阅读说明：本技术 雪松提取物的应用 (Application of cedar extract ) 是由 吴越 姚期凤 宋肖洁 王越 蒋耀权 章漳 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及日化及植物提取物领域,具体涉及雪松提取物的应用。雪松提取物具有提高细胞修复相关基因,例如长寿基因、角质细胞增殖相关基因表达的能力,可提高皮肤细胞修复能力、增加表皮厚度、增加皮肤结构的稳定性。因此,雪松提取物可用于制备皮肤外用剂,作为维持皮肤稳定性、抗衰老的活性成分。(The invention relates to the field of daily chemicals and plant extracts, in particular to application of a cedar extract. The cedar extract has effects of improving cell repair related gene expression, such as longevity gene and keratinocyte proliferation related gene expression, improving skin cell repair ability, increasing epidermis thickness, and increasing stability of skin structure. Therefore, the cedar extract can be used for preparing skin external preparations as active ingredients for maintaining skin stability and resisting aging.)

雪松提取物的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及雪松提取物的应用。

背景技术

皮肤覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、***及肌肉。

皮肤和其他器官一样，随着年龄不断增加，都逐渐趋向衰老。无论是内源性因素或是外源刺激因素导致的皮肤衰老，其根本都源于皮肤细胞活性的下降所导致的皮肤细胞和皮肤构成物质的逐渐丧失，而最终导致的机体功能减退。因此，抗衰老很重要的一个途径就是修复细胞，通过提升细胞的自我修复能力、降低细胞的炎症水平、提高细胞分泌生长因子的能力等来改善细胞代谢、激活衰老细胞、恢复细胞的正常生理功能，从而达成对抗衰老。

有一类能提升细胞的自我修复能力，延长生物体寿命的基因。这类基因与生物体的应激耐受性有关，它们能够加强生物体的自身防卫及修复活性。这类基因被称为长寿基因。如果这些基因处于激活状态的时间足够长，就能够显著地增进生物体的健康，并延长寿命。沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1，SIRT1)就是著名的长寿基因之一。Sirt1是依赖于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白和非组蛋白去乙酰化酶，为Sirtuins家族成员之一。它与细胞分化、衰老、凋亡和能量代谢密切相关，参与机体长寿、能量代谢、应激、炎症以及肿瘤的调控等。在皮肤中的研究发现，Sirt1具有提高皮肤修护能力的作用。比如Sirt1可保护皮下胶原蛋白,防止紫外线照射引发的光老化；它还可下调STAT3、环氧化酶2等细胞因子，发挥抗炎作用；此外Sirt1还具有抑皮肤癌的功能。Sirt1的激活剂可能在今后皮肤病的治疗和预防中发挥重要的作用。一些国外的化妆品公司将对Sirt1调节作为重要靶标用于研发提高皮肤修护能力，用于抗衰老产品。

EGF家族是一类非常重要的生长因子，它们都能与EGF受体结合，具有调节细胞生长和分化以及提高细胞活性的作用。人肝素结合EGF样生长因子(HBEGF)就属于EGF家族蛋白成员。该生长因子在伤口愈合，心脏发育，血管形成过程中起到重要作用。在皮肤中，HBEGF能够促进角质细胞的增殖，迁移，并被认为是角质细胞更新(turnover)的一个重要标志物。在皮肤基底层，HBEGF的分泌量直接影响到角质细胞的更新速度，因此HBEGF在皮肤抗衰老过程中起到重要作用。一些著名的抗衰老活性物就是通过提高HBEGF在皮肤基底层的分泌量来达到抗衰老的作用。

雪松(学名：Cedrus deodara(Roxb.)G.Don)是松科雪松属植物。产于亚洲西部、喜马拉雅山西部和非洲，地中海沿岸。中国只有一种喜玛拉雅雪松，分布于西藏南部及印度和阿富汗。分布于阿富汗至印度，海拔1300-3300米地带，中国多地有栽培。雪松的药疗用途的历史很久远，最早可以追溯到圣经时代。古埃及人将雪松油添加在化妆品中用来美容，也当作驱虫剂使用。美国的原住民也将雪松当作药疗及净化仪式使用的圣品。雪松还能有效地祛痰及化痰，在传统上一直被用来治疗黏膜问题，特别是支气管的感染及阻塞；雪松也能用于关节炎及风湿等症状，能够滋补全身；对于心理以及精神紧张、焦虑、强迫症及恐惧等症状也有绝佳的舒缓作用。

本发明首次提出雪松提取物具有提高皮肤修复能力相关基因和抗衰老相关基因表达的能力，稳固皮肤结构，适用于具有延缓衰老功效的化妆品中。

发明内容

本发明旨在提供雪松提取物在制备提高具有延缓衰老功效皮肤外用剂方面的应用。

雪松提取物能够用于制备皮肤外用剂，作为抗衰老的活性成分和/或诱导皮肤细胞修复的活性成分。

雪松提取物用作提高皮肤细胞修复能力、增加表皮厚度或稳固皮肤基底膜的活性成分，从而实现维持皮肤结构稳定性和/或抗衰老。

具体的，雪松提取物能够通过促进皮肤细胞尤其表皮的角质细胞的增殖、促进表皮细胞修复、促进皮肤表层修复，从而维持皮肤结构稳定性，具有抗衰老效果。

因此，雪松提取物可用作提高细胞修复/增殖相关的基因(如长寿基因或角质细胞增殖相关的基因)表达水平和/或提高基底膜相关基因表达水平的活性成分。

雪松提取物通过提高细胞修复/增殖相关的基因，如长寿基因或角质细胞增殖相关的基因的表达水平，可促进皮肤细胞包括真皮细胞和角质表皮细胞的增殖和修复，或者促进皮肤表层修复，增加表皮厚度。

优选的，所述细胞修复/增殖相关的基因为SIRT1和HBEGF。SIRT1为长寿基因，是细胞修复相关的基因，细胞修复相关的长寿基因表达水平上调可促进皮肤细胞包括真皮细胞和角质细胞(表皮细胞)的修复，增强皮肤细胞修复能力。HBEGF为角质细胞增殖相关基因，编码生成人肝素结合EGF样生长因子HBEGF；提高角质细胞增殖相关基因的表达水平，可促进皮肤角质细胞的增殖和迁移，提高皮肤结构的稳定性，有助于延缓皮肤衰老。

雪松提取物通过提高HBEGF基因表达水平，提高人肝素结合EGF样生长因子的合成水平，以促进皮肤角质细胞的增殖和迁移，维持皮肤结构的稳定；通过提高SIRT1基因表达水平，促进去乙酰化酶的合成以提高皮肤细胞修复能力和/或增加表皮厚度。

优选的，所述的雪松提取物的制备方法为：雪松用溶剂提取1～4次，合并滤液并去除溶剂干燥；所述的溶剂为水、醇或醇水混合物。优选的，醇为乙醇。优选的，醇水混合物中，醇的体积浓度为10％～95％，更优选为40％～80％；本发明的一个优选方案中，溶剂为70％体积浓度的乙醇。

优选的，所述的提取方法为超声提取，每次提取时间20～60min，且每次提取时雪松与溶剂的用量比为1kg：5～20L。

优选的，采用雪松针叶、雪松木或者其混合物为原料进行提取。优选为雪松针叶。

优选的，将雪松粉碎并干燥后进行提取，粉碎至20～300目的颗粒。更优选的，粉碎至50～200目的颗粒。

优选的，将雪松干燥至含水量低于10％。

本发明发现，雪松提取物具有维持真表皮连接能力、促进真皮细胞和表皮细胞的增殖、促进表皮细胞修复，或者促进皮肤表层修复，增加表皮厚度及延缓皮肤衰老的能力，可以有效提高细胞修复相关的长寿基因例如SIRT1的表达水平的，提高皮肤修复和促进角质细胞增殖相关基因HBEGF的表达水平。与对照组相比，SIRT1和HBEGF表达水平分别提高70％和41％，并且能显著增加表皮厚度，可作为功效添加剂加入皮肤外用剂，如护肤品和化妆品中使用，作为抗衰老的活性成分。

雪松提取物在皮肤外用剂中的含量为0.001wt％～10wt％。优选的，雪松提取物的含量为0.005wt％～5wt％，更优选为0.01wt％～5wt％。在本发明的一个实施例中，当雪松提取物含量为100μg/mL(约0.01wt％，以干物质计)时，与对照组相比，SIRT1和HBEGF的表达水平分别提高70％和41％，并且有效增加重建皮肤模型表皮的厚度。

所述的皮肤外用剂，例如化妆品，类型包括洁面霜、乳液、霜膏、精华液、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水、啫哩、喷雾、沐浴液等。所制备的皮肤外用剂具有稳定皮肤基底膜结构、稳定真表皮连接、促进皮肤细胞增殖和修复、促进皮肤表层修复或抗衰老的作用。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：

(1)本发明将雪松提取物作为皮肤外用剂(化妆品、护肤品等)的功效添加剂和活性成分，提供了雪松提取物的新用途。雪松提取物能够提高细胞修复/增殖相关的基因(如长寿基因)表达水平和/或提高基底膜相关基因表达水平，可提高能够促进真皮细胞增殖、促进表皮细胞增殖、促进表皮细胞修复或促进皮肤表层修复，提高皮肤细胞修复能力、增加表皮厚度、稳定真表皮连接或稳固皮肤基底膜。因此，雪松提取物可用于制备具有抗衰老、维持皮肤结构稳定性作用的皮肤外用剂，具有良好的应用前景。

(2)本发明雪松提取物的制备工艺简单，工艺条件易于控制，制备成本低。

(3)本发明雪松提取物活性高，在含量极低的情况下即产生显著效果，天然、安全且有效，不刺激皮肤。

附图说明

图1为实施例2添加雪松提取物和未处理的3D皮肤模型切片快蓝染色结果：A为不添加雪松提取物的对照组，B为添加了100μg/mL雪松提取物的实验组。

图2为实施例3雪松提取物提高SIRT1基因表达结果示意图

图3为实施例4雪松提取物提高细角质细胞增殖相关HBEGF基因的表达结果示意图

具体实施方式

实施例1雪松提取物的生产

取含水量低于5％的50-200目雪松(针叶)干燥粉末10g，于室温下以70％(体积浓度)乙醇500W超声提取2次，每次的乙醇用量100mL，每次提取30min；滤液合并，滤液旋转蒸发至干，得到雪松提取物约0.9g。

实施例2 3D皮肤模型试验

(一)皮肤模型的制备

从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行真皮阶段培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型。

培养过程中，从在支架上接种成纤维细胞后的D3到最终D18，分别用普通培养基(对照组，NT)或者含有100μg/mL实施例1雪松提取物(约0.01wt％，以雪松提取物的干重计)的培养基对皮肤模型进行培养。

(二)冰冻切片及快蓝染色

将3D皮肤模型浸没于OCT并于液氮中制成冻块。然后于冰冻切片机中切片，收集5um厚度3D皮肤模型切片于载玻片上。室温中在70％的乙醇中固定90s，在快蓝染液中染色120s，于清水中适当清洗。在浓度逐级上升的酒精中脱水，经二甲苯透明后封片拍照。

结果如图1所示，A为对照组未经过处理的3D皮肤模型染色结果；B为实验组，即经过雪松提取物处理的3D皮肤模型染色结果。

从图1中可以看到，在添加100μg/mL雪松提取物后，对比未处理组的重建皮肤模型，表皮厚度明显增加，说明雪松提取物可以有效的增加重建皮肤模型表皮的厚度，促进表皮角质细胞的增殖，使基底层上细胞排列更加紧密，角质层分化更加完善。这说明雪松提取物具有潜在延缓皮肤衰老、修复皮肤表层、促进表皮细胞修复的功能，具有抗衰老、提升皮肤整体活力和健康状况的作用。

实施例3雪松提取物提高皮肤细胞修复相关基因表达

(一)皮肤模型的制备方法同实施例2。

(二)RNA的提取

剪取取组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz，5min；9000rpm，4℃1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200uL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm，4℃15min；转上层水相(约400uL)于新1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm 10min 4℃；弃上清，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm 5min 4℃；弃上清，空气干燥5-10分钟，溶于30ul DEPC水中；分光光度计测定RNA浓度。

(三)基因表达分析

根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析。

在测定基因表达的试验中，如果相对于未添加提取物的实验组，基因的表达量明显升高，可推断雪松可以诱导细胞修复相关的及抗衰老相关的基因表达，提高皮肤的结构的稳定和延缓衰老的功效。

由图2可知,添加雪松提取物后,在皮肤模型中SIRT1基因表达上调1.70倍,说明该提取物有提高细胞整体修复的能力。

实施例4雪松提取物提高角质细胞增殖相关基因的表达

实验方法同实施例3，检测皮肤模型中HBEGF基因的表达，结果如图3所示。

由图3可知，添加雪松提取物(100μg/mL)后，在皮肤模型中人肝素结合EGF样生长因子(HBEGF)表达上调1.41倍，说明该提取物有增强角质细胞更新速度的功效，可以促进皮肤角质细胞的增殖和迁移，提高皮肤结构的稳定性，延缓衰老，具有抗衰老的效果。