阅读说明：本技术 一种含紫苏醛和钙离子螯合剂edta的黄曲霉防治用组合物及其应用 (Aspergillus flavus prevention and treatment composition containing perillaldehyde and calcium ion chelating agent EDTA and application thereof ) 是由 刘裴清 陈庆河 李本金 王荣波 翁启勇 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物及其应用。该组合物包括A组分和B组分,组分A为紫苏醛,组分B为钙离子螯合剂EDTA,紫苏醛的浓度为100μg/L-1000μg/L,钙离子螯合剂EDTA的浓度为200μg/L-1000μg/mL。本发明的组合物具有强抑制花生黄曲霉的作用,能用于制备防治花生黄曲霉的药物。本发明的紫苏醛来源于天然,无毒副作用,不易导致病原微生物产生抗耐药性,能用于防治花生黄曲霉病；其对人畜安全,是一种低毒、有效的抑菌生物农药。用紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA作为花生黄曲霉杀菌剂有巨大的潜力。(The invention provides a composition containing perillaldehyde and a calcium ion chelating agent EDTA for preventing and treating aspergillus flavus and application thereof. The composition comprises a component A and a component B, wherein the component A is perillaldehyde, the component B is a calcium ion chelating agent EDTA, the concentration of the perillaldehyde is 100 mug/L-1000 mug/L, and the concentration of the calcium ion chelating agent EDTA is 200 mug/L-1000 mug/mL. The composition has the effect of strongly inhibiting the peanut aspergillus flavus, and can be used for preparing the medicine for preventing and treating the peanut aspergillus flavus. The perillaldehyde is natural, has no toxic or side effect, is not easy to cause pathogenic microorganisms to generate anti-drug resistance, and can be used for preventing and treating the peanut yellow aspergillosis; it is safe to human and livestock, and is a low-toxicity and effective bacteriostatic biological pesticide. The perilla aldehyde and the calcium ion chelating agent EDTA have great potential as the peanut aspergillus flavus bactericide.)

一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物及 其应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的花生黄曲霉防治用组合物及其应用。

背景技术

黄曲霉是植物、动物和人类的病原体，每年造成的损失达到数百亿美元。全球每年约有1/4以上的农作物受黄曲霉菌污染，在谷物收获后的储存和运输过程中，黄曲霉菌株可以侵染谷物，并产生大量的致癌和急性毒性化合物—黄曲霉毒素。通常情况下，油料作物中的花生及其制品被污染的机会最多。多年来，人们对黄曲霉的防治主要以化学防治为主，然而由于化学农药大多是非自然存在的物质，且常不易降解，残留期较长，对自然生态具有破坏性作用，易形成公害，有些甚至危及人类健康。因此，在植物中寻找生物活性物质或直接开发植物源农药已成为当今农药研究领域的热点之一。目前，国内外关于植物精油或者植物活性成分抗不同的敏感或者耐药病原菌已有了大量研究。药用植物作为一种具有治疗潜力的资源己经得到了历史的证明。紫苏(Perilla frutescens)，一年生草本植物，历来被当作传统药物使用，是一种受欢迎的叶类蔬菜。紫苏具有清热解毒、抑制真菌生长的功效。紫苏醛(Peri11a1dehyde，PAE)是一种天然单萜化合物，为无色至浅黄色液体，大量存在于紫苏中。目前，已有研究表明紫苏醛能够抑制黄曲霉菌等不同真菌的生长及产孢，同时也能激活植物的免疫防卫反应。然而，紫苏醛属于精油类物质，易挥发消散，不利于其在农产品或农作物长期储存中应用。大量研究表明， 丝状真菌的生长是以菌丝细胞的顶端生长为基础，Ca²⁺作为重要的第二信使分子参与了菌丝顶端生长的调节作用。但是，EDTA作为一种常用的钙离子螯合剂，其抑制真菌菌丝生长及产孢的作用研究较少。目前，国内外未见EDTA对紫苏醛抑菌的促进作用研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物，包括A组分和B组分，其中A组分为紫苏醛；B组分为钙离子螯合剂EDTA。

上述组合物中所述的紫苏醛的浓度为100µg/L-1000µg/L，所述钙离子螯合剂EDTA的浓度为200µg/L-1000 µg/L。

优选的，上述组合物中所述的紫苏醛的浓度为100µg/L，所述钙离子螯合剂EDTA的浓度为200µg/L。

上述一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物的制备方法，包括以下步骤：按组合物中各组分浓度要求称取相应重量组分原料，所述A组分紫苏醛固体先溶于1倍体积的无水乙醇，再加入无菌水使之完全溶解形成A组分溶液，将A组分溶液与所述B组分混合，定容，制成含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物。

上述种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物用于黄曲霉的防治中。

一种含有上述一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物的农药。

上述农药在防治黄曲霉病中的应用。

本发明的有益效果是:

本发明含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物，属杀真菌性农药，通过紫苏醛与钙离子螯合剂EDTA之间的协同增效作用，有效抑制黄曲霉的生长，产孢，促进对萌发孢子的自噬作用，用于黄曲霉防治作用显著。

附图说明：

图1不同处理对黄曲霉菌丝生长、产孢子的影响。A：黄曲霉菌丝生长情况；B：黄曲霉产孢子情况。

图2不同处理对黄曲霉菌孢子萌发及胞内Ca²⁺浓度的影响。A：黄曲霉菌孢子萌发情况；B：黄曲霉菌胞内Ca²⁺浓度。

图3不同处理对黄曲霉自噬的影响。MDC+EB：MDC+EB双染色荧光显微图；BrightField：明视野显微图。

图4 不同处理花生黄曲霉病的发病情况图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物，包括A组分和B组分，所述A组分为紫苏醛（上海邦成化工，CAS#: 2111-75-3），所述B组分为钙离子螯合剂EDTA；其中所述A组分的浓度为100µg/L ，B组分的浓度为200µg/L。

上述含紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA的黄曲霉防治用组合物的制备方法，包括以下步骤：按组合物中各组分浓度要求称取相应重量组分原料，所述A组分固体原料紫苏醛先溶于1倍体积的无水乙醇，再用无菌水使之完全溶解，然后与B组分钙离子螯合剂EDTA混合，定容，制成紫苏醛和钙离子螯合剂EDTA组合物。

实施例2

选用实施例1中的组合物，检测其对黄曲霉病菌的抑制作用。在超净工作台上，首先将福建分离获得的黄曲霉接种到PDA固体培养基上，29℃温度下，黑暗培养48-72小时后，将培养好的黄曲霉5mm的小菌碟接种到5种不同培养基中，29℃温度下，黑暗培养4-5天后采用十字交叉法统计病原菌生长速率。

5种不同培养基分别为

对照组（CK）：PDA固体培养基；

处理组1（PAE）：PDA固体培养基+100µg/L PAE；

处理组2（EDTA）：PDA固体培养基+200µg/L EDTA；

处理组3（PAE + EDTA）：PDA固体培养基+100µg/L PAE+200µg/L EDTA

处理组4（PAE +Ca²⁺）：PDA固体培养基+100µg/L PAE +1.11g/LCaCl₂。

生长速率统计发现，培养基中含有100µg/L PAE、200µg/L EDTA、和100µg/L PAE+200µg/L EDTA处理都对菌丝生长和产孢有抑制作用，但是100µg/L PAE+1.11g/LCaCl₂处理中对菌丝生长和产孢没有抑制作用（图1）。

实施例3

选用实施例1中的组合物，检测其对黄曲霉病菌孢子萌发及胞内钙离子浓度的抑制作用。在超净工作台上，首先将福建分离黄曲霉接种到PDA固体培养基上，29℃温度下，黑暗培养5-7天后，收集孢子制备成1×10⁶个/mL的黄曲霉孢子悬液，取2 μL孢子悬液接种到终浓度分别为100µg/L PAE、200µg/L EDTA、100µg/L PAE+200µg/L EDTA和100µg/L PAE PAE+1.11g/LCaCl₂的PDA平板上，29℃温度下，黑暗培养5-6小时后统计萌发率并拍照，以水处理为对照。萌发率统计发现，100µg/L PAE、200µg/L EDTA、100µg/L PAE+200µg/L EDTA处理都对萌子萌发有抑制作用，但是100µg/L PAE+1.11g/LCaCl₂处理中对孢子萌发没有抑制作用（图2A）。进一步用萌发孢子进行FAM-3钙离子荧光染色，结果发现，100µg/L PAE+200µg/LEDTA处理中基本没有荧光（图2B）。

实施例4

选用实施例1中的组合物，检测其对黄曲霉自噬的影响。在超净工作台上，首先将黄曲霉接种到PDA固体培养基上，29℃温度下，黑暗培养5-7天后，收集孢子制备成1×10⁶个/mL的黄曲霉孢子悬液，取2 μL孢子悬液液接种到终浓度分别为100µg/L PAE、200µg/L EDTA、100µg/L PAE+200µg/L EDTA和100µg/L PAE PAE+1.11g/LCaCl₂的PDA平板上，29℃温度下，黑暗培养5-6小时后对萌发孢子进行细胞自噬染色（MDC+ED双染），以水处理为对照。结果发现，100µg/L PAE、200µg/L EDTA、100µg/L PAE+200µg/L EDTA处理都对萌子有自噬作用，但是100µg/L PAE+200µg/L EDTA处理中最明显（图3）。

实施例5

选用100µg/L PAE、200µg/L EDTA和100µg/L PAE+200µg/L EDTA，检测其对黄曲霉病害发生的抑制作用。首先，将配制好的组合物以喷雾法处理超市购买的花生，29℃温度下，黑暗诱导处理6小时后，然后用2 μL 1×10⁵个/mL黄曲霉孢子悬液接种花生，29℃温度下，6天后观察花生曲霉病的发病情况，以确定其对病害发生的抑制作用，同时以喷雾清水作为对照。实验结果统计分析发现，100µg/L PAE、200µg/L EDTA和100µg/L PAE+200µg/L EDTA处理对病害都有抑制作用，但100µg/L PAE+200µg/L EDTA的效果最好，发病花生中孢子量仅为CK的11.47%，抑制率达到了88.53 %（接种后5天，抑制率就是把不同处理的花生放到等量水中，通过涡旋把孢子洗到水里，通过显微计数计算孢子产量，然后通过与CK比较算出抑制率）（图4）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制木发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。