阅读说明：本技术 一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿及其使用方法 (Culture dish for efficiently screening pathogenic bacteria antagonistic bacteria and use method thereof ) 是由 张萍华 张艳军 陈宝婷 苏盼 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿和方法,其中培养皿包括皿盖l、皿盖2和皿体,材料是玻璃或聚碳酸酯,同时培养皿体中间含有一个多微孔结构的隔断层。本发明还提供了一种高效筛选病原菌拮抗菌的方法,包括：在培养皿A面和B面分部倒入分离菌种和培养病原菌所需的固体培养基,然后取适当稀释梯度的稀释液涂布至A面培养基,并在适宜条件下培养一定天数；将病原菌涂布至B面培养基,继续在适宜条件下培养,并观察B面抑菌圈位置,然后挑选A面上抑菌圈对应位置的菌种,即可用于复筛实验。因此该高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿结构简单,提供的方法可以将菌种分离和初筛实验同时进行,从而大大提高筛选效率,降低筛选成本。(The invention discloses a culture dish and a method for efficiently screening antagonistic bacteria of pathogenic bacteria, wherein the culture dish comprises a dish cover l, a dish cover 2 and a dish body, the culture dish body is made of glass or polycarbonate, and the middle of the culture dish body contains a partition layer with a microporous structure. The invention also provides a method for efficiently screening pathogenic bacteria antagonistic bacteria, which comprises the following steps: pouring solid culture mediums required for separating strains and culturing pathogenic bacteria into the surface A and the surface B of the culture dish in parts, then coating diluent with appropriate dilution gradient to the surface A culture medium, and culturing for a certain number of days under appropriate conditions; and coating the pathogenic bacteria on a B surface culture medium, continuously culturing under a proper condition, observing the position of a B surface inhibition zone, and then selecting strains at the corresponding position of the inhibition zone on the A surface, so that the strains can be used for a re-screening experiment. Therefore, the culture dish for efficiently screening the antagonistic bacteria of the pathogenic bacteria has a simple structure, and the provided method can simultaneously carry out strain separation and preliminary screening experiments, thereby greatly improving the screening efficiency and reducing the screening cost.)

一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿及其使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿及其使用方法。

背景技术

在自然环境中存在着各种各样的病原菌，可以造成植物、动物和人类发病。虽然科学家已经发明了很多可以有效防治病原菌的药剂，但是长期使用单一药剂容易造成病原菌产生抗药性，从而降低防治效果。因此筛选病原菌拮抗菌和发现新药剂是一项长期的、重要的工作。

目前常规的拮抗菌筛选过程主要包括：菌种分离、初筛和复筛。首先采用稀释涂布平板法对菌种进行分离，并将所有得到单菌落接种至斜面保存；其次，将得到的单菌落接种至相应的培养基平板，利用琼脂块法进行初筛；最后，利用牛津杯法对初筛得到的拮抗菌进行复筛，最终得到最佳的拮抗菌。目前的菌种分离和初筛方法费时费力，而且效率低。

发明内容

为了克服上述缺点，本发明的目的是提供一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿及其使用方法，从而提高筛选工作效率，降低实验成本。

为了达到以上目的，本发明提供一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿，其特征在于： 培养皿包括皿盖l 、皿盖2 和皿体，其中培养皿体中间含有一个多微孔结构的隔断层；培养皿正反两面均可以使用，其中一面用来进行菌种分离，而另外一面用来培养相应的病原菌。

本发明还提供了这种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿的使用方法，包括：在培养皿A面倒入分离菌种所需的固体培养基，在培养皿B面倒入培养病原菌所需的固体培养基；利用梯度稀释法对采集的样品进行稀释，然后取适当稀释梯度的稀释液涂布至培养皿A面培养基上，并在适宜条件下进行培养；取出培养一定天数的培养皿，将病原菌涂布至培养皿B面，继续放在适宜条件下培养；观察B面抑菌圈位置，然后挑选A面对应位置的菌种保存至斜面培养基保存，并用于后续复筛。

综上所述，该高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿结构简单，提供的方法可以将菌种分离和初筛实验同时进行，从而大大提高筛选效率，降低筛选成本。

附图说明

图1 一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿。

图2 塑料培养皿改造的双面培养皿。

图3 B面水稻白叶枯抑菌圈情况。

图4 初筛获得的拮抗细菌的抗菌活性验证。

具体实施方式

实施例1、一种高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿

如图1 所示，该种生物培养皿，包括皿盖l 、皿盖2 和皿体，材料是玻璃或聚碳酸酯，而且在皿体中间设置有一个多微孔结构的隔断层。与传统培养皿的显著区别在于：所述培养皿两面均可加入固体培养基，而中间隔断层既可以隔离两面的培养基，同时又不影响菌株分泌的活性物质的通过。皿体中间的多微孔结构的隔断层可以是玻璃砂芯或其他具有相同功能的材料。

参照上述方法，也可以利用现有塑料培养皿进行改造，如图2 所示。首先将两个塑料培养皿以反向方式粘合在一起，然后对粘合在一起的培养皿底部进行打孔。使用时，先在培养皿底部加入灭过菌的滤纸，再倒入固体培养基。滤纸可以起到与玻璃砂芯一样的作用。

实施例2、 利用高效筛选病原菌拮抗菌的培养皿从蚕沙中分离筛选水稻白叶枯病拮抗细菌

（一）培养基：

LB琼脂培养基（1L）：酵母提取物 5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，pH 7.0-7.2。

改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基（1L）：马铃薯300 g，蔗糖 15 g，Ca(NO₃)₂·4H₂O0.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.0g，Tryptone 5.0g，琼脂20 g，pH自然。

（二）蚕沙样品采样

在桑蚕养殖场，先在旁边空地上铺无菌牛皮纸，再铺上新鲜桑叶，从养殖床上收集一批五龄蚕于桑叶上，等待蚕宝宝在吃桑叶的同时产生蚕粪。期间不断添加桑叶。一个半小时后，戴上无菌手套，把五龄蚕轻轻移回到养殖床上，移去吃剩的桑叶与残枝，收集新鲜的蚕沙分装于50ml无菌离心管内，装入无菌塑料袋带回实验室，保存于-80℃冰箱中待用。

（三）制备蚕沙稀释液

在超净台上，称取蚕沙样品10g，放入盛有90ml 的无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使样品与水充分混合，将细胞分散，即获得10^-1稀释液；用1ml移液枪吸取1ml 10^-1稀释液加入到盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀，即获得10^-2稀释液；以此类推，依次制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7等稀释液。

（四）倒平板

将LB培养基加热融化，待培养基冷却到50℃左右时，在超净工作台以无菌操作方式将培养基缓慢倒入培养皿A面，静置；将改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基加热融化，待A面凝固后，将冷却至50℃左右的培养基在超净工作台以无菌操作方式将培养基缓慢倒入培养皿B面，静置凝固。

（五）涂布稀释液

在培养皿A面盖子上标明培养基名称及所用稀释度，用200μL 移液枪分别吸取10^-5、10^-6、10^-7稀释液0.1mL，至相应稀释度的培养皿A面，用无菌涂棒涂布均匀，室温静置5~10min，使菌液吸附进培养基。将平板倒置于37℃恒温培养箱培养。

（六）涂布病原菌

取出培养3天后的培养皿，将白叶枯病原菌涂布至培养皿B面，然后置于28℃恒温培养箱培养。

（七）观察抑菌结果

继续培养2天后，取出培养皿。观察B面抑菌圈情况（附图3），并挑选A面对应位置的菌种至斜面保存。

（八）初筛获得的拮抗细菌的抗菌活性验证

将斜面保藏的初筛拮抗菌株接种至LB固体培养基平板，37 ℃培养2天，然后用接种环挑取菌体至装有30 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，置于转速200 r/min、温度37 ℃摇床中培养，2天后离心获得菌株发酵上清液，并用牛津杯法检测其对水稻白叶枯病菌的抑菌活性，结果见附图4。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，在不脱离本发明原理的基础上，其他任何改进和修饰均应视为本发明的保护范围。