一种治疗白血病的联合用药物
阅读说明：本技术 一种治疗白血病的联合用药物 (Combined medicine for treating leukemia ) 是由 刘广洋 刘拥军 李欣 张晨亮 米一 徐立强 苗丽 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种治疗白血病的联合用药物,包括TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞和地塞米松,属于医药技术领域。本发明成功构建了TRAIL-MSCs,具有分泌sTRAIL的功能,MSCs特异性地向肿瘤部位迁移并在局部分泌sTRAIL,靶向发挥促肿瘤凋亡作用,具有更为强大的抗肿瘤作用。同时本发明采用地塞米松联合TRAIL-MSCs对急性B淋巴细胞白血病作为联合用药物,发现其能够明显地抑制急性B淋巴细胞白血病细胞的增殖,促进急性B淋巴细胞白血病细胞的凋亡,且具有较好的靶向性,为开发针对复发难治的ALL新的有效治疗方法提供了参考。(The invention provides a combined medicine for treating leukemia, which comprises an umbilical cord mesenchymal stem cell modified by TRAIL gene and dexamethasone, and belongs to the technical field of medicines. The invention successfully constructs TRAIL-MSCs, has the function of secreting sTRAIL, specifically migrates MSCs to tumor parts and locally secretes sTRAIL, and has the function of promoting tumor apoptosis in a targeted manner, thereby having stronger anti-tumor effect. Meanwhile, the dexamethasone and TRAIL-MSCs are used as combined medicines for acute B lymphocyte leukemia, and the dexamethasone and TRAIL-MSCs can obviously inhibit the proliferation of acute B lymphocyte leukemia cells and promote the apoptosis of the acute B lymphocyte leukemia cells, have better targeting property, and provide reference for developing a new effective treatment method for ALL difficult to treat due to relapse.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗白血病的联合用药物。
背景技术
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。根据白血病的分化程度、自然病程的长短可分为急、慢性白血病。急性白血病细胞分化停滞在早期阶段，以原始及早幼细胞为主，疾病发展迅速，病程数月。慢性白血病细胞分化较好，以幼稚或成熟细胞为主，发展缓慢，病程数年。按病变细胞系列分类，包括髓系的粒、单、红、巨核系和淋巴系的T和B细胞系。临床上常将白血病分为淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病等。急性B淋巴细胞白血病(acute B-lymphoblasticleukemia，B-ALL)是一种常见的血液系统恶性疾病，占儿童和成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的70-80％。目前B-ALL的完全缓解(CR)率可达70-90％，3-5年无病生存率(DFS)达30-60％，儿童ALL的长期DFS率可达85％以上。但仍有30-60％的患者出现难治或复发，成为B-ALL患者死亡的主要原因之一。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)为II型跨膜蛋白，其羧基端位于细胞膜外侧，含有受体结合结构域。膜型TRAIL被特异性基质金属蛋白酶切割后，其胞外区形成可溶性分子(sTRAIL)。TRAIL蛋白单体分子具有高度的寡聚化倾向，可形成分子量为48KDa的二聚体和分子量为66KDa的三聚体。蛋白的构型稳定性及聚集形式与其肿瘤杀伤活性、受体亲和性以及稳定性等有着密切的关系，当TRAIL在空间上形成三聚体结构时，其抗肿瘤活性最佳而稳定性最高。目前靶向TRAIL受体的研究主要包括利用TRAIL作为重组配体发挥作用和开发针对DR4、DR5的人源化单克隆抗体这2种。但上述方法有其局限性，临床前研究发现重组的人sTRAIL在体内的半衰期较短，仅为30-60min；DR4单克隆抗体Mapatumumab的半衰期有所延长(14-21d)，但可能增加潜在毒副作用。专利CN110669145A成功构建了一种高表达可溶性三聚体TRAIL融合蛋白的基因工程干细胞，并研究了其针对恶性肿瘤的治疗作用。
糖皮质激素可引起淋巴细胞的凋亡及细胞周期G1停滞，抑制其生长与增殖，是ALL治疗方案中不可或缺的一种化疗药。地塞米松(DEX)是一种典型的糖皮质激素，通过与糖皮质激素受体结合发挥作用，对淋巴细胞具有强大的杀伤作用，作为临床上常用的处方药物之一，被广泛应用于白血病/淋巴瘤的治疗。但由于治疗过程中长期、大剂量使用DEX，不仅易引发高血压、骨质疏松等不良反应，而且疗效不佳，较易引起耐药，从而使预后变差。
专利CN111658636B公开了一种穿心莲内酯与地塞米松联用，用于制备复方抗急性淋巴细胞白血病药物，治疗效果明显，且毒副作用小，不易产生耐药性。专利CN108315302B则公开了一种人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株，其制备方法如下：先将人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6置于低氧条件下培养后，一次性加入0.25μM地塞米松，继续低氧培养，最后置于常氧条件下扩大培养，从而获得人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR，该细胞可用于治疗糖皮质激素耐药急性B淋巴细胞白血病。
对于复发难治的B-ALL，目前临床上尚缺乏有效的治疗方法，即便进行异基因造血干细胞移植，其DFS率仍不尽人意，因此，亟待寻找针对B-ALL的新的有效治疗策略。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种治疗白血病的联合用药物。本发明所述的联合用药物包括TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞(TRAIL-MSCs)和地塞米松(DEX)，其能够明显地抑制急性B淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进急性B淋巴细胞白血病细胞的凋亡，且具有较好的靶向性，为肿瘤的靶向性治疗提供了新的思路与方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞(TRAIL-MSCs)与地塞米松(DEX)DEX联用在制备治疗白血病药物中的应用。
具体地，所述的地塞米松的浓度为12.5-50μmol/L，优选为25μmol/L。
具体地，所述的TRAIL-MSCs的细胞数与肿瘤细胞的比例为1:1-1:5，优选为1:2。
具体地，所述的白血病包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病、组织嗜碱细胞白血病或多毛细胞白血病，优选为急性B淋巴细胞白血病。
另一方面，本发明提供了一种治疗白血病的联合用药物，所述的联合用药物包括上述TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞TRAIL-MSCs与地塞米松DEX。
具体地，所述的地塞米松的浓度为12.5-50μmol/L，优选为25μmol/L。
具体地，所述的TRAIL-MSCs的细胞数与肿瘤细胞的比例为1:1-1:5，优选为1:2。
具体地，所述的联合用药物还包括药学上可接受的载体，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。
具体地，所述的联合用药物为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
进一步具体地，所述的口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂或囊泡剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的注射制剂采用皮内、皮下、肌内、局部或静脉内注射作为给药方式。
具体地，所述的白血病包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病、组织嗜碱细胞白血病或多毛细胞白血病，优选为急性B淋巴细胞白血病。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明成功构建了TRAIL-MSCs，具有分泌sTRAIL的功能，MSCs特异性地向肿瘤部位迁移并在局部分泌sTRAIL，靶向发挥促肿瘤凋亡作用，具有更为强大的抗肿瘤作用。同时基因修饰后的TRAIL-MSCs表面标志物表达及成骨、成脂分化等基本生物学特性没有改变。
(2)本发明采用地塞米松联合TRAIL-MSCs对急性B淋巴细胞白血病作为联合用药物，发现其能够明显地抑制急性B淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进急性B淋巴细胞白血病细胞的凋亡，且具有较好的靶向性，为开发针对复发难治的ALL新的有效治疗方法提供了参考。
附图说明
图1为DEX对Nalm-6细胞的增殖抑制作用检测结果图。
图2为DEX对Nalm-6细胞TRAIL受体DR4、DR5 mRNA水平相对表达量检测结果图。
图3为TRAIL-MSCs联合DEX对Nalm-6细胞的增殖抑制作用检测结果图。
图4为Nalm-6经TRAIL-MSCs和DEX联合作用的细胞状态检测结果图。
图5为DEX联合TRAIL-MSCs对Nalm-6细胞凋亡的影响检测结果图。
图6为Nalm-6细胞TRAIL受体DR4、DR5mRNA水平相对表达量检测结果图。
图7为Nalm-6细胞TRAIL受体DR4、DR5蛋白表达检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
本发明采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料使用表示，采用单因素方差分析及t检验进行统计学分析。
1.实验所用试剂或材料
(1)急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6购自中国医学科学院基础医学研究所；
(2)RPMI 1640培养液、DMEM/F-12培养液、胎牛血清等购于美国Thermo Fisher公司；
(3)第4代慢病毒载体系统购自美国AddGene公司；
(4)RNA提取、逆转录试剂盒及SYBR Green qPCR试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；
(5)DR4、DR5、β-actin引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；
(6)CCK-8试剂盒及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于东仁化学科技有限公司；
(7)RIPA、PMSF购于CST公司；
(8)Loadingbuffer购于中科瑞泰生物有限公司；
(9)Marker购于Bio-Rad公司；
(10)DR4、DR5、GAPDH、Goat Anti-RabbitIgG H&L(HRP)购于Abcam公司。
实施例1.TRAIL基因修饰MSCs的制备与检测
人脐带组织来源于妇产科医院剖腹产出生的健康胎儿，脐带采集通过医院伦理委员会批准，并签署供者知情同意书。人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)制备及种子库、工作库建立及质量检测等均在北京贝来生物科技有限公司GMP车间及质检中心完成。TRAIL-MSCs的制备方法为：通过慢病毒载体将SPD-TRAIL基因转染UC-MSCs，使其能够表达dTRAIL蛋白(具体详见《SPD-TRAIL基因修饰间充质干细胞及其杀伤肺腺癌细胞的研究》.米一,王立华,李欣,等.中国医药生物技术,2020,15(2):157-162.)。
实施例2.DEX对Nalm-6细胞增殖的抑制作用
将Nalm-6细胞以1×104/孔接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。分为对照组(不加药)和DEX 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L组，每组设置6个复孔。培养24h后，采用CCK8试剂盒检测DEX对Nalm-6细胞的增殖抑制情况，检测细胞450nm处吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率＝1-ADEX/A对照
检测结果如图1所示，DEX对Nalm-6细胞有增殖抑制作用，且呈浓度相关性，半数抑制浓度(IC50)为25-30μmol/L。
实施例3.DEX对Nalm-6细胞DR4、DR5的影响
将Nalm-6细胞按照3×105/孔接种于6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。分为对照组(不加药)和DEX 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L组，每组设置2个复孔。培养24h后，实时荧光定量RCR(qRT-PCR)法检测不同浓度DEX对Nalm-6细胞的DR4、DR5在mRNA水平变化的影响。
Trizol法提取Nalm-6细胞总RNA，反转录制备cDNA，根据ABI使用说明进行操作，引物序列见下表1。每个样品重复3次，qRT-PCR反应过程如下：95℃20s 1个循环，95℃3s、60℃3s 40个循环。采用2-△△Ct法对数据进行分析。
表1检测引物
结果如图2所示，当DEX浓度为6.25、12.5、25、50μmol/L时，DR4、DR5的表达量随DEX浓度升高而升高，其中浓度为12.5-100μmol/L与对照组比较差异显著(P﹤0.05或P﹤0.01)；而与25-50μmol/L相比，DEX浓度为100μmol/L时DR4、DR5 mRNA表达量下降。进一步比较发现，DEX浓度为25-50μmol/L时，Nalm-6细胞表达的DR4、DR5水平最高。
综合实施例2-3，选择DEX浓度为25μmol/L为Nalm-6细胞的最优处理浓度，用于联合TRAIL-MSCs进行后续实验。
实施例4.DEX联合TRAIL-MSCs对Nalm-6细胞增殖的抑制作用
将Nalm-6细胞分为对照组、UC-MSCs组、TRAIL-MSCs组、DEX组、DEX+UC-MSCs组和DEX+TRAIL-MSCs组。Nalm-6细胞按照6.25×104/孔接种于24孔Transwell板下室中，6h后对照组、UC-MSCs组和TRAIL-MSCs组换正常培养基，DEX组、DEX+UC-MSCs组和DEX+TRAIL-MSCs组换含有浓度为25μmol/L的DEX的培养基，继续培养24h。将3.13×104/孔的UC-MSCs分别接种于UC-MSCs、DEX+UC-MSCs组的Transwell上室中，将3.13×104/孔的TRAIL-MSCs接种于TRAIL-MSCs、DEX+TRAIL-MSCs组的Transwell上室中，与Nalm-6细胞共培养48h，共培养结束后弃上室，取下室Nalm-6细胞接种于96孔板，CCK-8检测细胞450nm处吸光度(A)值，计算各组细胞增殖抑制率。
检测结果如图3所示，UC-MSCs、TRAIL-MSCs可以抑制Nalm-6的增殖，与对照组比较差异显著(P﹤0.01)，但抑制率均在30％以下；DEX可以抑制Nalm-6细胞的增殖，抑制率为43％，与对照组比较差异显著(P﹤0.01)；而DEX联合TRAIL-MSCs对Nalm-6细胞的增殖抑制作用最强，抑制率达85％，与对照组、DEX组比较差异显著(P﹤0.01)。同时，DEX可以提高UC-MSCs、TRAIL-MSCs对细胞Nalm-6的增殖抑制作用，与UC-MSCs、TRAIL-MSCs组比较差异显著(P﹤0.01)。
实施例5.DEX联合TRAIL-MSCs对肿瘤细胞Nalm-6凋亡的影响
将Nalm-6细胞按照3×105/孔接种于6孔Transwell板下室中，操作步骤和分组同实施例4所述，DEX药物作用24h后，1.5×105/孔的UC-MSCs、TRAIL-MSCs分别接种于UC-MSCs/DEX+UCMSCs组及TRAIL-MSCs/DEX+TRAIL-MSCs组的Transwell上室中并与Nalm-6细胞共培养。共培养48h后，弃上室，取下室Nalm-6细胞，显微镜下观察并拍照，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
不同方式处理Nalm-6细胞后，分别通过显微镜不同倍数(40×和100×)观察细胞形态及密度，结果如图4所示，不同方式对肿瘤细胞Nalm-6均有一定的杀伤作用，其中以DEX与TRAIL-MSCs联合用药组的杀伤作用最明显。
不同方式处理Nalm-6细胞48h后，分别用荧光染料Annexin-V和PI对Nalm-6细胞进行染色，流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡情况，结果如图5所示，TRAIL-MSCs可以促进Nalm-6细胞凋亡，凋亡率达10％；DEX单独作用时可以促进Nalm-6细胞凋亡，凋亡率达到15％，与对照组比较有显著差异(P﹤0.05、0.01)；而DEX联合TRAIL-MSCs作用于Nalm-6细胞48h后，细胞凋亡率升高至36％，与单独使用DEX、TRAIL-MSCs比较有显著差异(P﹤0.01)。
实施例6.DEX联合TRAIL-MSCs对Nalm-6细胞中DR4、DR5表达的影响
细胞接种及分组给药同实施例4所述，共培养24h后，弃上室，取下室Nalm-6细胞，分别用实时荧光定量RCR(qRT-PCR)法及Western blotting法检测DEX联合TRAIL-MSCs对Nalm-6细胞的DR4、DR5在mRNA及蛋白水平的变化。
(1)qRT-PCR法：检测方法同实施例3。
结果如图6所示，与对照组比较，TRAIL-MSCs组DR4、DR5 mRNA表达量显著降低(P﹤0.01)；DEX可以促进DR4、DR5的表达，与对照组比较差异显著(P﹤0.01)；DEX与TRAIL-MSCs联合作用较单独使用DEX，DR4、DR5表达均显著降低(P﹤0.01)。
(2)Western blotting法：RIPA与PMSF混合液0℃裂解细胞20min，提取总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒检测每个样品蛋白质浓度，样品调整至统一浓度后，加入5×上样缓冲液，100℃变性5min。样品(30μg)通过10％SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上，TBST配制5％脱脂奶粉封闭1h，一抗孵育过夜。TBST洗涤3遍后，室温孵育二抗1h，TBST洗涤3遍，ECL发光检测试剂观察条带。Image J软件对图像进行定量分析。
结果如图7所示，TRAIL-MSCs作用于Nalm-6细胞24h后，DR4、DR5蛋白表达与对照组比较略有降低，但无显著性差异；DEX可以促进Nalm-6细胞DR4、DR5蛋白表达，与对照组比较差异显著(P﹤0.01)；DEX联合TRAIL-MSCs作用较单独使用DEX，DR4、DR5的表达显著降低(P﹤0.01)。
上述结果表明，DEX可以显著提高肿瘤细胞DR4、DR5的表达，且DEX对DR5表达的促进作用优于DR4，证实DEX通过提高Nalm-6表面的TRAIL凋亡受体从而增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性；而值得注意的是，通过DEX与TRAIL-MSC联合作用于Nalm-6相较于单独使用DEX，DR4、DR5的表达均显著降低，其原因是DEX与TRAIL-MSC联合作用更易杀伤对TRAIL更加敏感的肿瘤细胞(这些细胞高表达DR4/5)，而将DR4/5低表达的肿瘤细胞留存下来，这表明采用DEX与TRAIL-MSC联合作用其对肿瘤细胞的靶向性更高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京贝来生物科技有限公司
<120> 一种治疗白血病的联合用药物
<130> 20210804
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gccctggagt gacatcgagt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gccaccaaca gcaacgga 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
acttggtgcc ctttgactcc t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tgacccactt tatcagcatc gt 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cctggcaccc agcacaat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gggccggact cgtcatac 18