阅读说明：本技术 一种***梯度分离液及其制备方法和应用 (Sperm gradient separation liquid and preparation method and application thereof ) 是由 何凉 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种精子梯度分离液的制备方法,包括如下步骤：(1)将盐溶液、缓冲剂和螯合剂混合,然后经过高速搅拌,形成基础溶液；(2)将分离剂和水混合,然后经过低速搅拌,形成悬浮液,其中,所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒；(3)将基础溶液和悬浮液混合,然后经过中速搅拌,形成精子梯度分离液。本发明还提供了利用上述方法制备的精子梯度分离液和利用该精子梯度分离液进行精子分离的方法。本发明制备的精子梯度分离液中的各个成分均可以得到均匀分布,各个成分分散性好,不易产生沉淀,产品品质高,在精子分离时的使用效果好。(The invention discloses a preparation method of sperm gradient separation liquid, which comprises the following steps: (1) mixing a salt solution, a buffering agent and a chelating agent, and then stirring at a high speed to form a basic solution; (2) mixing a separating agent and water, and then stirring at a low speed to form a suspension, wherein the separating agent is silicon dioxide particles treated by a silane coating; (3) and mixing the base solution and the suspension, and then stirring at medium speed to form the sperm gradient separating medium. The invention also provides the sperm gradient separating medium prepared by the method and a method for separating sperm by using the sperm gradient separating medium. The components in the sperm gradient separating solution prepared by the invention can be uniformly distributed, the dispersibility of the components is good, the precipitation is not easy to generate, the product quality is high, and the using effect is good when sperm is separated.)

一种***梯度分离液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，特别涉及一种***梯度分离液及其制备方法和应用。

背景技术

***的密度梯度分离可以有效去除淋巴细胞、上皮细胞、异常或未成熟***、细胞碎片、细菌甚至是病毒。密度梯度离心法的原理是正常***与畸形***、不活动***及***中的其他细胞成分在运动能力、运动轨迹和浮力密度等方面出现差异，在密度梯度溶液柱中运行的能力也有差异，离心后，***中的各种成分在密度梯度溶液柱中达到平衡，停留在各自的等浮力密度点上，从而达到分类正常***的目的。

***的密度梯度分离过程是在分离管中加入***梯度分离液，以形成梯度层，以实现分离***。***梯度分离液是可用于过滤细胞的特殊液体。现有的***分离液的制备方法采用直接混合搅拌的方式，最终获得的***梯度分离液中的胶体颗粒或其他成分不能均匀的分布于溶液中，***梯度分离液的品质不高，从而影响***分离时的使用效果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种***梯度分离液及其制备方法和应用，该***梯度分离液中的各个成分均可以得到均匀分布，各个成分分散性好，不易产生沉淀，产品品质高，在***分离时的使用效果好。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种***梯度分离液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将质量比为40～60:25～35:10～25的盐溶液、缓冲剂和螯合剂混合，然后经过高速搅拌，形成基础溶液，其中，高速搅拌过程的搅拌速度为1500～1800rpm，搅拌时间为1min～6min；

(2)将质量比为40～90:10～60的分离剂和水混合，然后经过低速搅拌，形成悬浮液，其中，所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒，低速搅拌过程的搅拌速度为400～600rpm，搅拌时间为1h～1.5h；

(3)将基础溶液和悬浮液以质量比1:1.5～2.0混合，然后经过中速搅拌，形成***梯度分离液，其中，中速搅拌过程的搅拌速度为1000～1500rpm，搅拌时间为10～30min。

其中，步骤(1)中的盐溶液包括如下浓度的溶质：氯化钠5～10g/L、碳酸氢钠3～5g/L、氯化钾1～3g/L、乳酸钙0.1～0.5g/L、丙酮酸钠0.01～0.05g/L和磷酸二氢钾0.01～0.03g/L。

优选的，步骤(1)中的缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、HEPES缓冲剂、Tris-H cl缓冲剂中的一种。

优选的，步骤(1)中的螯合剂为EDTA。

优选的，步骤(2)中，如果分离剂和水的质量比为40:60，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为1h，如果分离剂和水的质量比为80:20，搅拌速度为500r pm，搅拌时间为1.2h，如果分离剂和水的质量比为90:10，搅拌速度为400rp m，搅拌时间为1.5h。

本发明还提供了一种***梯度分离液，其是由上述制备方法制得。

本发明还提供了上述***梯度分离液在***分离方法中的应用，具体的，该***分离方法包括如下步骤：

(1)分别取配制好的两个密度的***梯度分离液，先将密度高的***梯度分离液加入锥形离心管中，然后将密度低的***梯度分离液加入到锥形离心管中的密度高的***梯度分离液的液面之上，两层***梯度分离液之间形成清晰的界面；

(2)再向锥形离心管内加入已液化的***，***与密度低的***梯度分离液之间形成界面；

(3)室温下，以300g离心20min；

(4)离心完成后，用吸管伸入锥形离心管中，将管底的***颗粒团取出。

其中，步骤(3)中的离心速度需要按照以下公式：

该公式中，G为离心力，r为转动半径，即将离心机的吊桶升高到水平位置时转子中心到离心管底部的距离(mm)。

其中，***梯度分离液的密度梯度划分标准是按照配制时所使用的悬浮液中分离剂的质量分数进行划分。

本发明的有益效果是：本发明的制备方法中，采用高速搅拌以及较短的搅拌时间制备基础溶液，采用低速搅拌以及较长的搅拌时间制备悬浮液，然后采用中速搅拌以及合理的搅拌时间将基础溶液和悬浮液进行混合，制得***梯度分离液；本发明采用针对性的搅拌速度和搅拌时间进行分别搅拌和混合搅拌，使得制备的***梯度分离液中，二氧化硅颗粒以及其他成分可以均匀的分布于分离液中，采用这种制备方法制得的***梯度分离液的品质较高，在***分离过程中的使用效果较好；

本发明的***梯度分离液，采用缓冲剂对分离液的pH进行调节，使分离液的pH达到所需要求(低于***的pH，约在7.35～7.8之间)；另外，***梯度分离液中的螯合剂可以起到一定的分散作用，并可以防止分离液中的有效成分沉淀；该***梯度分离液采用硅烷包覆的二氧化硅胶体粒子作为分离剂，该胶体粒子颗粒很小，使得构成颗粒的原子的电势相互排斥能比单个颗粒的浮悬重力大，这种排斥可以保证所有的颗粒均匀分布于溶液中，不会脱落或沉淀，从而在离心过程中可以阻碍细胞流过，达到分离***的目的。

本发明的***梯度分离液中，盐溶液包含了多种盐成分，可以为***细胞提供适合的离子水平，保证正常***细胞在分离过程中的存活，且各成分配合，将***梯度分离液的渗透压维持在约290～340mOsmol/kg之间。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

一种***梯度分离液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将质量比为40～60:25～35:10～25的盐溶液、缓冲剂和螯合剂混合，然后经过高速搅拌，形成基础溶液，其中，高速搅拌过程的搅拌速度为1500～1800rpm，搅拌时间为1min～5min；其中，盐溶液包括如下浓度的溶质：氯化钠5～10g/L、碳酸氢钠3～5g/L、氯化钾1～3g/L、乳酸钙0.1～0.5g/L、丙酮酸钠0.01～0.05g/L和磷酸二氢钾0.01～0.03g/L；

(2)将质量比为40～90:10～60的分离剂和水混合，然后经过低速搅拌，形成悬浮液，其中，所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒，低速搅拌过程的搅拌速度为400～600rpm，搅拌时间为1h～1.5h；

(3)将基础溶液和悬浮液以质量比1:1.5～2.0混合，然后经过中速搅拌，形成***梯度分离液，其中，中速搅拌过程的搅拌速度为1000～1500rpm，搅拌时间为10～30min。

其中，步骤(1)中的缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲剂、Tris-Hcl缓冲剂中的一种。

其中，步骤(1)中的螯合剂为EDTA。

实施例1

一种***梯度分离液的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别取40重量份的盐溶液、35重量份的HEPES缓冲剂和25重量份的EDTA螯合剂，将其混合，并在1500rpm的搅拌速度下搅拌5min，形成基础溶液；其中，盐溶液包括如下浓度的溶质：氯化钠6g/L、碳酸氢钠3g/L、氯化钾1g/L、乳酸钙0.2g/L、丙酮酸钠0.03g/L和磷酸二氢钾0.03g/L；

(2)取40重量份的分离剂和60重量份的水混合，然后在600rpm的搅拌速度下搅拌1h，形成悬浮液，其中，所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒；

(3)将基础溶液和悬浮液以质量比1:1.5混合，然后在1500rpm的搅拌速度下搅拌10min，制得***梯度分离液。

实施例2

一种***梯度分离液的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别取50重量份的盐溶液、30重量份的HEPES缓冲剂和20重量份的EDTA螯合剂，将其混合，并在1600rpm的搅拌速度下搅拌2.5min，形成基础溶液；其中，盐溶液包括如下浓度的溶质：氯化钠6g/L、碳酸氢钠3g/L、氯化钾1g/L、乳酸钙0.2g/L、丙酮酸钠0.03g/L和磷酸二氢钾0.03g/L；

(2)取80重量份的分离剂和20重量份的水混合，然后在500rpm的搅拌速度下搅拌1.2h，形成悬浮液，其中，所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒；

(3)将基础溶液和悬浮液以质量比1:1.8混合，然后在1200rpm的搅拌速度下搅拌15min，制得***梯度分离液。

实施例3

一种***梯度分离液的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别取60重量份的盐溶液、25重量份的HEPES缓冲剂和15重量份的EDTA螯合剂，将其混合，并在1800rpm的搅拌速度下搅拌1.5min，形成基础溶液；其中，盐溶液包括如下浓度的溶质：氯化钠6g/L、碳酸氢钠3g/L、氯化钾1g/L、乳酸钙0.2g/L、丙酮酸钠0.03g/L和磷酸二氢钾0.03g/L；

(2)取90重量份的分离剂和10重量份的水混合，然后在400rpm的搅拌速度下搅拌1.5h，形成悬浮液，其中，所述分离剂为经过硅烷涂层处理的二氧化硅颗粒；

(3)将基础溶液和悬浮液以质量比1:2.0混合，然后在1000rpm的搅拌速度下搅拌25min，制得***梯度分离液。

本发明还提供了***梯度分离液在***分离方法中的应用实施例，具体的，该***分离方法包括如下步骤：

(1)分别取配制好的两个密度的***梯度分离液各2ml，先将密度高的***梯度分离液加入锥形离心管中，然后将密度低的***梯度分离液加入到锥形离心管中的密度高的***梯度分离液的液面之上，两层***梯度分离液之间形成清晰的界面；其中，在该实施例中，密度高的***梯度分离液对应于配制时所使用的悬浮液中分离剂的质量分数80％，密度低的***梯度分离液对应于配制时所使用的悬浮液中分离剂的质量分数40％；

(2)再向锥形离心管中加入已液化的2ml***，***与密度低的***梯度分离液之间形成界面；

(3)室温下，以300g离心20min；

(4)用吸管伸入锥形离心管中，将管底的***颗粒团取出，获得经过分离后的正常***。

其中，步骤(3)中的离心速度需要按照以下公式：

该公式中，G为离心力(重力加速度(g)的倍数)，r为转动半径，即将离心机的吊桶升高到水平位置时转子中心到离心管底部的距离(mm)。

具体的，r＝165mm，为达到300(×g)的离心力，离心速度(Rpm)必须为：

即，离心时，离心机采用的离心速度为1275rpm，离心时间为20min。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。