一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基
阅读说明：本技术 一种用于st细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基 (Low-serum culture medium for ST cell culture and corresponding virus production ) 是由 房圆瑗 齐智 刘海英 孟丹丹 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基,包括以下组成成分：氨基酸、维生素、无机盐类、辅助成分和蛋白质；所述氨基酸包括甘氨酸、盐酸精氨、谷氨酰胺、盐酸赖氨酸、酪氨酸二钠盐二水合物；所述蛋白质包括重组胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；本发明制备的用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基中,使用甲骨文生物ST低血清培养基IV系列添加3%猪瘟专用新生牛血清情况下能够替代传统细胞培养基对ST细胞进行常规细胞培养,且细胞培养状态与数量均与传统培养方法无显著差异,保持细胞良好的生长状态；同时利用该培养体系可以较好地增殖猪瘟病毒,病毒滴度不小于50万倍RID。(The invention discloses a low serum culture medium for ST cell culture and corresponding virus production, which comprises the following components: amino acids, vitamins, inorganic salts, auxiliary components and proteins; the amino acid comprises glycine, arginine hydrochloride, glutamine, lysine hydrochloride and tyrosine disodium salt dihydrate; the protein comprises recombinant insulin, 4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid (HEPES); in the low serum culture medium prepared by the invention and used for ST cell culture and corresponding virus production, the conventional cell culture can be performed on ST cells by replacing the conventional cell culture medium under the condition that 3% special newborn calf serum for swine fever is added to an Ornithogen ST low serum culture medium IV series, and the cell culture state and the number have no obvious difference from those of the conventional culture method, so that the good growth state of the cells is maintained; meanwhile, the culture system can be used for better propagating the classical swine fever virus, and the virus titer is not less than 50 ten thousand times RID.)
技术领域
本发明涉及生物制药疫苗生产领域，具体是一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。
背景技术
传统ST细胞培养的培养方式为MEM培养基添加10％小牛血清培养细胞，血清用量大，成本高。
由于ST细胞在培养过程中对血清比较依赖，降低血清培养会出现细胞生长慢、细胞死亡等情况；市面上ST低血清培养基在普通基础培养基基础上添加成分种类多，成分复杂。进行猪瘟病毒生产时，接毒后细胞贴壁不牢，难以稳定生产，且产毒效果差，未达到半成品质量要求；基于此，我们提出一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：氨基酸、维生素、无机盐类、辅助成分和蛋白质；所述氨基酸包括甘氨酸5-10mg/L、丙氨酸5-10mg/L、盐酸精氨110-150mg/L、一水天门冬酰10-15mg/L、天门冬氨10-15mg/L、二盐酸胱氨酸20-40mg/L、谷氨酸10-15mg/L、谷氨酰胺200-350mg/L、一水盐酸组氨酸25-50mg/L、异亮氨酸25-60mg/L、亮氨酸25-60mg/L、盐酸赖氨酸50-80mg/L、甲硫氨酸10-20mg/L、苯丙氨酸20-40mg/L、脯氨酸10-15mg/L、丝氨酸10-15mg/L、苏氨酸25-50mg/L、色氨酸5-15mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物30-60mg/L、缬氨酸25-50mg/L、羟脯氨酸5-10mg/L；所述蛋白质包括人转铁蛋白5-10mg/L、重组胰岛素5-10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)1500-3400mg/L。
作为本发明进一步的方案：所述维生素包括生物素0.05-0.2mg/L、氯化胆碱
2-5mg/L、D-泛酸钙2-5mg/L、叶酸2-5mg/L、烟酰胺2-5mg/L、吡哆素盐酸盐0.1-0.3mg/L、盐酸吡哆醛0.1-0.3mg/L、核黄素0.1-0.3mg/L、盐酸硫胺素1-5mg/L、B12维生素0.1-0.3mg/L、i-肌醇5-10mg/L、维生素A醋酸酯0.01-0.05mg/L、维生素D
0.01-0.1mg/L、维生素K 0.005-0.01mg/L。
作为本发明再进一步的方案：所述无机盐类包括无水氯化钙150-200mg/L、无水硫酸镁50-120mg/L、氯化钾300-400mg/L、碳酸氢钠2500-3700mg/L、氯化钠5000-6000mg/L、一水磷酸二氢钠120-150mg/L、五水硫酸铜0.0005-0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.1-0.5mg/L、无水氯化镁10-30mg/L。
作为本发明再进一步的方案：所述辅助成分包括D-葡萄糖2000-5000mg/L、乙醇胺1-5mg/L、次黄嘌呤钠0.1-0.5mg/L、亚油酸0.1-0.5mg/L、酚红10-15mg/L、腐胺二盐酸2-6mg/L、丙酮酸钠90-120mg/L、还原型谷胱甘肽0.5-2.0mg/L、半乳糖100-300mg/L、腺嘌呤5-15mg/L、血清素5-15mg/L、水溶性胆固醇1-5mg/L、盐酸鸟嘌呤10-20mg/L、胸腺嘧啶0.1-0.5mg/L、尿嘧啶0.1-0.5mg/L、胸腺嘧啶核苷0.1-0.5mg/L。
作为本发明再进一步的方案：包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/L、丙氨酸8.9mg/L、盐酸精氨酸126mg/L、一水天门冬酰胺13.2mg/L、天门冬氨酸13.3mg/L、二盐酸胱氨酸31.28mg/L、谷氨酸14.7mg/L、谷氨酰胺292mg/L、一水盐酸组氨酸42mg/L、异亮氨酸52mg/L、亮氨酸52mg/L、盐酸赖氨酸72.5mg/L、甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸32mg/L、脯氨酸11.5mg/L、丝氨酸10.5mg/L、苏氨酸48mg/L、色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/L、缬氨酸46mg/L、羟脯氨酸6.8mg/L、生物素0.15mg/L、氯化胆碱3.5mg/L、D-泛酸钙3.5mg/L、叶酸3.5mg/L、烟酰胺3.5mg/L、吡哆素盐酸盐0.2mg/L、盐酸吡哆醛0.1mg/L、核黄素0.25mg/L、盐酸硫胺素3.5mg/L、B12维生素0.2mg/L、i-肌醇6.3mg/L、维生素A醋酸酯0.05mg/L、维生素D0.07mg/L、维生素K 0.008mg/L、无水氯化钙180mg/L、无水硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠2700mg/L、氯化钠5600mg/L、一水磷酸二氢钠130mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.3mg/L、无水氯化镁25mg/L、D-葡萄糖4000mg/L、乙醇胺2.5mg/L、次黄嘌呤钠0.4mg/L、亚油酸0.2mg/L、酚红12mg/L、腐胺二盐酸5.5mg/L、丙酮酸钠105mg/L、还原型谷胱甘肽1.7mg/L、半乳糖200mg/L、腺嘌呤12.5mg/L、血清素5.5mg/L、水溶性胆固醇2.8mg/L、盐酸鸟嘌呤14.5mg/L、胸腺嘧啶0.2mg/L、尿嘧啶0.2mg/L、胸腺嘧啶核苷0.38mg/L、人转铁蛋白6.5mg/L、重组胰岛素10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)2800mg/L。
作为本发明再进一步的方案：所述人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白。
作为本发明再进一步的方案：所述重组胰岛素为全链重组胰岛素。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制备的用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基中，使用甲骨文生物ST低血清培养基IV系列添加3％猪瘟专用新生牛血清情况下能够替代传统细胞培养基对ST细胞进行常规细胞培养，且细胞培养状态与数量均与传统培养方法无显著差异，保持细胞良好的生长状态；同时利用该培养体系可以较好地增殖猪瘟病毒，病毒滴度不小于50万倍RID。
附图说明
图1为MEM培养F3代细胞显微镜观察结果。
图2为LSM培养F3代细胞显微镜观察结果。
图3为家兔校验中家兔反应为早期(61h)出现双定性热反应。
图4为家兔校验中家兔反应为早期(60h)出现双定性热反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/L、丙氨酸8.9mg/L、盐酸精氨酸126mg/L、一水天门冬酰胺13.2mg/L、天门冬氨酸13.3mg/L、二盐酸胱氨酸31.28mg/L、谷氨酸14.7mg/L、谷氨酰胺292mg/L、一水盐酸组氨酸42mg/L、异亮氨酸52mg/L、亮氨酸52mg/L、盐酸赖氨酸72.5mg/L、甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸32mg/L、脯氨酸11.5mg/L、丝氨酸10.5mg/L、苏氨酸48mg/L、色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/L、缬氨酸46mg/L、羟脯氨酸6.8mg/L、生物素0.15mg/L、氯化胆碱3.5mg/L、D-泛酸钙3.5mg/L、叶酸3.5mg/L、烟酰胺3.5mg/L、吡哆素盐酸盐0.2mg/L、盐酸吡哆醛0.1mg/L、核黄素0.25mg/L、盐酸硫胺素3.5mg/L、B12维生素0.2mg/L、i-肌醇6.3mg/L、维生素A醋酸酯0.05mg/L、维生素D 0.07mg/L、维生素K 0.008mg/L、无水氯化钙180mg/L、无水硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠2700mg/L、氯化钠5600mg/L、一水磷酸二氢钠130mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.3mg/L、无水氯化镁25mg/L、D-葡萄糖4000mg/L、乙醇胺2.5mg/L、次黄嘌呤钠0.4mg/L、亚油酸0.2mg/L、酚红12mg/L、腐胺二盐酸5.5mg/L、丙酮酸钠105mg/L、还原型谷胱甘肽1.7mg/L、半乳糖200mg/L、腺嘌呤12.5mg/L、血清素5.5mg/L、水溶性胆固醇2.8mg/L、盐酸鸟嘌呤14.5mg/L、胸腺嘧啶0.2mg/L、尿嘧啶0.2mg/L、胸腺嘧啶核苷0.38mg/L、人转铁蛋白6.5mg/L、重组胰岛素10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)2800mg/L。
其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。
实施例2
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸5mg/L、丙氨酸5mg/L、盐酸精氨酸110mg/L、一水天门冬酰胺10mg/L、天门冬氨酸10mg/L、二盐酸胱氨酸20mg/L、谷氨酸10mg/L、谷氨酰胺200mg/L、一水盐酸组氨酸25mg/L、异亮氨酸25mg/L、亮氨酸25mg/L、盐酸赖氨酸50mg/L、甲硫氨酸10mg/L、苯丙氨酸20mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸25mg/L、色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物30mg/L、缬氨酸25mg/L、羟脯氨酸5mg/L、生物素0.05mg/L、氯化胆碱2mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸2mg/L、烟酰胺2mg/L、吡哆素盐酸盐0.1mg/L、盐酸吡哆醛0.1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、B12维生素0.1mg/L、i-肌醇5mg/L、维生素A醋酸酯0.01mg/L、维生素D 0.01mg/L、维生素K 0.005mg/L、无水氯化钙150mg/L、无水硫酸镁50mg/L、氯化钾300mg/L、碳酸氢钠2500mg/L、氯化钠5000mg/L、一水磷酸二氢钠120mg/L、五水硫酸铜0.0005mg/L、七水合硫酸亚铁0.1mg/L、无水氯化镁10mg/L、D-葡萄糖2000mg/L、乙醇胺1mg/L、次黄嘌呤钠0.1mg/L、亚油酸0.1mg/L、酚红10mg/L、腐胺二盐酸2mg/L、丙酮酸钠90mg/L、还原型谷胱甘肽0.5mg/L、半乳糖100mg/L、腺嘌呤5mg/L、血清素5mg/L、水溶性胆固醇1mg/L、盐酸鸟嘌呤10mg/L、胸腺嘧啶0.1mg/L、尿嘧啶0.1mg/L、胸腺嘧啶核苷0.1mg/L、人转铁蛋白5mg/L、重组胰岛素5mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)1500mg/L。
其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。
实施例3
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸10mg/L、丙氨酸10mg/L、盐酸精氨酸150mg/L、一水天门冬酰胺15mg/L、天门冬氨酸15mg/L、二盐酸胱氨酸40mg/L、谷氨酸15mg/L、谷氨酰胺350mg/L、一水盐酸组氨酸50mg/L、异亮氨酸60mg/L、亮氨酸60mg/L、盐酸赖氨酸80mg/L、甲硫氨酸20mg/L、苯丙氨酸40mg/L、脯氨酸15mg/L、丝氨酸15mg/L、苏氨酸50mg/L、色氨酸15mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物60mg/L、缬氨酸50mg/L、羟脯氨酸10mg/L、生物素0.2mg/L、氯化胆碱5mg/L、D-泛酸钙5mg/L、叶酸5mg/L、烟酰胺5mg/L、吡哆素盐酸盐0.3mg/L、盐酸吡哆醛0.3mg/L、核黄素0.3mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、B12维生素0.3mg/L、i-肌醇10mg/L、维生素A醋酸酯0.05mg/L、维生素D 0.1mg/L、维生素K 0.001mg/L、无水氯化钙200mg/L、无水硫酸镁120mg/L、氯化钾400mg/L、碳酸氢钠3700mg/L、氯化钠6000mg/L、一水磷酸二氢钠150mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.5mg/L、无水氯化镁30mg/L、D-葡萄糖5000mg/L、乙醇胺5mg/L、次黄嘌呤钠0.5mg/L、亚油酸0.5mg/L、酚红15mg/L、腐胺二盐酸6mg/L、丙酮酸钠120mg/L、还原型谷胱甘肽2mg/L、半乳糖300mg/L、腺嘌呤15mg/L、血清素15mg/L、水溶性胆固醇5mg/L、盐酸鸟嘌呤20mg/L、胸腺嘧啶0.5mg/L、尿嘧啶0.5mg/L、胸腺嘧啶核苷0.5mg/L、人转铁蛋白10mg/L、重组胰岛素10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)3400mg/L。
其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。
实施例4
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸5mg/L、丙氨酸5mg/L、盐酸精氨酸110mg/L、一水天门冬酰胺10mg/L、天门冬氨酸10mg/L、二盐酸胱氨酸20mg/L、谷氨酸10mg/L、谷氨酰胺200mg/L、一水盐酸组氨酸25mg/L、异亮氨酸25mg/L、亮氨酸25mg/L、盐酸赖氨酸50mg/L、甲硫氨酸10mg/L、苯丙氨酸20mg/L、脯氨酸10mg/L、丝氨酸10mg/L、苏氨酸25mg/L、色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物30mg/L、缬氨酸25mg/L、羟脯氨酸5mg/L、生物素0.05mg/L、氯化胆碱2mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸2mg/L、烟酰胺2mg/L、吡哆素盐酸盐0.1mg/L、盐酸吡哆醛0.1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、B12维生素0.1mg/L、i-肌醇5mg/L、维生素A醋酸酯0.01mg/L、维生素D 0.01mg/L、维生素K 0.005mg/L、无水氯化钙180mg/L、无水硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠2700mg/L、氯化钠5600mg/L、一水磷酸二氢钠130mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.3mg/L、无水氯化镁25mg/L、D-葡萄糖4000mg/L、乙醇胺2.5mg/L、次黄嘌呤钠0.4mg/L、亚油酸0.2mg/L、酚红12mg/L、腐胺二盐酸5.5mg/L、丙酮酸钠105mg/L、还原型谷胱甘肽1.7mg/L、半乳糖200mg/L、腺嘌呤12.5mg/L、血清素5.5mg/L、水溶性胆固醇2.8mg/L、盐酸鸟嘌呤14.5mg/L、胸腺嘧啶0.2mg/L、尿嘧啶0.2mg/L、胸腺嘧啶核苷0.38mg/L、人转铁蛋白6.5mg/L、重组胰岛素10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)2800mg/L。
其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。
实施例5
一种用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸7.5mg/L、丙氨酸8.9mg/L、盐酸精氨酸126mg/L、一水天门冬酰胺13.2mg/L、天门冬氨酸13.3mg/L、二盐酸胱氨酸31.28mg/L、谷氨酸14.7mg/L、谷氨酰胺292mg/L、一水盐酸组氨酸42mg/L、异亮氨酸52mg/L、亮氨酸52mg/L、盐酸赖氨酸72.5mg/L、甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸32mg/L、脯氨酸11.5mg/L、丝氨酸10.5mg/L、苏氨酸48mg/L、色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐二水合物51.9mg/L、缬氨酸46mg/L、羟脯氨酸6.8mg/L、生物素0.15mg/L、氯化胆碱3.5mg/L、D-泛酸钙3.5mg/L、叶酸3.5mg/L、烟酰胺3.5mg/L、吡哆素盐酸盐0.2mg/L、盐酸吡哆醛0.1mg/L、核黄素0.25mg/L、盐酸硫胺素3.5mg/L、B12维生素0.2mg/L、i-肌醇6.3mg/L、维生素A醋酸酯0.05mg/L、维生素D 0.07mg/L、维生素K 0.008mg/L、无水氯化钙180mg/L、无水硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠2700mg/L、氯化钠5600mg/L、一水磷酸二氢钠130mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、七水合硫酸亚铁0.3mg/L、无水氯化镁25mg/L、D-葡萄糖5000mg/L、乙醇胺5mg/L、次黄嘌呤钠0.5mg/L、亚油酸0.5mg/L、酚红15mg/L、腐胺二盐酸6mg/L、丙酮酸钠120mg/L、还原型谷胱甘肽2mg/L、半乳糖300mg/L、腺嘌呤15mg/L、血清素15mg/L、水溶性胆固醇5mg/L、盐酸鸟嘌呤20mg/L、胸腺嘧啶0.5mg/L、尿嘧啶0.5mg/L、胸腺嘧啶核苷0.5mg/L、人转铁蛋白10mg/L、重组胰岛素10mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)3400mg/L。
其中，人转铁蛋白为饱和铁人转铁蛋白；重组胰岛素为全链重组胰岛素。
采用实施例1-5配方配制的培养基与对照组进行细胞培养测试：
实验组细胞状态良好，与阳性对照没有较大差别。而阴性对照组细胞数较少，有较多的死亡细胞。
ST细胞低血清培养体系增殖猪瘟病毒实验
实验步骤如下：
1)取常规条件培养良好的单层ST细胞，每克氏瓶接种约2.0×107cells，共计接种2瓶；
2)对照组添加MEM+8％BS生长液约120ml。实验组添加LSM+3％BS生长液约120ml；
3)37℃静止密闭培养72h后，以3.1方式连续传代3代；
4)分别对对照组、实验组的F3代细胞评价生长状态，并进行细胞计数。3.5将F3代生长良好的单层细胞，接入符合要求的猪瘟种毒，接毒量3％，每收次按规定时间收获病毒，共计五收次。收获后病毒将1-5收次混合，用家兔检测50万倍稀释后的RID。
实验结果
显微镜下观察可见实验组与对照组细胞生长形态均一，无聚团、单细胞巨化生长，细胞变圆界线清晰，细胞生长状态良好，二者无显著差异(图中颜色差异为显微镜光线差异)(图1、图2)
利用血球计数板将F3代实验ST细胞进行计数，结果如下(表1)：
表1.
计数结果显示，实验组与对照组细胞数量无显著差异。
1-5收次混合后利用家兔进行校检结果显示：利用LSM培养的ST细胞可以较好地增殖猪瘟病毒，且家兔反应为早期(60h、61h)出现双定性热反应，病毒滴度不小于50万倍RID。本次实验未按规定将每收次分别测定RID，也未进一步做100万倍RID检测，旨在验证总体产毒情况，推断部分单收次可能超过100万倍RID(图3、图4)。
本发明制备的用于ST细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基中，使用甲骨文生物ST低血清培养基IV系列添加3％猪瘟专用新生牛血清情况下能够替代传统细胞培养基对ST细胞进行常规细胞培养，且细胞培养状态与数量均与传统培养方法无显著差异，保持细胞良好的生长状态；同时利用该培养体系可以较好地增殖猪瘟病毒，病毒滴度不小于50万倍RID。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。