具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在本文中，术语“治疗”病状、疾病或者病症包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。

在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。

在本文中，术语“转导”、“转染”和“感染”是指将外源核酸(目的基因)递送到宿主细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。

在本文中，术语“基因送递”指的是将外源多核苷酸引入细胞来进行基因传递，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。

在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

在本文中，“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和多核苷酸构成的病毒颗粒。如果病毒颗粒包括异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如要递送到哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为重组AAV载体或rAAV。

本领域公知，西地那非(Sildenafil)，又可译为昔多芬，是一种常用于治疗勃起功能障碍(ED)的口服药物。

在一些实施方式中，通过HEK293细胞的三质粒(质粒1：顺式元件质粒；质粒2：AAVRep/Cap质粒；质粒3：辅助质粒)转染来生产重组AAV载体。在一个实施方式中，从HEK293细胞的培养基和裂解物中收获AAV颗粒。纯化方法例如亲和色谱、离子交换色谱、氯化铯和碘克沙醇梯度超速离心。

在一个实施方式中，为了产生重组AAV载体，按如下进行HEK293细胞的三质粒转染：质粒1：具有ITR的顺式元件质粒；质粒2：具有衣壳蛋白编码序列的AAV Rep/Cap质粒；质粒3：具有腺病毒成分的辅助质粒，其能够促进AAV病毒体的复制、组装和包装。在一个实施方式中，将HEK293细胞产生的AAV颗粒通过亲和层析和碘克沙醇密度梯度超速离心进行纯化。

在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库。

本领域技术人员可以使用已知的标准方法来生产重组和合成的多肽或其蛋白质、设计核酸序列、生产转化细胞、构建重组AAV载体、改造衣壳蛋白质、包装表达AAV Rep和/或Cap序列的载体，以及瞬时或稳定转染包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的。参见例如，分子克隆(MOLECULAR CLONING)：实验室手册(A LABORATORY MANUAL)，第二版，(冷泉港，纽约州，1989年)。

在一个实施方式中，本公开的基因递送组合物用于开展研究，例如确定目的基因的表达对细胞活力和/或功能的影响。

在一个实施方式中，本公开的基因递送组合物用作药物。当用作药物时，根据所包含的目的基因，本公开的基因递送组合物可以用于治疗多种类型的疾病，包括癌症，例如肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和成胶质细胞瘤；自身免疫性疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病、弥漫性毒性甲状腺肿、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮；暴露于感染性因子导致的疾病；以及遗传性疾病。

在一个实施方式中，本公开的基因递送组合物被制备成单位剂量的药物。在一些实施方式中，单位剂量包括重组AAV载体的1×10⁹至1×10¹⁵个载体基因组(vector genome，vg)和5μg至100mg的西地那非，例如1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³或1×10¹⁴vg的重组AAV载体和50μg、100μg、500μg、1mg、50mg或100mg的西地那非。在一个优选实施方式中，单位剂量包括1×10¹²至2×10¹³vg的重组AAV载体和1mg至50mg的西地那非。

在一些实施方式中，本公开的基因递送组合物可用于体外转导各种类型的细胞以产生表达蛋白质产物的稳定细胞系，然后可将其体内引入以用于治疗目的或非治疗目的(例如，美容、体重管理如减肥和增肌，以及营养强化)。细胞的类型包括但不限于内皮细胞、成肌细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、Müller细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、杆状细胞和视锥细胞、神经元、造血干细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、破骨细胞和巨噬细胞。将细胞引入或移植到受试者中的原理和技术是本领域技术人员已知的。

在一个实施方式中，AAV载体可以装载外源多核苷酸用于将目的基因递送到靶细胞中。因此，AAV载体可用于在体外或体内将目的基因递送至细胞。

在一个实施方式中，由AAV载体递送的目的基因编码充当报告子的多肽(即报告蛋白)。报告蛋白用于指示被AAV成功感染的细胞。这些报告蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的目的基因编码用于治疗用途的蛋白质，所述蛋白质为天然蛋白质或合成蛋白质。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的目的基因编码用于非治疗用途的蛋白质，所述蛋白质为天然蛋白质或合成蛋白质。

在一个实施方式中，本公开的基因递送组合物被制成药物制剂(例如，注射剂如注射液和注射用无菌粉末、片剂、胶囊剂、散剂、滴眼剂)施用于人或其他哺乳动物。该药物制剂还包含其他成分，例如药物辅料、水溶性或有机溶剂(例如水、甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、苯酚或聚乙二醇)、盐(例如氯化钠、氯化钾、磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl和Tris-乙酸盐)、延缓溶解试剂(例如石蜡)、表面活性剂、抗微生物剂、脂质体、脂质复合物、免疫抑制剂(例如可的松、泼尼松、环孢霉素)、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚)微球、硬质基质、半固体载体、纳米球或纳米颗粒。此外，药物制剂可以通过吸入、全身或局部(例如，静脉内、肌内、皮下、经口、接触、腹膜内和病灶内)的给药方式以单剂量或多剂量递送。可以将药物制剂与施用说明书一起包含在容器、包装、或分配器(例如，注射器)中。

在一个实施方式中，用本公开的基因递送组合物转染宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞可以为可产生rAAV病毒粒子的任何宿主细胞，包含但不限于例如哺乳动物细胞(例如，HEK-293细胞)、昆虫细胞(例如，SF9细胞)、微生物和酵母。

在一个实施方式中，赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体(在气溶胶组合物的情况下)。赋形剂包括多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和无机盐中的一种以上。

在一个实施方式中，使细胞与重组AAV载体和西地那非接触。在一个实施方式中，使细胞与1×10¹¹至2×10¹⁴vg的重组AAV载体和5至50μg/ml的西地那非接触。在一个优选实施方式中，使细胞与1×10¹²至2×10¹⁴vg、5×10¹²至2×10¹⁴vg、5×10¹²至5×10¹³vg或3×10¹³至5×10¹³vg的重组AAV载体以及10至50μg/ml、20至50μg/ml、30至50μg/ml或40至50μg/ml的西地那非接触。在一些实施方式中，接触发生在体外。在一些实施方式中，接触发生在体内，即，将重组AAV载体和西地那非施用于受试者。在一个实施方式中，将1×10¹¹至2×10¹⁴vg/kg的重组AAV载体和5至50mg/kg的西地那非施用于受试者。在一个优选实施方式中，将1×10¹²至2×10¹⁴vg/kg、优选5×10¹²至2×10¹⁴vg/kg、更优选5×10¹²至5×10¹³vg/kg、更优选1×10¹³vg/kg至5×10¹³vg/kg，特别优选3×10¹³vg/kg至5×10¹³vg/kg的重组AAV载体以及10至50mg/kg、优选20至50mg/kg、优选30至50mg/kg、特别优选40至50mg/kg的西地那非施用于受试者。

在一个实施方式中，在相同条件下，与仅施用重组AAV载体的对照组相比，西地那非和重组AAV载体的共同施用导致细胞在体内或体外的目的蛋白表达增强。在一个优选实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一个更优选实施方式中，所述哺乳动物细胞为人细胞。在一个优选实施方式中，与仅施用重组AAV载体的对照组相比，西地那非和重组AAV载体的共同施用导致细胞在体内或体外的目的蛋白表达增强例如至少约1.2倍、优选1.5倍、更优选2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。

在一个实施方式中，目的蛋白表达的量可以通过例如免疫测定来测量。

在一个实施方式中，在相同条件下，与仅施用重组AAV载体的对照组相比，西地那非和重组AAV载体的共同施用导致细胞在体内或体外产生的AAV载体的中和抗体降低。在一个优选实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一个更优选实施方式中，所述哺乳动物细胞为人细胞。在一个优选实施方式中，与仅施用重组AAV载体的对照组相比，西地那非和重组AAV载体的共同施用导致细胞在体内或体外产生的AAV载体的中和抗体降低例如至少约1.2倍、优选降低至少1.5倍、更优选降低至少2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。

在一个实施方式中，中和抗体滴度可以通过例如ELISA测定来测量。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1.西地那非提高AAV载体介导的Gluc(分泌型荧光素酶)的表达

向正常C57雌性小鼠注射不同浓度的西地那非(5、10、50mg/kg)和AAV9-Gluc病毒(1×10¹³vg/kg)，或者仅注射AAV9-Gluc病毒(1×10¹³vg/kg)。对照组仅注射生理盐水。测定注射后1周、2周、3周、4周血清中Gluc的表达。

结果显示，如图1所示，相对于仅注射AAV9-Gluc病毒的组，注射西地那非(5、10、50mg/kg)+AAV9-Gluc病毒的组能提高小鼠血清中Gluc的表达，且表达量随着西地那非剂量的增加而增加(图1)。在仅注射AAV9-Gluc病毒的组中，小鼠血清中Gluc的表达在第3周达到峰值，第4周开始下降。注射西地那非(10、50mg/kg)+AAV9-Gluc病毒的组在第4周仍表现为上升的趋势。上述结果表明，西地那非能提高AAV9-Gluc在小鼠中的表达。

实施例2.西地那非增强AAV介导的GFP在小鼠各组织中的表达

为研究西地那非在小鼠各组织中对AAV系统性给药后感染的影响，选择10mg/kg剂量的西地那非，腹腔注射C57小鼠1周后，尾静脉注射AAV9-GFP(5×10¹³vg/kg)病毒。3周后，灌流取脑(皮层、海马)、肝、心、肾、肌肉组织进行冰冻切片，厚度均为10μm。经过0.3％的TritonX-100透化和5％的BSA封闭后，在4℃孵育一抗(抗GFP)过夜。接着，用与一抗源性相对应的带有荧光基团(吸收波长488nm)的二抗和DAPI室温孵育2小时。最后，用LeicaThunder系统进行成像，并在拍摄参数一致且没有过度曝光的条件下进行GFP的荧光定量分析。

图2A和图2B显示了西地那非对AAV9-GFP病毒感染的小鼠各组织中GFP表达的影响。结果显示，如图2A所示，相比于仅注射AAV9-GFP的小鼠组，西地那非处理的小鼠组的脑切片中皮层、海马、肝脏、心、肾脏以及肌肉组织中GFP的荧光强度均增多，其中皮层、海马、肾脏以及肌肉的荧光统计分析p<0.05(图2B)。

此外，取各组小鼠不同组织匀浆提取蛋白进行免疫印迹。图3显示了西地那非(10mg/kg)对AAV9-GFP病毒(5×10¹³vg/kg)感染C57小鼠3周后组织中GFP表达的影响。结果显示，西地那非处理的小鼠组中，皮层、肌肉、肝脏、心以及肾脏组织中GFP蛋白的表达得到提高(图3A)，其中肌肉、肝脏以及肾脏荧光统计分析p<0.05(图3B)。

上述结果表明，西地那非能提高AAV9-GFP病毒在小鼠各组织中的感染效率，增加目的基因GFP的表达。

实施例3.西地那非通过增强小泡介导的内吞和大胞饮作用来提高AAV对组织的感 染效率

已知AAV病毒在体内的转运主要通过胞吞胞吐来实现的，包含三个主要参与途径，即网格蛋白介导的内吞、小泡介导的内吞，以及大胞饮作用。

为深入探究西地那非增加AAV组织感染效率的作用机制，本发明人在体外构建了transwell血管模型。在下层小室内接种293细胞，利用西地那非与三种途径的抑制剂联合处理体外血管模型。网格蛋白介导的内吞、小泡介导的内吞和大胞饮作用这三种途径的抑制剂分别为菲律宾菌素(Filipin)、阿米洛利(Amiloride)和氯丙嗪(Chlorpromazine)。

用含西地那非(50μg/ml)、Filipin(5μg/ml)+西地那非(50μg/ml)、Amiloride(50μM)+西地那非(50μg/ml)、Chlorpromazine(10μg/ml)+西地那非(50μg/ml)的培养基分别处理细胞12小时，然后换成含有1×10¹¹vg AAV9-GFP病毒的无血清ECM培养基继续培养6小时，之后移除上层小室，并更换下层培养液，继续培养72h。

荧光显微镜观察显示，仅使用西地那非处理组的293细胞的GFP荧光明显强于未处理组(图4A)。当加入Filipin或Amiloride抑制剂后，荧光强度明显减少，降低至与西地那非未处理组相近。而Chlorpromazine抑制剂对荧光强度则无明显的影响(图4A)。这表明Filipin和Amiloride抑制剂能够拮抗西地那非对AAV组织感染能力的增强，而Chlorpromazine则对西地那非的增强作用无明显作用。

接着，提取293细胞的总mRNA进行qPCR检测。结果显示，仅使用西地那非处理组的293细胞中GFP的转录水平高于未处理组。当加入Filipin或Amiloride抑制剂后，GFP转录水平明显减少，降低至与西地那非未处理组相近。而Chlorpromazine抑制剂对GFP转录水平无明显的影响，该结果与荧光成像结果一致(图4B)。

上述结果表明，西地那非通过增强小泡介导的内吞和大胞饮作用来提高AAV9对组织的感染效率，增加AAV9在各组织中的分布。

实施例4.西地那非减轻AAV引起的免疫反应以及降低AAV中和抗体

为了研究西地那非对AAV引起的免疫反应的作用，本发明人利用流式细胞技术分析脾脏中T细胞和B细胞的亚群。其中CD25⁺FoxP3⁺标记调节性T细胞(Treg)，B220⁺CD19⁺标记B细胞。

结果显示，与空白对照组相比，仅注射AAV9组小鼠脾脏中Treg细胞数量出现下降(图5A，图5B)且B细胞数量增加(图5C，图5D)，表明注射AAV会激活免疫应答。并且，与仅注射AAV9组相比，西地那非处理组(10mg/kg)小鼠脾脏中Treg细胞数量显著增加且B细胞数量明显减少(p<0.05)，西地那非组小鼠脾脏中Treg细胞和B细胞数量与空白对照组无显著性差异(p>0.05)。上述结果表明，西地那非能够减轻AAV引起的免疫反应。

此外，提取了各组小鼠脾脏的mRNA，通过qPCR检测炎症水平。结果显示，西地那非处理组(10mg/kg)小鼠脾脏中的炎症因子IL1、IL6、TNFα的转录水平明显低于仅注射AAV9病毒组(图5E)，表明西地那非具有一定的抗炎作用。

最后，中和抗体实验研究发现，注射AAV病毒2周和3周后，西地那非处理组能显著降低小鼠AAV9中和抗体的产生(图5F)。

由此可见，西地那非能够通过调节Treg和降低B细胞数量有效抑制AAV9引起的免疫应答，降低炎症反应以及降低AAV9中和抗体的产生。因此，西地那非可以减少AAV9在小鼠体内的清除，增加其感染效率。

实施例5.西地那非与AAV载体联用的安全性评价

首先研究了西地那非对huvec细胞的CCK8毒性。CCK8结果显示，西地那非对huvec细胞无明显毒性作用(图6C)。

接下来，进行了西地那非的安全性评价。结果显示，不同剂量(5、10、50mg/kg)的西地那非与AAV9联用不影响小鼠的体重(图6A)，且西地那非与AAV9联用不影响小鼠的肝功能指标，ALT与AST水平与空白组无显著性差异(图6B)，表明西地那非与AAV病毒联合使用的安全性较高。

实施例6.西地那非提高AAV载体介导的抗肌萎缩蛋白的表达

在DMD基因模型小鼠上进一步验证西地那非的作用。选择10mg/kg剂量的西地那非，腹腔注射DMD小鼠1周后，尾静脉注射AAV9-dystrophin(3×10¹³vg/kg)病毒。3周后，灌流取心脏组织和腿部肌肉，包括腓肠肌(gastrocnemius muscle，GAS)、肱四头肌(quadricepsfemoris muscle，QF)以及胫骨前肌(tibialis anterior，TA)组织冷冻切片，厚度均为10μm。经过0.3％的TritonX-100透化和5％的BSA封闭之后，在4℃孵育一抗(Anti-Dystrophin)过夜。然后，用与一抗源性相对应的带有荧光基团(吸收波长555nm)的二抗和DAPI室温孵育2小时。最后，用Leica Thunder系统进行成像，并在拍摄参数一致且没有过度曝光的条件下进行抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的荧光定量分析。

结果显示，如图7所示，相比于仅注射AAV9-dystrophin组小鼠，西地那非处理组的小鼠腿部肌肉中抗肌萎缩蛋白的荧光强度增强，其中GAS和QF明显增加(p<0.05)。同样的结果在小鼠心肌组织切片中也能观察到。

此外，取各组小鼠不同组织匀浆提取蛋白进行免疫印迹。结果显示，西地那非处理能显著提高腓肠肌、肱四头肌、胫骨前肌和心脏肌肉中抗肌萎缩蛋白的表达，p<0.05(图8)。上述结果表明，西地那非可以有效地提高AAV载体介导的抗肌萎缩蛋白的表达。

此外，除了上述实施例中验证的AAV9，基于本公开的内容可以合理预期西地那非对其他AAV血清型的目的基因表达也具有不同程度的增强作用，并且也可以一定程度地降低其他AAV血清型的中和抗体。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。