体悬浮液转导到96孔板中，然后孵育过夜。荧光素酶活性由发光读板器读取。在对整个板进行背景(MIN)扣除后，将在三个复孔中运行的样品结果与阳性对照孔产生的最大(MAX)信号进行比较，该阳性对照孔含有仅用AAV报道载体转导的细胞而无血清。将荧光素酶活性被抑制约50％或更多时的血清样品稀释度报道为提供样品的受试者的AAV NAb滴度。

在示例性研究中，在登记用于治疗血友病A的I/II期基因疗法试验之前从89名人类受试者收集样品。该测定显示，在评估的89名受试者中，58名(65.2％)受试者的AAV NAb滴度<1:1，其被认为是阴性；16名(18％)受试者的滴度≥1:1但等于或低于1:10，而15名(16.8％)受试者的滴度>1:10。

实施例2

实施例3

材料和设备

细胞是2V6.11细胞系(Mohammadi、et al.Nucl.Acids Res.32:2652(2004))，它是稳定表达腺病毒E4基因的人胚肾(HEK)细胞系。生成主、工作和检测就绪细胞库。“细胞库”等分试样，1e7/mL，储存在液氮中。

试剂和储存条件AAV-80℃Renilla，Promega，Cat#E2820。-20℃FACT()，目录号H101-01，-20℃DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)，LifeTechnologies，货号11965-0844℃DPBS(Dulbecco)，LifeTechnologies，环境FBS，热灭活，经认证，美国原产，LifeTechnologiesCat#10082147-20℃青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)，Gibco，货号#10378-016-20℃Pluronic^TMF-68(100X，10％)，ThermoFisherScientific，Cat#24040032环境100％，Sigma，Cat#E7023-500ml

实施例4

试剂制备

试剂体积可根据需要缩放。

将50mL热灭活FBS添加到55mL完全DMEM(cDMEM)。添加5mL的100×Pen/Strep/谷氨酰胺溶液。用无菌瓶过滤器过滤。指定1个月的有效期并储存在4℃。

FACT QC原液：不同批次的FACT中的AAV NAb滴度可能不同，并且稀释方案可以以在两个中间稀释度之间实现50％抑制的方式进行调整。可以使用其他对照AAV NAb，例如血浆或血清。

实施例：对于批次3696，用热灭活的FBS以1:10稀释热灭活的FACT样品并且等分冷冻。储存在<-60℃并指定有效期。不要超过3次冻融循环。HQC、MQC和LQC在测定设置期间使用以下示例性方案进行稀释：

表1：QC稀释方案的实施例(用于FACT批次3696)

Ponasterone A：快速旋转小瓶并以1mg/mL的浓度在100％乙醇中重构。剧烈涡旋。储存在-20℃。

DPBS中的Pluronic F68：使用两层稀释方案将一份10％的Pluronic原液与10,000份DPBS混合。在制备之日使用。

AAV-CAG-萤光素酶载体：在制造原液的初始解冻后，用0.001％的Pluronic F68稀释载体以获得2×10¹¹vg/mL的原液浓度。将50μL等分试样分配到无菌不粘表面管中。将等分试样储存在-60℃。

空衣壳AAV颗粒(EV)：在制造原液的初始解冻后，将适当的体积等分到无菌不粘表面管中并且储存在-60℃。解冻等分试样后丢弃剩余物。

测试样品：在初始解冻后，在56℃下加热灭活血清样品30分钟。在无菌不粘表面管中制备400μL等分试样，并储存在-60℃直至使用。解冻后，未使用的血清可以保存并储存在-60℃或可以被丢弃。如果保存，则在管上标记冻融循环。不要超过3次冻融循环。

稀释血清：胎牛血清(FBS)制备一次性等分试样，并储存在-20℃。

1×海肾荧光素酶检测试剂：将测定缓冲液和底物解冻或使其达到室温(环境温度)。可以使用水浴。混合均匀，因为解冻会产生密度和成分梯度。试剂最多可解冻5次而不会出现明显的活性损失。要制备试剂，在50mL锥形管中将1体积的100×海肾荧光素酶检测底物添加到100体积的海肾荧光素酶检测缓冲液中。通过涡旋管10-20秒彻底混合。将试剂置于暗处。制备后，缓冲液在环境温度下可稳定12小时。

实施例5

第1天：铺板2V6.11细胞、样品中和以及细胞转导

将cDMEM培养基置于37℃CO₂培养箱中，盖松散至少30分钟。这使得能重新设置pH值和温度。该培养基稍后用于细胞解冻和铺板。

从储存装置中取出样品、FACT QC原液、热灭活的FBS和不含FBS的DMEM，并使它们平衡至环境温度。

任选的：如果血清样品没有被热灭活，则在56℃下热灭活样品30分钟。标记管以指示热灭活。如果先前加热灭活，则不要再次加热样品。

如图10A所示，使用96孔U形底组织培养板从FACT QC原液制备稀释液。该板称为稀释板。指定的体积足以制备一份样品，如果需要，则应按比例放大。吸移以混合直至均匀。使用相同的稀释板，制备样品稀释液，如图10B所示。

将20μL的各个稀释的FACT对照和样品从稀释板转移到新的96孔U型底中和板，如图11所示。

将20μL的热灭活FBS添加到中和板上的MIN、MAX和MAX.EV孔中，如图12所示。

仅当使用EV时，在不含FBS的DMEM中制备工作浓度为1.5×10¹¹cp/mL的空衣壳AAV颗粒(EV)。避免剧烈涡旋。0.8mL体积的稀释EV足以用于一个完整的检测板。

仅当使用EV时，将10μL的EV添加到指定为S.EV、FACT.EV和MAX.EV的孔中，如图13A所示。将10μL不含FBS的DMEM添加到含有样品(S)、FACT和MAX的孔中，将20μL不含FBS的DMEM添加到MIN对照孔中，如图13B所示。仅当使用EV时，将中和板在37℃下孵育30±5分钟。

在不含FBS的DMEM中制备工作浓度为3.2×10⁹vg/mL的AAV报道载体(RV)。避免剧烈涡旋。0.8mL体积的稀释载体足以容纳一个完整的检测板。

将10μL RV添加到所有孔中，除了中和板中含有MIN对照的孔外，如图14所示。将中和板在37℃下孵育30±5分钟。

从冷冻库中取出一瓶2V6.11细胞并立即置于37℃水浴中4分钟。如果需要多个小瓶，则相应增加。从水浴中取出小瓶，用70％EtOH清洗并翻转180°两次以使细胞重新悬浮。

使用1或2mL血清移液器从冷冻管中吸取所有细胞悬液并将其转移到空的15mL锥形管中。在这一步，细胞对剪切力很脆弱。

使用10mL移液器，将9mL温培养基添加到15mL锥形管中。前3mL应缓慢、逐滴添加。剩余的6mL培养基从移液器中较快地加入。细胞现在悬浮在约10mL中。

封闭15mL锥形管并将其翻转180°两次以匀化细胞悬液。将50μL细胞悬液转移到Eppendorf管中进行计数，并将剩余的细胞悬液以240×g的速度旋转10分钟。

计算活细胞和死细胞。如果存活率低于70％，则丢弃细胞并解冻另一个小瓶。

在cDMEM中将细胞稀释至4.0×10⁵个细胞/mL。将ponasterone A添加到最终浓度为1μg/mL。每块板需要10mL的细胞悬液。

取平底96孔组织培养板，每孔加入100μL细胞悬液(4.0×10⁴个细胞)。该板称为转导板。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育直至使用。记录所用细胞库的批号和活力。

中和后，从中和板上的每个孔取7.5μL按一式三份转移到转导板中的孔中，如图15所示。用封口膜包裹转导板并在37℃、5％CO₂组织培养孵育箱中孵育转导板24小时±30分钟。记录孵育开始时间。

第2天：荧光素酶活性的测量

应在加入的7.5μL/孔从中和板转移到转导板后约24至25小时内从孔中取出含有分泌的荧光素酶的细胞培养上清液。由于分泌的荧光素酶会随着时间在培养基中积累，因此改变这个时间会极大地影响活性读数的范围。

准备足够体积的1×海肾萤光素酶检测试剂，并在检测前平衡至室温。从培养箱中取出检测板。观察细胞并记录任何毒性迹象(低融合度、细胞从孔底分离、细胞附着但呈圆形等)且批注。

在读取之前打开GloMax Navigator System酶标仪，然后打开平板PC至少五分钟。当约24小时孵化结束时,用多通道移液器将上清液上下移一次,并将约90μL培养上清液转移到96孔组织培养板。如果需要，过量的上清液可用于第二次读数。如果不使用，可以丢弃或<-60℃冷冻。

将40μL的培养上清液转移到96孔黑板上。检测板布局如图7所示。任选地，如果未立即读取板，则用密封剂密封板，并将其在室温下在黑暗条件下存放长达4小时。

用板装载读取器。点击GloMax Navigator软件图标以启动GloMax Navigator软件。选择协议。使用下面详述的仪器设置：

读取模式：发光

积分时间：1秒

板类型：96孔标准

读取区域：突出显示要测量的列和行

注入和延迟：

注射器1：取消选择

注射器2：选择

体积：100μL

延迟：2秒

速度：230μL/秒

黑暗适应：3分钟

读板

实施例6

数据分析

计算所有对照和样品稀释液的平均(也称为“均值”)标准偏差(SD)和发光读数[RLU]的％CV。

使用MAX三个复孔和MIN三个复孔的平均发光值[RLU_AV]来计算信噪比(S/N)。S/N＝MAX[RLU_AV]/MIN[RLU_AV]

使用具有和不具有空载体(例如，HQC、MQC、LQC、HQC EV、MQC EV和LQC EV)的MAX、MIN、QC稀释液的平均发光值[RLU_AV]，以及一式三份的测试样品(S)孔分别用于以下计算：

％抑制MAX(％I.MAX)＝100-[(S-MIN)/(MAX-MIN)]×100]。这是针对每个样品(S)稀释度计算的，如表2所示。

表2

％抑制S.EV(％I.SEV)＝100-[(S-MIN)/(S.EV-MIN)]×100]。这是针对每个样品(S)稀释度计算的，如表3所示。

表3

HQC％抑制＝100-[(HQC-MIN)×100)/(MAX-MIN)]

EV干扰＝MAX/MAX.EV

EV功效＝HQC EV/HQC

AAV NAb滴度定义为抑制％≥50的最低样品稀释度。将NAb滴度分配给每个样品，如图6A-6E所示。

检测接受标准

检测标准1：HQC(例如，FACT 1:100)必须满足预定义的批次特定％I.MAX±3SD。

检测标准2：HQC(例如，FACT 1:100)必须满足三个重复孔中的值[RLU]的CV％≤35％的精度。

检测标准3：阳性转导对照(MAX)必须满足一式三份孔中的发光值[RLU]的CV％≤35％的精度。

检测标准4(仅当EV用于检测时适用)：计算的EV干扰必须在0.7至1.3的范围内。

检测标准5(仅当EV用于检测时适用)：计算的EV必须≥2。

不满足所有上述适用标准的检测板被认为是失效板。不应报道失效板的结果。重复测定。

样品滴度接受标准

标准1：针对三个复孔之间的发光值[RLU]，报道为最终NAb滴度的样品稀释度应满足CV％≤35％的精度。对于不符合标准的任何样品，结果将被视为无效，并需要重新测试，除非样品已耗尽或有明确的理由。除非发现技术错误或需要重新分析，否则不应重新分析具有有效结果的样品。

实施例7

表4

实施例8

Spk1(SEQ ID NO:1):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

Spk2(SEQ ID NO:2):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL

CAG启动子序列(也在图16中示意性显示)(SEQ ID NO:3):

ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA