阅读说明：本技术 Il-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用 (IL-6 recombinant monoclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 郑雪松 华权高 沈鹤霄 罗绍祥 陈莹 谭华菊 舒芹 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种IL-6重组单克隆抗体的制备方法,其包括如下步骤：以IL-6免疫小鼠,免疫完成后取小鼠的脾脏,制成单细胞悬液；通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞；对所得细胞进行分别培养,再将所得培养物上清液加入到包被IL-6的培养装置继续培养,检测出分泌特异性抗体的细胞株,筛选出可以特异性识别抗原蛋白的抗体克隆；对所得细胞株进行总RNA的抽提,并反转录成cDNA,扩增抗体重链和轻链的可变区,分别连接至载体；然后进行细胞转染,生产IL-6重组单克隆抗体。本发明可以通过一次筛选获得大量的抗体序列,可以获得抗体的基因信息,解决了杂交瘤技术中的细胞融合率低以及抗体基因丢失的问题。(The invention provides a preparation method of an IL-6 recombinant monoclonal antibody, which comprises the following steps: immunizing a mouse by using IL-6, and preparing a single cell suspension by taking the spleen of the mouse after the immunization is finished; screening out memory B cells and plasma cells by a flow cytometer; respectively culturing the obtained cells, adding the obtained culture supernatant into a culture device coated with IL-6 for continuous culture, detecting cell strains secreting specific antibodies, and screening antibody clones capable of specifically recognizing antigen proteins; extracting total RNA from the obtained cell strain, performing reverse transcription to obtain cDNA, amplifying variable regions of heavy chains and light chains of the antibody, and respectively connecting the variable regions to a vector; then, cells are transfected to produce the IL-6 recombinant monoclonal antibody. The invention can obtain a large amount of antibody sequences through one-time screening, can obtain the gene information of the antibody, and solves the problems of low cell fusion rate and antibody gene loss in the hybridoma technology.)

IL-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及IL-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

白细胞介素-6(Interleukin-6)，简称白介素6(IL-6)，是一种功能广泛的多效性细胞因子。血清IL-6浓度测定广泛用于外科手术、应激反应、感染等疾病的诊断中，目前血清IL-6浓度测定主要采用化学发光法、免疫荧光层析法等的免疫学方法来检测，由于IL-6在正常人体内含量极低(＜7pg/ml)，所以对检测试剂盒中的核心原料---抗体提出更高的要求，研制出高亲和力的抗体是市场所需。

目前诊断试剂盒所用单克隆抗体大多数通过杂交瘤细胞分泌产生，基本原理是由脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞系，然后通过有限梯度稀释法得到单一细胞，然后检测其培养上清，筛出所需阳性细胞株，通过在小鼠体内注射杂交瘤细胞产生腹水或者是通过体外培养方式得到分泌抗体的上清，再经亲和纯化得到纯度较高的抗体。该方法一直存在着融合效率低、随机性大，实验过程中阳性率较低，需要多次细胞融合，从而增大了工作量；此外，杂交瘤细胞体内培养需要借助实验动物完成，实验动物培养成本高，而且动物个体差异大容易导致批间差，不利于工业化生产。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种可一次性获得大量的抗体序列、操作简单的IL-6重组单克隆抗体的制备方法。

本发明提供的IL-6重组单克隆抗体制备方法包括如下步骤：

(1)、以IL-6免疫小鼠，免疫完成后取小鼠的脾脏，制成单细胞悬液；

(2)、通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞；

(3)、对步骤(2)所得细胞进行分别培养，再将所得培养物上清液加入到包被IL-6的培养装置继续培养，检测出分泌特异性抗体的细胞株，筛选出可以特异性识别抗原蛋白的抗体克隆；

(4)、对步骤(3)筛选出的细胞株进行总RNA的抽提，并反转录成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；然后进行细胞转染，生产IL-6重组单克隆抗体。

传统的利用脾细胞和骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞并进行抗体生产的技术存在着融合效率低、随机性大的缺点，导致实验过程阳性率较低，需要多次细胞融合，从而增大了工作量。此外，杂交瘤细胞体内培养需要借助实验动物完成，实验动物培养成本高，而且动物个体差异大容易导致批间差，不利于工业化生产。

本发明解决了杂交瘤技术融合效率低的问题，可以通过一次筛选获得大量的抗体序列，为后期高亲和力，高特异性抗体的筛选奠定基础。同时，本发明可以获得抗体的基因信息，解决了杂交瘤技术不稳定，存在抗体基因丢失的风险。另外，本发明获得的抗体基因经重组表达后，可以获得均一的单克隆抗体，有利于控制抗体的批次间差异。

相对于噬菌体展示技术筛选抗体的技术而言，由于本发明的单细胞分选的技术是从B淋巴细胞中直接获取的抗体基因，抗体的重链和轻链是原始的组合，可获得亲和力更好的抗体。

相对于核糖体展示技术而言，本发明不会涉及“蛋白质-核糖体-mRNA”这样的不稳定的复合物体系，操作模式更加简单。因此，该单克隆抗体技术能更好地满足诊断试剂对抗体亲和力，特异性，均一性等方面的要求，具有很高的操作性和推广价值。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(1)中，所述小鼠为Balb/c小鼠。

作为本发明一个可选的技术方案，步骤(1)中，所述IL-6为大肠杆菌系统表达IL-6蛋白并纯化而得。

作为本发明一个实施方案，步骤(2)中，利用抗小鼠CD45R/B220、CD19、CD27、CD38或CD138的抗体进行细胞表面抗体标记，通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞。优选的，步骤(2)中，利用抗小鼠CD138的抗体进行细胞表面抗体标记，此抗体为浆细胞分化特有的表面标志物，通过流式细胞仪筛选出浆细胞。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(3)中，进行细胞培养时，采用384微孔板进行培养，和/或，所述包被IL-6的培养装置为384微孔板。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(4)中，进行所述扩增时，采用巢式PCR扩增。

作为本发明一个可选的实施方案，步骤(4)中，进行所述细胞转染时，是对CHO细胞进行转染。

作为本发明一个优选的实施方案，步骤(4)中，进行细胞转染后，还经过稳转细胞株筛选，以获得可以大量生产重组单克隆抗体的细胞株，然后优化培养基和培养条件提高细胞的抗体产量。

本发明的另外一个目的在于提供由上述方法制备得到的IL-6重组单克隆抗体，所述IL-6重组单克隆抗体的重链的和轻链的氨基酸序列选自如下组合之一：

重链的序列如SEQ ID No：1所示，轻链的序列如SEQ ID No：2所示；

重链的序列如SEQ ID No：3所示，轻链的序列如SEQ ID No：4所示；

重链的序列如SEQ ID No：5所示，轻链的序列如SEQ ID No：6所示；

重链的序列如SEQ ID No：7所示，轻链的序列如SEQ ID No：8所示。

本发明还有一个目的在于提供上述IL-6重组单克隆抗体在制备免疫诊断制剂方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明可以通过一次筛选获得大量的抗体序列，可以获得抗体的基因信息，解决了杂交瘤技术中的细胞融合率低以及抗体基因丢失的问题。本发明所得的重组抗体生产放大方便，批间差可控，成本也更低廉，更好满足诊断试剂对抗体稳定性和重复性的要求。本发明创新性的将重组单克隆抗体应用于免疫诊断试剂中，打破了目前重组单克隆抗体仅应用于制备单克隆抗体药物的现状。

附图说明

图1～2为本发明实施例1所得抗体的测试结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

当涉及多核苷酸时，本文所用的术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。术语“表达载体”或“表达盒”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。

本文所用的术语“转染”指外来或外源DNA被细胞摄入，该技术可用于将一种或多种外源DNA部分导入适宜的宿主细胞。可通过理化方法(例如通过氯化钙处理)诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即“感受态”。

实施例1

主要实验步骤：

1.表达纯化IL-6蛋白：采用大肠杆菌系统表达IL-6蛋白并纯化，同时表征抗原的纯度、浓度和活性，选择高纯度、高活性的作为免疫原。

2.准备脾细胞：用上述抗原免疫Balb/c小鼠，免疫完成后取小鼠的脾脏，制成单细胞悬液。

3.获取单细胞：利用抗小鼠CD45R/B220、CD19、CD27、CD38的抗体进行细胞表面抗体标记，通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞。

4.检测抗体滴度：将上述筛选的细胞分铺到384微孔板培养，再将培养上清加入到预先包被抗原的微孔板，检测出分泌特异性抗体的细胞株，筛选出可以特异性识别抗原蛋白的抗体克隆，

5.制备重组克隆：取产高亲和力抗体的细胞株，抽提B淋巴细胞的总RNA，反转录成cDNA，用巢式PCR扩增出抗体重链和轻链的可变区，然后分别连接至载体，转染HEK293T细胞表达，，获得可以大量生产重组单克隆抗体的细胞株。

6.筛选重组克隆：根据抗体亲和力和识别位点选择配对，然后测校准曲线和高低值样本，筛选出合适抗体，再经过稳定转染至CHO细胞，筛选出稳定细胞系；通过优化培养基，培养条件提高细胞的抗体产量，然后重复生产3批抗体，确定生产工艺。

在上述主要实验步骤的基础上，相关具体方法为：

将如SEQ ID No.9所示的基因***到pGEX-6P-1的载体，然后通过CaCl2化学转化法转入E.coli BL21中并测序，测序正确的重组大肠杆菌按1％接种量接种于LB液体培养基，然后37℃震荡培养至OD约0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续培养4hr，6000g离心收集菌体，然后采用超声波破碎仪破碎大肠杆菌，之后20000g，4℃离心收集上清液，上清液经由Ni-NTA层析柱纯化得到重组IL-6蛋白，采用双抗夹心ELISA法检测重组IL-6蛋白活性(表1)。

将重组蛋白与弗氏完全佐剂混匀免疫小鼠，每只小鼠每次免疫50ug蛋白，每两周免疫一次，免疫五次后在无菌条件取小鼠脾脏，然后制成单个脾细胞悬浮液。取适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4℃静置15min。使B细胞表面的FcR都被抗CD16或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。封闭完成后，取10μL标记相应的荧光素偶联抗体CD138-FITC，含有990μL样品细胞的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min。加1mL FACSbuffer洗去未结合的抗体，350g，4℃离心5min，弃上清，用200μL FACS buffer或2％的多聚甲醛重悬沉淀，尽快上机分析，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，获得浆细胞。将上述筛选的细胞分铺到384微孔板培养，再将培养基加入到预先包被抗原的微孔板，培养3天后取培养上清检测效价，筛选出可以特异性识别IL-6蛋白的抗体克隆子。

采用TRIzol法提取B淋巴细胞的总RNA，经RT-PCR法反转录成cDNA，再用巢式PCR扩增出抗体重链和轻链的可变区并测序，然后分别连接至pCDNA3.4载体，瞬时转染到HEK293T细胞，细胞培养上清经过Protein A柱纯化得到识别IL-6的抗体。

表1

表2

实施例2

取纯化的抗体加入到预先包被protein G的96孔板再加入标记生物素的IL-6蛋白和标记链霉亲和素的HRP测抗体亲和力(表2)，将根据抗体亲和力和识别位点选择配对，然后检测IL-6校准曲线，筛选出合适配对抗体，即细胞编号2号、3号和5号。将对应的质粒稳定转染至CHO细胞，然后重复生产3批抗体，确定生产工艺。

实施例3

用2号和3号作为捕获抗体包被于96微孔板，5号抗体标记HRP作为标记抗体，在化学发光平台检测30份人血清样本，检测的结果和医院测值进行比较结果如图1和图2所示。

序列表

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> IL-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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