阅读说明：本技术 一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法 (Callus induction and efficient regeneration method for curcuma species of curcuma longa ) 是由 毛俐慧 邹清成 董青 史小华 胡伟 曹雪蕊 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法,以姜荷花玉如意种球萌发出的芽点作为外植体,或者以姜荷花玉如意的嫩叶叶鞘作为外植体,消毒,暗培养后产生愈伤组织,两周后愈伤组织块接入新配的愈伤诱导培养基进行增殖,再过两周后转入愈伤再分化成芽培养基,再过两周后进行继代。愈伤诱导培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L BA+0.3mg/L 2,4-D,蔗糖30g/L,琼脂0.6g/L,遮光暗培养,温度为26±2℃；愈伤再分化成芽培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA,蔗糖30g/L,琼脂0.6g/L,光照时间为16h每天,温度为26±2℃,光照强度1900-5000 LX；继代培养基为：MS,0.5mg/L BA,蔗糖30g/L,琼脂0.6g/L,光照时间为16h每天,温度为26±2℃。本发明通过愈伤诱导和分化的方法进行姜荷花“玉如意”的组培,繁殖效率大大提高。(The invention discloses a callus induction and efficient regeneration method of a curcuma lotus variety jade Ruyi, which takes bud points emitted by the sprouting of the curcuma lotus jade Ruyi as explants or young leaf sheaths of the curcuma lotus jade Ruyi as explants, disinfects and performs dark culture to generate callus, a callus block is inoculated into a newly-prepared callus induction culture medium for proliferation after two weeks, then is transferred into callus to be differentiated into a bud culture medium after two weeks, and then is subjected to subculture after two weeks. The callus induction culture medium is: MS +0.5mg/L TDZ +0.5mg/L BA +0.3 mg/L2, 4-D, sucrose 30g/L and agar 0.6g/L, and culturing in dark in shade at 26 +/-2 ℃; the callus re-differentiation into bud culture medium is as follows: MS +0.5mg/L TDZ +2.0mg/L BA +0.2mg/L NAA, 30g/L sucrose and 0.6g/L agar, wherein the illumination time is 16h per day, the temperature is 26 +/-2 ℃, and the illumination intensity is 1900-; the subculture medium is: MS,0.5mg/L BA, 30g/L sucrose and 0.6g/L agar, the illumination time is 16h per day, and the temperature is 26 +/-2 ℃. The invention carries out the tissue culture of the curcuma alismatifolia 'Jaruyi' by a callus induction and differentiation method, and greatly improves the propagation efficiency.)

一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法

技术领域

本发明涉及一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法。

背景技术

姜荷花‘玉如意’（Curcuma hybrid‘Laddawan’），为女王郁金与姜荷花的杂交种（Curcuma alismatifolia x Curcuma cordata）。其植株形态和花型与传统姜荷花品种差别较大，玉如意柱状花序，花期长，植株高，叶片宽可做观叶地被，花色为独特的淡粉色。

玉如意观赏价值高，但是存在种球的价格高昂，大面积推广困难的问题。组织培养高效繁殖技术对于大面积推广应用十分必要，但目前还未对玉如意的组培方法进行研究。

目前已有关于姜荷花组织培养的现有技术申请，但是“玉如意”是姜荷花与女王郁金的杂交种，与传统姜荷花具有很大差别，并且现有技术主要是不经过愈伤诱导，直接进行芽诱导的。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法。

一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法，

以姜荷花玉如意种球萌发出的芽点作为外植体，70%酒精消毒30s后0.1%升汞消毒10分钟，蒸馏水清洗4次，暗培养一周后产生愈伤组织，两周后愈伤组织块接入新配的愈伤诱导培养基进行增殖，再过两周（即4周）后转入愈伤再分化成芽培养基，再过两周（即6周）后进行继代；

愈伤诱导培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L BA+0.3mg/L 2,4-D，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，遮光暗培养，温度为26±2℃。

愈伤再分化成芽培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±2℃，光照强度1900-5000 LX；

继代培养基为：MS, 0.5mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±2℃。

另外一种姜荷花品种玉如意愈伤诱导及高效再生的方法，以姜荷花玉如意的嫩叶叶鞘作为外植体，70%酒精消毒30s, 0.1%升汞消毒6分钟，无菌水清洗4次；将外植体接种到愈伤组织诱导MS培养基+激素组合2.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度为27±2℃，暗培养，在两周后诱导出愈伤组织；

两周后愈伤组织块接入新配的愈伤诱导培养基进行增殖，再过两周（即4周）后转入愈伤再分化成芽培养基，再过两周（即6周）后进行继代；

愈伤诱导培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L BA+0.3mg/L 2,4-D，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，遮光暗培养，温度为26±2℃。

愈伤再分化成芽培养基为：MS+0.5mg/L TDZ+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±2℃，光照强度1900-5000 LX；

继代培养基为：MS, 0.5mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±2℃。

本发明的有益效果：

本发明通过愈伤诱导和分化的方法进行姜荷花“玉如意”的组培，繁殖效率大大提高。另外，植物愈伤组织具有多方面的作用，①愈伤组织是种质保存的新材料，② 愈伤组织是植物遗传改良和基因工程的理想材料，③如进行秋水仙素加倍育种、化学诱变育种、转基因分子育种时常以愈伤组织做材料以获得更高的成功率。

附图说明

图1是姜荷花‘玉如意’田间照片。

图2是姜荷花“玉如意”愈伤组织。

图3是叶鞘外植体诱导愈伤。

图4是姜荷花“玉如意”愈伤分化。

图5是继代8周后健康生长的新分化苗。

图6是组培苗在大棚内炼苗。

图7是室外健康生长且地下种球已开始膨大的植株。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。

本发明通过愈伤诱导进行姜荷花“玉如意”品种的组织培养，大大提高扩繁效率。姜荷花‘玉如意’田间照片，如图1所示。

实施例1

本发明以姜荷花‘玉如意’种球萌发出的芽点作为外植体，暗培养进行愈伤组织诱导，70%酒精消毒30s后0.1%升汞消毒10分钟，蒸馏水清洗4次，暗培养一周后产生愈伤组织，两周后进行继代增殖。结果表明，合适的激素配比可以高效诱导出愈伤组织。姜荷花“玉如意”愈伤组织如图2所示。

愈伤诱导培养基为：0.5mg/L TDZ+0.5mg/L BA+0.3mg/L 2,4-D，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照条件为遮光暗培养，温度为26±2℃，光照强度1900-5000 LX。愈伤继代增殖培养基同上。

愈伤再分化成芽培养基为：0.5mg/L TDZ+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±℃，光质1900-5000 LX。姜荷花“玉如意”愈伤组织分化如图4所示。

分化芽继代培养基选用：0.5mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±2℃。继代后成苗如图5所示。

6周后增殖且分化倍数达到312倍。

实施例2

另外叶鞘外植体也可以诱导出愈伤，根据余智城等（余智城, 何雪娇, 林金水，等. 姜荷花组织培养快繁技术研究进展, 福建热作科技, 2019, 44(4):53-56.）的综述，姜荷花组培外植体目前以种球和芽，污染率高，本发明采用嫩叶叶鞘作为外植体，酒精消毒30s, 0.1%升汞消毒7分钟，无菌水清洗3次。将外植体接种到愈伤组织诱导MS培养基，三个对照均无污染，选用激素组合2.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度为27±2℃，暗培养，能在两周后诱导出愈伤组织（图3示箭头处）。2周后仍用2.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L BA培养基进行愈伤增殖。叶鞘诱导愈伤组织如图3所示。

愈伤再分化成芽培养基为：0.5mg/L TDZ+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±℃，光质1900-5000 LX。

继代培养基选用：0.5mg/L BA，蔗糖30g/L，琼脂0.6g/L，光照时间为16h每天，温度为26±℃。

6周后增殖且分化倍数达到81倍。

组培苗炼苗存活率达到95%以上，株高小于10cm时叶尖略有焦边现象，株高达10cm后不再有焦边现象，长势良好。组培苗炼苗如图6所示。大棚内炼苗一个月后置于室外有遮阴网处生长，约1个月后种球开始膨大至直径约0.8cm（图7）。组培苗室外生长后种球膨大如图7所示。