一种保持人类精子活力的体外培养液及其制备方法
阅读说明：本技术 一种保持人类精子活力的体外培养液及其制备方法 (In-vitro culture solution for maintaining human sperm motility and preparation method thereof ) 是由 余柯达 师帅 毛佳婷 柴娟 包云 高辉 郑群 于 2021-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种保持人类精子活力的体外培养液及制备方法,该体外培养液包含有MenSCs活性上清液和基础培养液,所述MenSCs活性上清液与基础培养液的混合比例为1：9,该MenSCs活性上清液通过无血清培养液培养MenSCs获得。本发明包含有MenSCs活性上清液,其中含有大量活性因子,可有效保护精子在体外不被氧化损伤,保持精子活力,可为ART治疗时提供更有活力的精子,以提高受精率和妊娠率,尤其是逆行射精患者。(The invention discloses an in vitro culture solution for maintaining human sperm motility and a preparation method thereof, the in vitro culture solution comprises MenSCs active supernatant and basic culture solution, the mixing ratio of the MenSCs active supernatant to the basic culture solution is 1: 9, the MenSCs active supernatant was obtained by culturing MenSCs in a serum-free medium. The invention contains MenSCs active supernatant, which contains a large amount of active factors, can effectively protect sperms from being oxidized and damaged in vitro, keep the sperm motility, and provide more viable sperms for ART treatment so as to improve the fertilization rate and pregnancy rate, especially for patients with retrograde ejaculation.)
技术领域
本发明涉及精子体外培养技术领域，尤其涉及一种包含有MenSCs活性上清液能够保持人类精子活力的体外培养液及制备方法。
背景技术
我国近期调查结果表明，国内已婚夫妇中不孕不育者占了10％，且发病率呈上升趋势。由此看来，不孕不育已经成为了影响社会安定和家庭和谐的一个重要因素。人类辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)是治疗不孕不育症的一种医疗手段，其使低生育力或不孕不育患者获得了生育后代的可能性。ART包括人工授精(Artificialinsemination，AI)和体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术两大类。在进行夫精宫腔内人工授精和IVF-ET治疗时，男性患者需要将精液通过手淫法取出体外，并进行优化处理，即洗去精浆，活力低的精子及死精子，然后用人工合成的培养液包括BWW、mHTF、台式液等培养精子。然而优化处理会导致精子受到损伤，在培养过程中释放出活性氧，使精子进一步氧化损伤失去活力，甚至死亡，尤其是逆向射精的男性患者，精子受到尿液的损伤，虽然离体后迅速进行优化处理，但已受到损伤，在培养液中精子失去活力的速度远远高于正常男性的精子。因此，在临床上开发一种保持精子活力的培养体系就显得尤为重要。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是成体干细胞中的一员，来源于胚胎发育的中胚层，具有自我更新和多向分化潜能等特点，在再生医学中具有非常重要的应用价值。自1957年首次从骨髓中发现了MSCs，研究者们先后又从脐带、脂肪组织和胎盘等组织中发现了MSCs。近年发现了一种来源于经血的新型MSCs——经血源性间充质干细胞(Menstrualblood-derived MSCs，MenSCs)，相较于其他来源的MSCs，MenSCs具有来源广，取材易，含量多，复制快，无创获得，且来源于人体废弃物，避免了伦理问题。MSCs在组织修复中的机制最初认为是其通过归巢到损伤组织，分化并替换受损的细胞，随后的研究表明，MSCs在损伤组织的植入和分化是非常少和短暂的，目前普遍认为MSCs主要是通过旁分泌作用发挥修复作用。MSCs培养过程中会分泌大量活性因子以及外泌体，外泌体中含有功能性蛋白质、mRNAs及microRNAs等物质，可有效修复精子所受的损伤，维护其活力和受精能力。
发明内容
本发明目的在于提供一种保持人类精子活力的体外培养液及制备方法,本发明包含有MenSCs活性上清液，其中含有大量活性因子，可有效保护精子在体外不被氧化损伤，保持精子活力，可为ART治疗时提供更有活力的精子，以提高受精率和妊娠率，尤其是逆行射精患者。
为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
一种保持人类精子活力的体外培养液，该体外培养液包含有MenSCs活性上清液和基础培养液。
作为优选，所述MenSCs活性上清液与基础培养液的混合比例为1：9，该MenSCs活性上清液通过无血清培养液培养MenSCs获得，MenSCs活性上清液中含有活性因子，可有效保护精子在体外不被氧化损伤。
作为优选，所述基础培养液为SSS与mHTF的混合液，所述SSS与mHTF的混合比例为1：9。
一种保持人类精子活力的体外培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)用无血清培养液培养MenSCs，收集培养后的无血清培养液，获得MenSCs活性上清液；
2)将SSS与mHTF按1：9的比例混合制成基础培养液；
3)将MenSCs活性上清液与基础培养液以1：9的比例混合制成体外培养液。
4)将制备好的体外培养液通过滤膜过滤。
作为优选，所述MenSCs活性上清液收集自P3-P20代传代培养细胞。
作为优选，无血清培养液培养MenSCs的培养时间为72h。
作为优选，过滤体外培养液所用滤膜的孔径为0.22μm。
本发明具有以下优点：
本发明包含有MenSCs活性上清液，其中含有大量活性因子，可有效保护精子在体外不被氧化损伤，保持精子活力，可为ART治疗时提供更有活力的精子，以提高受精率和妊娠率，尤其是逆行射精患者。同时MenSCs可来源于不孕不育患者中的女方患者，整个治疗过程中没有来源于第三方的细胞，可有效杜绝生物感染的风险。
附图说明
图1为MenSCs的形态观察(比例尺:100μm)；
图2为MenSCs表面分子标志物鉴定；
图3为本发明对正常男性精子活力的保持作用(*代表P<0.05)；
图4为本发明对逆行射精患者精子活力的保持作用(*代表P<0.05)。
具体实施方式
为了更好地了解本发明的目的、组成及方法步骤，结合实施例对本发明一种保持人类精子活力的体外培养液及制备方法做进一步详细的描述。
实施例1
1、MenSCs活性上清液的获取
(1)细胞分离培养
于月经时期使用无菌月经杯收集20-35岁健康女性志愿者经血样本。将收集的经血与等体积PBS(含1％青霉素-链霉素)混合，2-8℃冷藏保存。用Ficoll密度梯度离心法分离经血中的MenSCs，将经血样本混匀后，置于Ficoll分离液(美国SIGMA公司)上层，1800r/min离心25min，取离心后的中间细胞层，用PBS洗涤2次，去除淋巴细胞分离液，用含10％FBS的DMEM/F-12(美国GIBCO公司)培养液重悬细胞，接种于六孔培养板中，置于37℃、5％CO2浓度、饱和湿度下常规培养，细胞密度达90％，消化传代。原代分离的细胞24h后可观察到少量不规则形、多边形或多角形贴壁细胞，72h后全量换液，弃去杂质细胞。12-14d后原代细胞(P0)贴壁成单层，传代后为P1代细胞。随着传代次数的增多，细胞种群逐渐同类化，多数细胞呈纺锤状，排列呈漩涡状且成簇，表现出典型的MSCs特征(图1)。
(2)细胞表面标志物检测
取生长良好的MenSCs用0.25％胰酶消化，PBS漂洗2遍，再用PBS制成1×106个/L单细胞悬液，在待测样本中各加入CD29 PE、CD34 FITC、CD45FITC、CD73 PE、CD90 FITC、CD105PE、CD117 PE、和HLA-DR FITC抗体(购自美国BD公司)1μL，同时以PBS作为空白对照。避光室温孵育30min，PBS洗2遍，1300r/min离心5min，用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。图2显示由经血来源的干细胞表面分子标志物，表明细胞高表达CD29、CD73、CD90和CD105，低表达CD34、CD45、CD117和HLA-DR，符合MSCs表面分子标志物的表达标准。
(3)MenSCs活性上清液的获取
将经过鉴定的MenSCs用含10％FBS的DMEM/F-12培养液进行培养传代，待细胞融合至70％-80％汇合度时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液(美国Lonza公司)继续培养72h，回收上清液，如此收集P3-P20代MenSCs培养后的无血清培养液即为MenSCs活性上清液，该活性上清液含有大量活性因子，可有效保护精子在体外不被氧化损伤，保持精子活力，收集后-80℃冷冻保存备用。
2、对正常男性精子的体外培养
(1)体外培养液制备
首先将上述收集的MenSCs活性上清液从-80℃冰箱中取出解冻；再将血清替代物(Serum Substitute Supplement，SSS，美国IrvineScientific公司)与配子准备液(Modified HTF Medium，mHTF，美国IrvineScientific公司)按1：9的比例混合制成基础培养液；然后将解冻好的MenSCs活性上清液与基础培养液以1：9的比例混合制成体外培养液；最后将制备好的体外培养液通过孔径为0.22μm的滤膜过滤，过滤后的液体即为可使用的体外培养液。
(2)精子的处理
收集正常活力精子标本(标准按WHO五版)，将收集有精液的取精杯置于37℃水浴液化。液化后的精液采用密度梯度离心法进行优化处理，在无菌离心管中加入1.0mLIsolate精子分离液(美国IrvineScientific公司)中的上层分离液，再在其底部加入等量下层分离液，将完全液化的精液沿着管壁缓慢加入分离液上方，保持界面清晰可见；置于离心机内，220g离心16min；吸取离心后的精子沉淀并加入含有1mL含10％SSS mHTF的新离心管中混合均匀。
(3)精子的培养
将上述精子悬液等分为二组，一组为对照组，另一组为实验组，将优化后的精子密度均调为10×106/mL，取精子镜检，记录精子活力。两组均在220g下离心5min，弃上清，对照组加入一定体积的无血清培养液和基础培养液的混合液，二者比例为1：9，实验组加入相同体积的上述体外培养液。将对照组和实验组置于35℃温箱培养24h，取精子镜检，记录精子活力。
(4)培养结果
如图3，在精子刚优化完时(0h)，对照组和实验组前向运动精子率无显著差异性(P>0.05)，在35℃下培养24h后，实验组前向运动精子率为91.33±1.53％，对照组仅为81.67±2.52％，实验组显著高于对照组(P<0.05)。
实施例2
1、MenSCs活性上清液的获取
方法步骤同实施例1。
2、对逆行射精男性精子的体外培养
(1)体外培养液制备
首先将上述收集的MenSCs活性上清液从-80℃冰箱中取出解冻；再将血清替代物(Serum Substitute Supplement，SSS，美国IrvineScientific公司)与配子准备液(Modified HTF Medium，mHTF，美国IrvineScientific公司)按1：9的比例混合制成基础培养液；然后将解冻好的MenSCs活性上清液与基础培养液以1：9的比例混合制成体外培养液；最后将制备好的体外培养液通过孔径为0.22μm的滤膜过滤，过滤后的液体即为可使用的体外培养液。
(2)精子的处理
收集逆行射精患者先排空膀胱再手淫射精后的尿液标本，将收集含有精子的尿液先220g离心5min，弃去上清，用2mL含10％SSS mHTF重悬精子沉淀，采用密度梯度离心法进行优化处理，在无菌离心管中加入1.0mLIsolate精子分离液(美国IrvineScientific公司)中的上层分离液，再在其底部加入等量下层分离液，将重悬后的精子沿着管壁缓慢加入分离液上方，保持界面清晰可见；置于离心机内，220g离心16min；吸取离心后的精子沉淀并加入含有1mL含10％SSS mHTF的新离心管中混合均匀。
(3)精子的培养
将上述精子悬液等分为二组，一组为对照组，另一组为实验组，将优化后的精子密度均调为10×106/mL，取精子镜检，记录精子活力。两组均在220g下离心5min，弃上清，对照组加入一定体积的无血清培养液和基础培养液的混合液，二者比例为1：9，实验组加入相同体积的上述体外培养液。将对照组和实验组置于35℃温箱培养24h，取精子镜检，记录精子活力。
(4)培养结果
如图4，在精子刚优化完时(0h)，对照组和实验组前向运动精子率无显著差异性(P>0.05)，在35℃下培养24h后，实验组前向运动精子率为67.33±4.16％，对照组仅为46.33±4.04％，实验组显著高于对照组(P<0.05)。
本发明的有益效果是：
本发明包含有MenSCs活性上清液，其中含有大量活性因子，可有效保护精子在体外不被氧化损伤，保持精子活力，可为ART治疗时提供更有活力的精子，以提高受精率和妊娠率，尤其是逆行射精患者。同时MenSCs可来源于不孕不育患者中的女方患者，整个治疗过程中没有来源于第三方的细胞，可有效杜绝生物感染的风险。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
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