一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用
阅读说明：本技术 一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用 (endoglucanase expression vector and construction method and application thereof ) 是由 王洪成 沙冲 邵蔚蓝 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程领域,具体涉一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。本发明提供一种内切葡聚糖酶表达载体,其筛选基因为大肠杆菌glmS基因,原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌,转化E.coliΔglmS后生产的蛋白只有大肠杆菌自身蛋白和内切葡聚糖酶蛋白而不含有抗生素等其它外来蛋白,具有相对的安全性；经过发酵和高温灭活处理,既可以消除大肠杆菌的毒性,又可以保证本酶活性的存在；使得来源于热纤梭菌(C.thermocellum ATCC 27405)的CelD基因实现生物安全性高效表达。本发明所提供的载体构建方法简单,安全性好,成本低,具有较高的表达量,可为饲用内切葡聚糖酶的生物发酵提供批量、低价、高质量的原材料。(The invention relates to the field of bioengineering, in particular to endoglucanase expression vectors, a construction method and an application thereof, the invention provides endoglucanase expression vectors, wherein a screening gene of the endoglucanase expression vectors is an escherichia coli glmS gene, a prokaryotic host cell is glmS gene defective escherichia coli, and a protein produced after E.coli delta glmS is converted only contains escherichia coli self protein and endoglucanase protein but does not contain other foreign proteins such as antibiotics and the like, so that the endoglucanase expression vectors have relative safety, can eliminate the toxicity of the escherichia coli and ensure the existence of the activity of the enzyme through fermentation and high-temperature inactivation treatment, and can realize the high-efficiency expression of biological safety of a CelD gene from clostridium thermocellum ATCC 27405.)
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。
背景技术
内切葡聚糖酶（CelD）和纤维二糖酶（CelS）作为热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）纤维小体中酶活性最高的内切纤维素酶和外切纤维素酶组分，常作为饲料酶使用，目前，饲料酶的工业化生产主要采用真核细胞发酵方法，但是真核发酵生产往往没有原核生物细胞生产的成本低，由于原核生物如大肠杆菌的自身毒素和表达载体中含有抗药基因的问题，利用原核细胞工业化生产饲料酶一直未实现。
分子生物学技术的发展使得利用宿主细胞表达并大规模生产重组蛋白成为可能，利用基因表达方法构建表达载体实现饲料酶的原核细胞的安全性表达成了热点问题。但是，在利用原核生物细胞表达目标蛋白时，主要采用抗生素或者营养缺陷型筛选标记来生产目标蛋白，抗生素存在抗药性问题，而营养缺陷型筛选标记容易发生回复突变。
谷氨酰胺:6-磷酸果糖氨基转移酶(Gfa)又称6-磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm)，它是一种胞内酶，催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸，即氨基已糖合成代谢途径中的第一步反应。Gfa几乎存在于每个物种和组织中，是生命活动所必需的。尚未发现有以大肠杆菌自身的glmS 基因作为筛选标记实现饲料酶-内切葡聚糖酶的原核细胞工业化生产相关的研究与报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。本发明对来源于热纤梭菌的内切葡聚糖酶进行原核表达，表达载体由无抗生素标记的生物安全性glmS基因作为筛选基因，转化至glmS缺失菌株E.coliΔglmS后生产内切纤维素酶，由于内切纤维素的热稳定性，加热处理消除大肠杆菌自身蛋白的毒性，并且保留目标蛋白的活性来实现饲料酶的原核细胞的生物安全性表达。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：
在一些实施方案中，本发明提供了一种内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。所述表达载体pHsh-GcelD的筛选基因为大肠杆菌glmS基因，原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌。大肠杆菌glmS基因与pHsH-Amp载体片段连接后获得pHsh-GlmS质粒载体，将内切纤维素酶celD基因***到pHsh-GlmS质粒载体后转化至glmS基因缺陷型大肠杆菌后提取。
在一些实施方案中，本发明提供了上述内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD的构建方法，具体包括以下步骤：
（1）以大肠杆菌为模板扩增glmS基因cDNA片段，以pHsH-Amp为模板扩增得到pHsh载体片段，将磷酸化的glmS基因cDNA片段与pHsh载体片段平端连接后转化至gfa缺失型大肠杆菌中，筛选得到pHsh-GlmS质粒；
（2）以C.thermocellum基因组为模板扩增celD基因片段，将celD基因片段***到步骤（1）中得到的pHsh-GlmS质粒，平端连接后转化至大肠杆菌E. coliΔglmS中，挑取转化子，测序后得到表达载体pHsh-GcelD。
步骤（1）中，所述扩增glmS基因cDNA片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示，扩增pHsh载体片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3和4所示；
步骤（1）中，所述平端连接时glmS基因cDNA片段与pHsh载体片段的摩尔比为3：1。
步骤（2）中，所述扩增celD基因片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和6所示，扩增pHsh-GlmS载体片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和8所示。
步骤（2）中，所述将celD基因片段***到步骤（1）中得到的pHsh-GlmS质粒为将celD基因片段***到pHsh-GlmS质粒的Hsh启动子表达框中。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种大肠杆菌重组菌，所述的重组菌为将pHsh-GcelD质粒转化到大肠杆菌E.coliΔgfa菌株中，得到大肠杆菌重组菌。
在一些实施方案中，本发明提供了上述内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD在发酵领域的应用，具体应用于发酵制备饲料和/或饲料添加剂。将pHsh-GcelD载体在大肠杆菌中表达并发酵后生产的内切纤维素酶无抗生素以及毒素残留。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种内切葡聚糖酶表达载体，其筛选基因为大肠杆菌glmS基因，原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌，转化E. coli ΔglmS后生产的蛋白只有大肠杆菌自身蛋白和内切葡聚糖酶蛋白而不含有抗生素等其它外来蛋白，具有相对的安全性；经过发酵和高温灭活处理，既可以消除大肠杆菌的毒性，又可以保证内切葡聚糖酶的活性；使得来源于热纤梭菌（C. thermocellum ATCC 27405）的CelD基因实现生物安全性高效表达。本发明所提供的载体构建方法简单，安全性好，成本低，具有较高的表达量，可为饲用内切葡聚糖酶的生物发酵提供批量、低价、高质量的原材料，应用于饲料或饲料添加剂中安全、成本低，可溶性总糖含量高，易吸收，具有更好的经济价值。
附图说明
图1是构建的内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD示意图；
图2是pHsh-GcelD质粒转化大肠杆菌后胞内蛋白的SDS-PAGE检测图；图中，M是DNA分子量标准，泳道1代表空载转化大肠杆菌，泳道2代表pHsh-GcelD转化大肠杆菌后的胞内蛋白表达。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
实施例1
本实施例中所用的L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶（glmS）基因组序列为NC_000913.3，来源于大肠杆菌strK-12 substr。MG1655（菌株：K-12，亚菌株：MG1655）根据已公布的基因组信息设计引物，上游引物GCDS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，即:ATGTGTGGAATTGTTGGCGCG，下游引物GCDS-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，即:TTACTCAACCGTAACCGATTTTG。以提取的大肠杆菌的基因组DNA为模板，采用常规PCR扩增程序扩增得到glmS基因cDNA片段，割胶回收并用T4磷酸化激酶（购自Takara公司，货号2021）磷酸化处理glmS基因cDNA片段，备用。PCR扩增参数为：95℃变性5 min，加PrimeSTAR HS DNA聚合酶；98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸2 min 30 s，循环30次，4℃保温。
根据pHsH-Amp（GenBank: FJ571619.1，购买自仙奕生物科技有限公司）序列设计引物对，上游引物pHsh-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3示，即：CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA，下游引物pHsh-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，即:ACTCTTCCTTTTTCAATAT。以pHsH-Amp为模板，采用常规PCR扩增程序扩增得到载体片段，割胶回收载体片段并纯化备用。PCR扩增参数为：95℃变性5 min，加PrimeSTAR HS DNA聚合酶（购买自takara公司）；98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸2 min，循环30次；4℃保温。按照T4 DNA连接酶的要求进行平端连接，将磷酸化的glmS基因cDNA片段与pHsh-Amp载体片段按摩尔数3：1比例混合，16℃连接过夜，转化E. coliΔglmS感受态细胞（购买自仙奕生物科技有限公司）中，挑取单菌落接种于不含抗生素的LB固体培养基上，观察来源于大肠杆菌自身的glmS基因能否挽救E. coliΔglmS缺陷型大肠杆菌实现筛选功能，如果glmS基因表达后可以发挥6-磷酸果糖氨基转移酶功能，则缺陷型菌株能够在LB上正常生长。筛选能够在无抗生素的LB培养基上正常生长的活性菌落，转化子送至南京思普金生物技术公司测序，未发生碱基突变的质粒命名为pHsh-GlmS质粒。
根据GenBank已报道的C. thermocellum（ATCC 27405）内切纤维素酶基因celD的序列（GenBank: X04584.1）分别设计引物对扩增celD基因。上游引物celD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5示，即：ATGGCAAAAATAACGGAGAATTA，下游引物celD-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.6示，即：TATTGGTAATTTCTCGATTAC。以C.thermocellum基因组为模板，采用PrimeSTAR HSDNA polymerase常规PCR方法扩增目的基因celD，产物电泳检测正确后，割胶回收纯化DNA片段，磷酸化后备用。PCR扩增体系为50 μL；PCR反应条件为：98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸2 min，循环30次，72℃保温10 min。
根据pHsh-GlmS质粒设计引物对扩增载体片段，上游引物pHsh-GF的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，即：TAATAAGCTTGAAGGCCGCTTCCG，下游引物pHsh-GR的核苷酸序列如SEQID No.8所示，即：GGGTATATCT CCTTCTTGTC。以构建好的pHsh-GlmS质粒为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃变性5 min，加PrimeSTAR HS DNA聚合酶；98℃变性10 s，56℃退火15s，72℃延伸2 min 30 s，循环30次；4℃保温。采用平端连接方法将celD基因片段***到pHsh-GlmS质粒的Hsh启动子表达框中，连接液电击转化至E. coliΔglmS中，挑取转化子，提取质粒送南京思普金生物技术公司测序，最终得到pHsh-GcelD质粒，核苷酸序列如SEQID No.9所示。图1是构建的内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD示意图。
实施例2
本实施例利用构建的载体转化宿主细胞进行发酵实验和酶活测定。将实施例1中制备的pHsh-GcelD质粒转化到E.coli ΔglmS菌株，在LB培养基中培养种子液1L，然后接种到50L发酵罐中使用TB培养基进行发酵，发酵条件为：30 ℃过夜培养，然后42 ℃快速通温，热激细胞，继续发酵10小时左右。经测定发酵的最终OD600最高可达到50左右。采用CMC酶活测定方法：以0.5% CMC为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色。测得结果显示酶活最高为50 U/ml。由于内切葡聚糖酶具有热稳定性，在70℃一小时仍可以保持活性在80%以上，在发酵完成后，通过70℃热处理40分钟灭活大肠杆菌，获得粗酶液。
对转化表达载体pHsh-GcelD细胞中胞内蛋白的表达情况进行SDS-PAGE分析；图2是pHsh-GcelD质粒转化大肠杆菌后胞内蛋白的SDS-PAGE检测图；图中，M是DNA分子量标准，泳道1代表空载pHsh-GlmS转化大肠杆菌，泳道2代表pHsh-GcelD转化大肠杆菌后的胞内蛋白表达。由图2可见，内切纤维素酶celD的分子量为60 kD左右，目标蛋白纤维素内切酶的表达量占到了整个细胞总蛋白的30%左右，实现了目标蛋白的有效表达。
实施例3
在本实施例中对实施例2所得到的粗酶液对动物性饲料品质的影响进行探究。将制备的粗酶液按照1：6的体积与无菌麸皮混合，48小时后测定麸皮中的成分变化。分别采用试剂盒方法进行呕吐毒素检测，黄曲霉毒素B1检测以及玉米赤霉烯酮检测。三种检测试剂盒均购自江苏维赛生物科技生物发展有限公司。检测后发现加入粗酶液后均未检测到上述三种毒素的存在。通过，采用苯酚-H2SO4法测定可溶性总糖的含量，发现总糖含量提升了10%~20%。纤维素内切酶的存在可以提高纤维素的降解效果和可溶性总糖含量，使得饲养动物更易吸收营养成分。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtgtggaa ttgttggcgc g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttactcaacc gtaaccgatt ttg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcttcctt tttcaatat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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gggtatatct ccttcttgtc 20
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<211> 5152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccccttgaa tgtgggggaa acatccccat gatccaatga cctgttaacc gtcgacaaga 60
aggagatata cccatggcaa aaataacgga gaattatcaa tttgattcac gaatccgttt 120
aaactcaata ggttttatac cgaaccacag caaaaaggcg actatagctg caaattgttc 180
aaccttttat gttgttaaag aagacggaac aatagtgtat accggaacgg caacttcaat 240
gtttgacaat gatacaaaag aaactgttta tattgctgat ttttcatctg ttaatgaaga 300
aggaacgtac tatcttgccg tgccgggagt aggaaaaagc gtaaacttta aaattgcaat 360
gaatgtatat gaggatgctt ttaaaacagc aatgctggga atgtatttgc tgcgctgcgg 420
caccagtgtg tcggccacat acaacggaat acactattcc catggaccgt gccatactaa 480
tgatgcatat cttgattata taaacggaca gcatactaaa aaagacagta caaaaggctg 540
gcatgatgcg ggcgactaca acaaatatgt ggtaaacgcc ggcataaccg ttggttcaat 600
gttcctggcg tgggagcatt ttaaagacca gttggagcct gtggcattgg agattcccga 660
aaagaacaat tcaataccgg attttcttga tgaattaaaa tatgagatag actggattct 720
taccatgcaa taccctgacg ggagcggaag ggtggctcat aaagtttcga caaggaactt 780
tggcggcttt atcatgcctg agaacgaaca cgacgaaaga tttttcgtgc cctggagcag 840
tgccgcaacg gcagactttg ttgccatgac ggccatggct gcaagaatat tcaggcctta 900
tgatcctcaa tatgctgaaa aatgtataaa tgcggcaaaa gtaagctatg agtttttgaa 960
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tgtcagtgat gcagatgaca gattgtgggc ggcggctgaa atgtgggaga ccctgggaga 1080
tgaagaatac cttagagatt ttgaaaacag ggcggcgcaa ttctcgaaaa aaatagaagc 1140
cgattttgac tgggataatg ttgcaaactt aggtatgttt acatatcttt tgtcagaaag 1200
accgggcaag aatcctgctt tggtgcagtc aataaaggat agtctccttt ccactgcgga 1260
ttcaattgtg aggaccagcc aaaaccatgg ctatggcaga acccttggta caacatatta 1320
ctggggatgc aacggcacgg ttgtaagaca gactatgata cttcaggttg cgaacaagat 1380
ttcacccaac aatgattatg taaatgctgc tctcgatgcg atttcacatg tatttggaag 1440
aaactattac aacaggtctt atgtaacagg ccttggtata aatcctccta tgaatcctca 1500
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ttcaagatat ttgataaggg taatcgagaa attaccaata taataagctt gaaggccgct 1920
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cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 2100
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gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2280
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序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtgtggaa ttgttggcgc g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttactcaacc gtaaccgatt ttg 23
<210> 3
<211> 23
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<400> 5
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<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtatatct ccttcttgtc 20
<210> 9
<211> 5152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccccttgaa tgtgggggaa acatccccat gatccaatga cctgttaacc gtcgacaaga 60
aggagatata cccatggcaa aaataacgga gaattatcaa tttgattcac gaatccgttt 120
aaactcaata ggttttatac cgaaccacag caaaaaggcg actatagctg caaattgttc 180
aaccttttat gttgttaaag aagacggaac aatagtgtat accggaacgg caacttcaat 240
gtttgacaat gatacaaaag aaactgttta tattgctgat ttttcatctg ttaatgaaga 300
aggaacgtac tatcttgccg tgccgggagt aggaaaaagc gtaaacttta aaattgcaat 360
gaatgtatat gaggatgctt ttaaaacagc aatgctggga atgtatttgc tgcgctgcgg 420
caccagtgtg tcggccacat acaacggaat acactattcc catggaccgt gccatactaa 480
tgatgcatat cttgattata taaacggaca gcatactaaa aaagacagta caaaaggctg 540
gcatgatgcg ggcgactaca acaaatatgt ggtaaacgcc ggcataaccg ttggttcaat 600
gttcctggcg tgggagcatt ttaaagacca gttggagcct gtggcattgg agattcccga 660
aaagaacaat tcaataccgg attttcttga tgaattaaaa tatgagatag actggattct 720
taccatgcaa taccctgacg ggagcggaag ggtggctcat aaagtttcga caaggaactt 780
tggcggcttt atcatgcctg agaacgaaca cgacgaaaga tttttcgtgc cctggagcag 840
tgccgcaacg gcagactttg ttgccatgac ggccatggct gcaagaatat tcaggcctta 900
tgatcctcaa tatgctgaaa aatgtataaa tgcggcaaaa gtaagctatg agtttttgaa 960
gaacaatcct gcgaatgttt ttgcaaacca gagtggattc tcaacaggag aatatgccac 1020
tgtcagtgat gcagatgaca gattgtgggc ggcggctgaa atgtgggaga ccctgggaga 1080
tgaagaatac cttagagatt ttgaaaacag ggcggcgcaa ttctcgaaaa aaatagaagc 1140
cgattttgac tgggataatg ttgcaaactt aggtatgttt acatatcttt tgtcagaaag 1200
accgggcaag aatcctgctt tggtgcagtc aataaaggat agtctccttt ccactgcgga 1260
ttcaattgtg aggaccagcc aaaaccatgg ctatggcaga acccttggta caacatatta 1320
ctggggatgc aacggcacgg ttgtaagaca gactatgata cttcaggttg cgaacaagat 1380
ttcacccaac aatgattatg taaatgctgc tctcgatgcg atttcacatg tatttggaag 1440
aaactattac aacaggtctt atgtaacagg ccttggtata aatcctccta tgaatcctca 1500
tgacagacgt tcaggggctg acggaatatg ggagccgtgg cccggttacc ttgtaggagg 1560
aggatggccc ggaccgaagg attgggtgga tattcaggac agttatcaga ccaatgaaat 1620
tgctataaac tggaatgcgg cattgattta tgcccttgcc ggatttgtca actataattc 1680
tcctcaaaat gaagtactgt acggagatgt gaatgatgac ggaaaagtaa actccactga 1740
cttgactttg ttaaaaagat atgttcttaa agccgtctca actctccctt cttccaaagc 1800
tgaaaagaac gcagatgtaa atcgtgacgg aagagttaat tccagtgatg tcacaatact 1860
ttcaagatat ttgataaggg taatcgagaa attaccaata taataagctt gaaggccgct 1920
tccgaaagga agcggctttt ttgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 1980
atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 2040
cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 2100
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 2160
tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 2220
gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2280
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 2340
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgtgtggaat tgttggcgcg 2400
atcgcgcaac gtgatgtagc agaaatcctt cttgaaggtt tacgtcgtct ggaataccgc 2460
ggatatgact ctgccggtct ggccgttgtt gatgcagaag gtcatatgac ccgcctgcgt 2520
cgcctcggta aagtccagat gctggcacag gcagcggaag aacatcctct gcatggcggc 2580
actggtattg ctcacactcg ctgggcgacc cacggtgaac cttcagaagt gaatgcgcat 2640
ccgcatgttt ctgaacacat tgtggtggtg cataacggca tcatcgaaaa ccatgaaccg 2700
ctgcgtgaag agctaaaagc gcgtggctat accttcgttt ctgaaaccga caccgaagtg 2760
attgcccatc tggtgaactg ggagctgaaa caaggcggga ctctgcgtga ggccgttctg 2820
cgtgctatcc cgcagctgcg tggtgcgtac ggtacagtga tcatggactc ccgtcacccg 2880
gataccctgc tggcggcacg ttctggtagt ccgctggtga ttggcctggg gatgggcgaa 2940
aactttatcg cttctgacca gctggcgctg ttgccggtga cccgtcgctt tatcttcctt 3000
gaagagggcg atattgcgga aatcactcgc cgttcggtaa acatcttcga taaaactggc 3060
gcggaagtaa aacgtcagga tatcgaatcc aatctgcaat atgacgcggg cgataaaggc 3120
atttaccgtc actacatgca gaaagagatc tacgaacagc cgaacgcgat caaaaacacc 3180
cttaccggac gcatcagcca cggtcaggtt gatttaagcg agctgggacc gaacgccgac 3240
gaactgctgt cgaaggttga gcatattcag atcctcgcct gtggtacttc ttataactcc 3300
ggtatggttt cccgctactg gtttgaatcg ctagcaggta ttccgtgcga cgtcgaaatc 3360
gcctctgaat tccgctatcg caaatctgcc gtgcgtcgta acagcctgat gatcaccttg 3420
tcacagtctg gcgaaaccgc ggataccctg gctggcctgc gtctgtcgaa agagctgggt 3480
taccttggtt cactggcaat ctgtaacgtt ccgggttctt ctctggtgcg cgaatccgat 3540
ctggcgctaa tgaccaacgc gggtacagaa atcggcgtgg catccactaa agcattcacc 3600
actcagttaa ctgtgctgtt gatgctggtg gcgaagctgt ctcgcctgaa aggtctggat 3660
gcctccattg aacatgacat cgtgcatggt ctgcaggcgc tgccgagccg tattgagcag 3720
atgctgtctc aggacaaacg cattgaagcg ctggcagaag atttctctga caaacatcac 3780
gcgctgttcc tgggccgtgg cgatcagtac ccaatcgcgc tggaaggcgc attgaagttg 3840
aaagagatct cttacattca cgctgaagcc tacgctgctg gcgaactgaa acacggtccg 3900
ctggcgctaa ttgatgccga tatgccggtt attgttgttg caccgaacaa cgaattgctg 3960
gaaaaactga aatccaacat tgaagaagtt cgcgcgcgtg gcggtcagtt gtatgtcttc 4020
gccgatcagg atgcgggttt tgtaagtagc gataacatgc acatcatcga gatgccgcat 4080
gtggaagagg tgattgcacc gatcttctac accgttccgc tgcagctgct ggcttaccat 4140
gtcgcgctga tcaaaggcac cgacgttgac cagccgcgta acctggcaaa atcggttacg 4200
gttgagtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 4260
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 4320
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 4380
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 4440
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agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 4560
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tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 4800
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 4860
cttccagggg gaaacgcctg ggtatcttta tagtcctgtc ggggtttcgc acctctgact 4920
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 4980
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 5040
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 5100
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagagag gaagcggaag ag 5152