阅读说明：本技术 新型碱性蛋白酶抑制肽的筛选 (Screening of novel alkaline protease inhibitory peptides ) 是由 路福平 王洪彬 宋平 李雪 王玉迎 刘逸寒 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及新型碱性蛋白酶抑制肽的筛选,通过体外RNA展示筛选技术获得了芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的新型八肽抑制肽,该抑制肽能够增强液体制剂中碱性蛋白酶的稳定性,有望应用于液体酶制剂和加酶液体洗涤剂。(The invention relates to screening of novel alkaline protease inhibitory peptides, and the novel octapeptide inhibitory peptides of alkaline protease from bacillus are obtained by an in vitro RNA display screening technology, can enhance the stability of the alkaline protease in a liquid preparation, and are expected to be applied to the liquid enzyme preparation and an enzyme-added liquid detergent.)

新型碱性蛋白酶抑制肽的筛选

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的新型抑制肽的筛选。

背景技术

碱性蛋白酶在碱性条件下水解蛋白效率最高。广泛应用于洗涤、食品、医药、制革等行业，其中洗涤行业用量约占全球碱性蛋白酶需求量的。以芽孢杆菌来源为主的微生物产碱性蛋白酶是主要的液体洗涤剂添加用酶，其在碱性条件下去污能力较高，对血渍、汗渍、油渍等蛋白类污垢效果最佳。蛋白酶会由于自切而失活，因而液体含酶洗涤剂在保存过程中需要添加抑制剂，以避免碱性蛋白酶水解自身而降低洗涤性能。目前液体洗涤剂中广泛使用的蛋白酶抑制剂是硼酸类抑制剂，对环境和人体健康并不友好，根据动物毒理性试验表明硼酸类物质为第二类生殖毒性化合物，长期使用存在非常大的生殖毒性风险。因此，迫切需要开发绿色、环保和安全性高的新型碱性蛋白酶抑制剂，目前多肽类抑制剂是一个主要的研究方向。

本发明工作试图通过mRNA体外展示技术筛选获得碱性蛋白酶的抑制肽。mRNA体外展示技术，在筛选效能上具有高库容量高灵敏度等优势。其核心技术特征在于，肽库的RNA序列与其翻译的对应氨基酸序列通过连接子(linker)形成了mRNA-linker-多肽融合分子，并用于亲和肽筛选，所获亲和肽序列可以通过共价连接的cDNA的PCR扩增和高通量测序实现超高灵敏度的鉴定。在筛选过程中，mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-蛋白质融合体，能在大容量的多肽文库(10¹³～10¹⁵)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白。然而，mRNA体外展示技术的成功建立和应用却极具挑战性。国内外尚未有报道利用mRNA体外展示技术筛选碱性蛋白酶的抑制肽。

发明内容

本发明的目的在于，通过mRNA体外展示筛选技术，为芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶筛选新型的多肽类抑制剂。

本发明实现目的的技术方案如下：

通过mRNA体外展示方法初筛碱性蛋白酶的候选抑制肽，并通过对酶活抑制率的测定确定验证碱性蛋白酶的抑制肽，步骤如下：

(1)特殊设计与合成的DNA库，经过体外转录、linker光交联、体外翻译和纯化、反转录等步骤获得基因型表型融合分子库，即mRNA-linker-多肽融合分子库；

(2)通过链霉亲和素磁珠固定生物素修饰的芽孢杆菌来源碱性蛋白酶；

(3)随后将mRNA-linker-多肽融合分子库与磁珠固定的碱性蛋白酶进行孵育筛选，筛选获得的亲合肽通过PCR扩增其DNA后进入下一轮筛选。

(4)经多轮筛选最终捕获得到高亲和力的融合分子，并通过PCR扩增和DNA测序实现候选抑制肽的序列鉴定。

(5)测定抑制肽对芽孢来源碱性蛋白酶酶活的抑制率，确认抑制肽对碱性蛋白酶的抑制性能。

mRNA体外展示筛选获得的芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的抑制肽，在序列上呈现如下特征，其中，从N端起N1位置氨基酸为酪氨酸或者组氨酸；N2位置为半胱氨酸或者色氨酸；N1-N7位置所含氨基酸的种类包括组氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸和谷氨酸，多肽序列的羧基端位点C1位置为酪氨酸、亮氨酸或者组氨酸。八肽序列中氨基酸位置的命名为：从N段开始各个氨基酸位置依次为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、C1。

其中，以下十种八肽对碱性蛋白酶具有较高的抑制活性，包括YCLSRDWH、HCLSRDWH、YCLSRDCH、YCLSRDWY、HCNNNNNH、HWNNNNNH、YCLSRDWH、YCLSHDWH、YCLSRAWH和YCNNNNNH。氨基酸缩写对应关系为：精氨酸，R；天冬氨酸，D；半胱氨酸，C；组氨酸，H；天冬酰胺，N；亮氨酸，L；色氨酸，W；酪氨酸，Y。氨基酸序列书写顺序为从N端到C端。

本发明的有益效果是：

(1)通过mRNA体外展示多轮筛选成功获得了多种碱性蛋白酶的新型八肽抑制剂。多肽抑制剂生物安全性高，对环境小。目前液体洗涤剂中广泛使用的蛋白酶抑制剂是硼酸类抑制剂，对环境和人体健康并不友好，动物毒理性试验表明硼酸类物质存在非常大的生殖毒性风险。

(2)其中YCLSRDWY等抑制肽对芽孢来源碱性蛋白酶活性的抑制率接近现有抑制剂4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)的性能，有望将来应用于液体酶制剂和加酶液体洗涤剂中。

附图说明

图1 RNA体外展示技术所筛选八肽序列中不同位点氨基酸种类的分布图

图2 肽段对碱性蛋白酶酶活的抑制率

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：mRNA体外展示多轮筛选获得碱性蛋白酶的抑制肽

1.mRNA展示DNA文库的构建

化学合成编码随机八肽的DNA文库，并在5’端添加T7聚合酶启动子、翻译增强子和翻译起始密码子等序列，在3’端添加亲和纯化标签。DNA库具体序列为：

引物序列F：

(5’TTCTAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA 3’)R：(5’ATAGCCGGTGATGATGAT GATGATGATGGC 3’)，DNA库及引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将DNA库PCR扩增，其扩增程序为：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃10s，共30个循环；72℃10min。

2.转录

PCR产物经Cycle-Pure Kit DNA纯化试剂盒(OMEGA)纯化，采用DEPC水进行洗脱。纯化后的DNA(10ng/μL)1μL，75mM T7 ATP Solution 2μL，75mM T7 UTP Solution 2μL，75mM T7 CTP Solution 2μL，75mM T7 GTP Solution 2μL，T7 10×Reaction Buffer 2μL，T7 Enzyme Mix 2μL，混匀，37℃水浴4h。水浴反应后加入1μL DNA酶，37℃水浴反应15min，接着65℃水浴5min后立即置于冰上2min，消除RNA二级结构。经柱式RNA快速浓缩纯化试剂盒纯化后的转录产物使用5％变性丙烯酰胺胶检测RNA的生成。

3.mRNA与Linker连接

连接子(Linker)的序列为：补骨脂素(psoralen)-TAGCCGGTGAAAAAAAAAAAAAAA-(PEG)₂-ACC-嘌呤霉素(puromycin)。RNA(500ng/μL)60μL，Tris-Hcl(pH7.4，250mM)30μL，NaCl(1M)30μL，Linker(50mM)30μL，DEPC水150μL混匀，80℃水浴5min后，室温静置15min。然后用移液枪将反应液转移至96孔板中，在365nm紫外光下照射96孔板15min，乙醇沉淀回收产物，将其上样到5％变性丙烯酰胺胶并切下RNA-Linker条带，切割的凝胶使用UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒进行回收。

4.体外翻译获得mRNA-多肽融合分子

利用体外翻译试剂盒(Rabbit Reticulocyte Lysate System，普洛麦格)，加入24.5μL mRNA-Linker复合物及RNA抑制剂RNasin 1.5μL，30℃水浴1h，然后加入1M MgCl₂ 5μL，2M CH₃COOK 17μL，混匀，轻微离心，冰上孵育15min，-20℃过夜，采用Oligo-dTcellulose法纯化翻译产物。

5.反转录获得cDNA-mRNA-多肽融合分子

使用纯化过的mRNA-多肽库进行反转录，依次加入1μL下游引物、2μL mRNA-多肽库、4μL dNTP和5μL DEPC水。70℃变性5min，快速放冰上冷却，加入：5×first-stand缓冲液4μL、0.1M DTT 2μL和RNA抑制剂RNasin 1μL。42℃孵育2min后加入反转录酶1μL，混匀。25℃孵育2min，42℃孵育50min。随后进行His-Tag标签纯化，移取100μL树脂Ni-superflow于小柱中，取200μL lysis Buffer(pH 7.4)激活树脂Ni-superflow，12000rpm离心2min后弃滤液，重复一次，弃去滤液。加入反转录复合体系，冰浴30min，加入200μL wash Buffer(pH7.4)于小柱中洗去非特异性结合，12000rpm离心2min弃滤液，重复一次。再加入100μLElution Buffer(pH 7.4)于小柱中，12000rpm离心2min后收集滤液，并重复一次。

6.碱性蛋白酶的磁珠固定

使用生物素标记试剂盒(福因德科技有限公司)对克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)来源或者迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)来源的碱性蛋白酶进行生物素化修饰，移取500μL商品碱性蛋白酶液于超滤管中，加入300μL标记缓冲液。12000r/min离心10min，倒掉滤液，并重复2次，最后一次超滤完成后再加入200μL标记缓冲液和13.3μL溶解的超级生物素至上述超滤管中，混匀，放入37℃恒温箱中避光孵育30min。12000r/min离心10min，弃滤液。加入300μL标记缓冲液至上述超滤管中，并混匀，12000r/min离心10min，弃废液，重复2次，最后一次收集截留液。然后通过链霉亲和素磁珠(无锡百迈格生物科技有限公司)进行磁珠固定。取100μL(1mg)链霉亲和素磁珠充分混匀后，于磁力架上，磁液分离后，弃上清。移取500μL PBS(pH 7.4)重悬磁珠，放于磁力架，磁液分离后，弃上清，重复两次。之后用100μL PBS重悬磁珠，加入生物素化修饰的碱性蛋白酶到磁珠管内，室温震荡30min，过程中应保持磁珠处于悬浮状态，之后经磁力架，磁液分离后，将上清移至干净离心管内加入1mL PBS重悬磁珠，磁液分离后移除上清，重复两次，最后加入80μL PBS重悬磁珠，进行亲和肽的筛选。

7.亲和肽的筛选和测序

混合生物素化碱性蛋白酶与cDNA-mRNA-多肽产物，在室温下振荡30min，在磁力架上经磁液分离后移除上清，使用PBS溶液(pH 7.4)300μL反复冲洗磁珠3次，最后一次冲洗完成后加入PBS溶液100μL重悬磁珠并加入2μL Rnase A在37℃孵育1h，酚氯仿法提取DNA。获得的DNA经过PCR扩增进入下一轮筛选，经过连续3轮筛选，目标蛋白及其编码的基因序列最终得到富集和分离。对最终获得的DNA进行高通量(Illumina GA Pipeline v1.8)测序(苏州金唯智生物科技有限公司)。

筛选多肽经测序所得序列的氨基酸分布特征如图1所示，横坐标表示所筛选八肽序列中氨基酸相的位置，纵坐标中表示不同氨基酸在该位点出现的比例。从中可以看出，序列具有明显的特征，从N端起N1位置氨基酸绝大部分为酪氨酸或者组氨酸；N2位置绝大部分为半胱氨酸或者色氨酸；N1-N7位置所含氨基酸的种类包括组氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸和谷氨酸，多肽序列的羧基端位点C1位置绝大部分为酪氨酸、亮氨酸或者组氨酸。八肽序列中氨基酸位置的命名为：从N段开始各个氨基酸位置依次为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、C1。筛选多肽中亲和度最高的十种八肽序列，包括YCLSRDWH、HCLSRDWH、YCLSRDCH、YCLSRDWY、HCNNNNNH、HWNNNNNH、YCLSRDWH、YCLSHDWH、YCLSRAWH和YCNNNNNH。氨基酸缩写对应关系为：精氨酸，R；天冬氨酸，D；半胱氨酸，C；组氨酸，H；天冬酰胺，N；亮氨酸，L；色氨酸，W；酪氨酸，Y。氨基酸序列书写顺序为从N端到C端。

实施例2：八肽抑制剂对碱性蛋白酶的抑制效果

1.化学合成筛选获得的八肽抑制剂YCLSRDWH、HCLSRDWH、YCLSRDCH、YCLSRDWY和HCNNNNNH；

2.硼酸缓冲液(pH 10.5)稀释碱性蛋白酶原酶液2万倍后，分别加入上述五种抑制肽，终浓度为0.17mg/mL；对照组加入终浓度为0.17mg/mL的4-FPBA，空白组不添加任何抑制剂。根据国标GBT23527-2009测定碱性蛋白酶酶活后计算酶活抑制率。

3.酶活抑制率测定结果如图2所示。在抑制肽添加终浓度为0.17mg/mL时，多肽YCLSRDWH对碱性蛋白酶酶活抑制率为8％，多肽HCLSRDWH的抑制率为14％，多肽YCLSRDCH的抑制率为22％，多肽HCNNNNNH序列肽段的抑制率为16％，而多肽YCLSRDWY的抑制率达到了40％，接近阳性对照4-FPBA的抑制率(51％)。4-FPBA为诺维信公司发现和应用的一种新型高效碱性蛋白酶竞争性抑制剂。该结果也证明了mRNA体外展示技术可以有效筛选碱性蛋白酶的肽类抑制剂。