一种表达prrsv游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种表达prrsv游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途 (Recombinant adeno-associated virus for expressing PRRSV free receptor and preparation method and application thereof ) 是由 夏文龙 孙怀昌 刘晓明 吴植 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术及动物疫病防控领域,具体公开了一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法,首先构建获得了GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc重组病毒载体,然后通过三质粒转染法包装获得重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。本发明制备得到的融合表达CD163和Sn游离受体的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn,为阻断PRRSV感染提供了新的生物制剂,也为PRRSV新型疫苗的研发打下了基础。(The invention relates to the field of biotechnology and animal epidemic disease prevention and control, and particularly discloses a preparation method of recombinant adeno-associated virus expressing PRRSV free receptor, which comprises the steps of firstly constructing and obtaining a GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc recombinant virus vector, and then packaging by a three-plasmid transfection method to obtain the recombinant adeno-associated virus rAAV-CD 163-Sn. The recombinant adeno-associated virus rAAV-CD163-Sn fusion-expressed CD163 and Sn free receptor prepared by the invention provides a new biological agent for blocking PRRSV infection and lays a foundation for the research and development of PRRSV novel vaccines.)
技术领域
本发明属于生物技术及动物疫病防控领域，具体涉及一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)属动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，全长约15kb，该病毒能够引发以母猪繁殖障碍、新生仔猪死亡率升高以及各年龄猪呼吸道症状为主要特征的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。自1987年于美国首次发现以来，PRRS陆续在全世界爆发和流行，我国于1996年首次分离到病毒，并于2006年发展为高致病性毒株(HP-PRRSV)在全国大部分地区爆发，近年来，在我国河南、四川、浙江等多个地区又相继发现和美国NADC30毒株同源性较高的PRRSV NADC30-like株，PRRSV难以净化、根除，目前已成为养猪场最重要的传染病之一，给养猪业带来了巨大的经济损失。该病目前主要依靠灭活和弱毒疫苗免疫接种进行预防控制，灭活苗具有较好的安全性，然而它所激发的免疫以体液免疫为主，产生保护效果较慢、持续时间较短，免疫效果不理想；弱毒疫苗对同源毒株保护效果较好，但是对异源毒株保护效果较差，并且存在毒力返强和病毒重组的风险。因此，传统疫苗难以有效控制PRRS传播，其防控形势不容乐观。
PRRSV具有严格的细胞嗜性，主要通过受体介导的胞吞机制侵入猪单核-巨噬细胞系统，其中肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)是其首选细胞，存在于PAM上的PRRSV受体主要有四个：CD163分子、唾液酸黏附素(Sialoadhesin,Sn)、硫酸乙酰肝素(Heparin sulfate,HS)和非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ-A(Non-muscle myosin heavy chainⅡA,NMMHC-ⅡA)，而CD163和Sn是介导PRRSV感染PAM细胞的关键受体，并且CD163、Sn受体和PRRSV的结合区域已明确，CD163为第5到9个清道夫受体半胱氨酸富含结构域(SRCR59)，Sn为前4个免疫球蛋白样结构域(Sn4D)。病毒游离受体是指利用人工构建的可溶性病毒受体与细胞受体竞争性结合病毒，从而发挥类似中和抗体的作用，其本质为阻断病毒和靶细胞上特异受体的结合作用。由于病毒受体由动物宿主基因组编码，高度保守且不易突变，所以游离受体的病毒感染阻断作用较传统疫苗诱导的中和抗体更为稳定可靠，已被成功用于柯塞奇病毒、小鼠肝炎病毒、人冠状病毒等病毒的抗感染研究。本实验室在前期已分别构建了表达CD163和Sn游离受体的两种重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)，并证实这两种游离受体能成功表达并协同抑制PRRSV感染，然而rAdV介导的两种游离受体在猪体内表达时间较短，并且rAdV具有较高免疫原性，载体特异性抗体的产生不利于目的基因表达，无法通过多次接种以延长游离受体在猪体内的持续时间，所以有必要重新选择递送载体。
目前PRRSV疫苗主要为灭活苗和弱毒苗，存在交叉保护效果差、潜在病毒重组和毒力返强等弊端，而病毒受体由宿主细胞编码，高度保守且不易突变。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途，制备得到的融合表达CD163和Sn游离受体的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn，为阻断PRRSV感染提供了新的生物制剂，也为PRRSV新型疫苗的研发打下了基础。
本发明提供了一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，具体包括如下步骤：
S1，GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc重组病毒载体的构建：
首先设计引物对扩增SRCR59-Fc序列，将扩增产物插入至GV461载体的BamHI和SalI酶切位点之间，提取重组质粒GV461-SRCR59-Fc；
然后设计引物对扩增Sn4D-Fc序列，将扩增产物回收后插入至GV461-SRCR59-Fc的HindIII和BglII酶切位点之间，提取重组病毒载体GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc；
S2，重组腺相关病毒包装：采用GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、pAAV-Helper、pAAV-RC三种质粒，根据三质粒转染法包装重组腺相关病毒，获得重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn；
S3，将S2中获得的重组腺相关病毒收集、浓缩并纯化。
进一步地，S1中，扩增SRCR59-Fc序列的引物对中上游引物基因序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，S1中，扩增Sn4D-Fc序列的引物对中上游引物基因序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物基因序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，Sn4D-Fc序列融合了剪切肽P2A序列、Sn前4个免疫球蛋白样结构域Sn4D基因序列和猪IgG Fc片段基因序列。
进一步地，所述SRCR59-Fc序列融合了猪IgG重链信号肽序列、猪CD163分子第5到9个半胱氨酸富含结构域SRCR59基因序列和猪IgG Fc片段基因序列。
进一步地，S2中，重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn具体包装过程如下：
分别吸取GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、pAAV-Helper、pAAV-RC三种质粒各10μg，混合后加入1mL 0.3M CaCl2，混匀后加入至1mL HBS溶液中，然后将混合液滴加至含70％-80％汇合度的AAV-293细胞的培养皿中，混匀后在细胞培养箱放置6小时，随后将培养皿中的培养液弃去，替换为10mL新鲜的培养液，置于细胞培养箱中继续培养，约66-72小时，大部分细胞由贴壁状态转为变圆、脱落，此时收集细胞与培养液，在-80℃冰箱和37℃水浴中交替冻融四次，10000×g离心10分钟，弃去细胞碎片，收集离心上清，该上清即为重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。
进一步地，S3中，所述重组腺相关病毒的收集、浓缩和纯化过程具体为：
在rAAV-CD163-Sn病毒液中加入40％PEG8000溶液至其终浓度为8％，冰上放置2小时，期间每15分钟来回颠倒混匀一次，2500×g离心30分钟，沉淀用PBS重悬，随后将重悬液3000×g离心30分钟，将上清转移至15mL离心管中，加入Benzonase核酸酶使其终浓度为50U/ml，消化去除残留的质粒DNA，37℃孵育30分钟后，将病毒液用0.45μm滤器进行过滤，将过滤后的病毒液通过CsCl密度梯度离心法进行纯化。
本发明的还提供了一种上述的制备方法制备得到的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。
本发明还提供了一种所述的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn的生物制剂
本发明还提供了一种上述重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn、或所述的生物制剂在制备抗PRRSV感染药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn，转导PK-15细胞后，可检测到SRCR59-Fc和Sn4D-Fc两种游离受体的分泌表达，可以用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控研究。
2、本发明将重组腺相关病毒(rAAV)作为递送载体，融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CD163分子和唾液酸黏附素(Sn)游离受体，为阻断PRRSV感染提供了新型生物制剂。
3、本发明制备得到的融合表达CD163和Sn游离受体的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn，在体外细胞水平上能够成功表达具有生物活性的两种游离受体，可以作为抗PRRSV感染新型生物制剂进行开发，为阻断PRRSV感染提供了新的生物制剂，也为PRRSV新型疫苗的研发打下了基础。
附图说明
图1为本发明中SRCR59-Fc和Sn4D-Fc两种游离受体基因序列的扩增图；
图2为本发明中重组病毒载体的双酶切鉴定图；
图3为本发明中制备的重组病毒颗粒透射电子显微镜图；
图4为本发明中两种游离受体(SRCR59-Fc和Sn4D-Fc)Western-blot检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明中生物材料来源如下：
1、pShuttle-SRCR59-Fc、pShuttle-Sn4D-Fc载体均由本实验室构建并保存(具体构建方式见文献：Chen Y,Guo R,He S,et al.Additive inhibition of porcinereproductive and respiratory syndrome virus infection with the solublesialoadhesin and CD163 receptors[J].Virus Research,2014,179:85-92.)。
2、AAV Helper-Free System(包括GV461、pAAV-Helper、pAAV-RC质粒)均由上海吉凯基因科技有限公司提供。
3.AAV-293细胞由上海吉凯基因科技有限公司提供。
实施例1
一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，
重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn的目的基因，是由CD163和Sn两种游离受体编码序列融合而成。其中CD163游离受体编码序列为SRCR59-Fc，该序列融合了猪IgG重链信号肽序列、猪CD163分子第5到9个半胱氨酸富含结构域(SRCR59)基因序列和猪IgG Fc片段基因序列；Sn游离受体编码序列为Sn4D-Fc，该序列融合了剪切肽P2A序列、Sn前4个免疫球蛋白样结构域(Sn4D)基因序列和猪IgG Fc片段基因序列。
具体制备过程包括如下步骤：
1、重组病毒载体的构建
(1)SRCR59-Fc序列扩增：根据猪CD163半胱氨酸富含结构域序列(GenBank登录号：NM_213976)和猪IgG Fc片段序列(GenBank登录号：LOC396781)设计1对引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：5’-AAGGATCCGTTGGAGGGGACATTCCCT-3’
SEQ ID NO.2：5’-GGGTCGACTCATTTACCCTGAGTCTTGGA-3’
将上述引物交由上海生工生物工程有限公司合成，以pShuttle-SRCR59-Fc载体质粒为模板，根据PrimeSTAR Max DNA聚合酶[购自宝日医生物技术(北京)有限公司]进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示成功扩增SRCR59-Fc基因序列(图1)，将扩增产物回收后插入至GV461载体的BamHI和SalI酶切位点之间，按照质粒提取试剂盒(购自德国QIAGEN生物公司)操作说明提取重组质粒GV461-SRCR59-Fc。
(2)Sn4D-Fc序列扩增：根据猪Sn前4个免疫球蛋白样结构域序列(GenBank登录号：NM_214346)和猪IgG Fc片段序列(GenBank登录号：LOC396781)设计1对引物：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.3：5’-GGAAGCTTATGGACTTCCTGCTCCTGCT-3’
SEQ ID NO.4：5’-TTAGATCTTCATTTACCCTGAGTCTTGGA-3’
将上述引物交由上海生工生物工程有限公司合成，以pShuttle-Sn4D-Fc载体质粒为模板，根据PrimeSTAR Max DNA聚合酶[购自宝日医生物技术(北京)有限公司]进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示成功扩增Sn4D-Fc基因序列(图1)，将扩增产物回收后插入至GV461-SRCR59-Fc的HindIII和BglII酶切位点之间，按照质粒提取试剂盒(购自德国QIAGEN生物公司)操作说明提取重组质粒GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc。
(3)重组病毒载体酶切鉴定：将上述重组病毒载体GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc用BamHI/SalI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，重组载体释放出预期的2条目的条带，分别为质粒条带和SRCR59-Fc条带(图2)。将GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc用HindIII/BglII进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，重组载体释放出预期的2条目的条带，分别为质粒条带和Sn4D-Fc条带(图2)。
2、重组腺相关病毒包装
参考上海吉凯基因科技有限公司提供的AAV Helper-Free System操作说明，利用三质粒转染法包装重组腺相关病毒。分别吸取GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、pAAV-Helper、pAAV-RC三种质粒各10μg，置于1.5mL的离心管中，然后加入1mL 0.3M CaCl2，轻轻吹打混匀；将该混合液加入至含1mL HBS溶液的15mL锥形离心管中，轻轻吹打混匀；将混合液滴加至含70％-80％汇合度的AAV-293细胞的培养皿中，轻轻晃动培养皿使溶液均匀分布，将培养皿在细胞培养箱放置6小时，随后将培养皿中的培养液弃去，替换为10mL新鲜的培养液，置于细胞培养箱中继续培养。约66-72小时，大部分细胞由贴壁状态转为变圆、脱落，此时收集细胞与培养液，在-80℃冰箱和37℃水浴中重复冻融四次，10000×g离心10分钟，弃去细胞碎片，收集离心上清，该上清即为重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。
3、重组腺相关病毒收集与浓缩、纯化
在rAAV-CD163-Sn病毒液中加入40％PEG8000溶液至其终浓度为8％，冰上放置2小时，期间每15分钟来回颠倒混匀一次，2500×g离心30分钟，弃去上清，沉淀用PBS重悬；随后将重悬液3000×g离心30分钟，将上清转移至15mL离心管中，加入Benzonase核酸酶(购自美国Merck生物公司)使其终浓度为50U/ml，消化去除残留的质粒DNA，37℃孵育30分钟后，将病毒液用0.45μm滤器进行过滤，按照上海吉凯基因科技有限公司提供的操作说明，将过滤后的病毒液通过CsCl密度梯度离心法进行纯化，纯化病毒液中加入终浓度为5％的甘油，分装保存至-80℃冰箱中。
4、重组病毒与游离受体鉴定
经透射电子显微镜观察，制备的重组病毒rAAV-CD163-Sn直径大小约22nm，具有典型的腺相关病毒形态(图3)；将rAAV-CD163-Sn转导PK-15细胞(MOI＝100)，72h后收集细胞培养物，在-80℃冰箱和37℃水浴中反复冻融3次，12000×g离心15分钟，收集上清进行蛋白质凝胶电泳，利用羊抗猪IgG进行Western-blot检测，结果显示可观察到预期的SRCR59-Fc和Sn4D-Fc蛋白条带(图4)，说明表达的两种游离能够在剪切肽作用下分离，并且具有生物活性，可以用于抗PRRSV感染相关研究。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 盐城师范学院
<120> 一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aaggatccgt tggaggggac attccct 27
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gggtcgactc atttaccctg agtcttgga 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggaagcttat ggacttcctg ctcctgct 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttagatcttc atttaccctg agtcttgga 29