抗程序性死亡配体1(pd-l1)抗体及其治疗用途
阅读说明：本技术 抗程序性死亡配体1(pd-l1)抗体及其治疗用途 (Anti-programmed death ligand 1(PD-L1) antibodies and therapeutic uses thereof ) 是由 张英 于 2017-02-16 设计创作，主要内容包括：提供了抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体、其使用方法、其治疗组合物,以及其用于上调细胞介导的免疫应答和治疗T细胞功能障碍性病症的用途。也提供了抗PD-L1抗体作为体外诊断剂的用途。(Anti-programmed death ligand 1(PD-L1) antibodies, methods of use thereof, therapeutic compositions thereof, and uses thereof for upregulating cell-mediated immune responses and treating T cell dysfunctional disorders are provided. Also provided is the use of an anti-PD-L1 antibody as an in vitro diagnostic agent.)
技术领域
本发明涉及与程序性细胞死亡配体1(PD-1)结合的抗体或功能性结合片段，特别是使用那些抗体的治疗和诊断方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
PD-L1是一种40kDa的I型跨膜蛋白，据推测其在抑制免疫系统中起主要作用。PD-L1/PD-1和PD-L1/B7.1复合体的形成负调节T细胞受体信号传导，导致随后下调T细胞活化和抑制抗肿瘤免疫活性。
PD-L1调节慢性感染、妊娠、组织同种异体移植、自身免疫疾病和癌症期间免疫系统应答的抑制中的免疫应答。
PD-L1与活化的T细胞、B细胞、单核细胞和骨髓细胞上发现的PD-L1受体PD-1结合，以调节活化或抑制。PD-L1对共刺激分子CD80(B7-1)也具有明显的亲和性。
PD-L1与其受体PD-1在T细胞上的接合提供了抑制TCR介导的活化IL-2产生和T细胞增殖的信号。该机制涉及抑制ZAP70磷酸化及其与OD3ζ的结合。PD-L1与PD-1的结合也通过诱导E3泛素连接酶CBL-b的上调，在抗原呈递给幼稚T细胞期间有助于配体诱导的TCR下调。
PD-L1在许多癌症中过度表达，包括多种实体瘤和血液恶性肿瘤，如骨髓瘤、***癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、涎腺癌、胃癌、甲状腺肿瘤、淋巴瘤和膀胱癌。肿瘤细胞中PD-L1过表达可能促进肿瘤侵袭，并且通常与预后不良有关。
此外，在许多癌症中，PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)上过表达。
鉴于PD-L1在癌症发展和免疫系统调节中的作用，需要检测PD-L1存在的额外工具，例如用于诊断和/或患者选择。
PD-L1靶的阻断治疗在许多类型的癌症中显示出有希望的临床益处。本领域需要靶向PD-L1的药剂，用于治疗PD-L1相关病症，例如癌症。本发明满足了这种需要并提供了其他益处。
PD-L1的单克隆抗体是本领域已知的，并且已描述于例如美国专利/公开号US8217149、US20130309250、US20160009805、US7943743B2和WO专利/公开号WO2007005874A2、WO2010077634A1、WO2011066342A2、WO2011066389A1、WO2014100079A1、WO2013173223A1中。
发明内容
本发明涉及抗PD-L1抗体及其使用方法。
本公开提供了可以充当PD-L1的激动剂和/或拮抗剂的抗体，从而调节由PD-L1调节的免疫应答。本公开还提供了包含新型抗原结合片段的抗PD-1抗体。本发明的抗PD-L1抗体能够：
(A)特异性结合PD-L1，包括人PD-L1；
(B)阻断PD-L1与其(一种或多种)天然配体的相互作用；
(C)在混合淋巴细胞反应(MLR)中增加T-细胞增殖；
(D)通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤癌细胞；
(E)通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤癌细胞；
(F)通过补体依赖性细胞毒性(CDC)杀伤癌细胞；
(G)杀伤NSG小鼠骨髓瘤癌细胞并延长存活率；
(H)杀伤骨髓瘤癌细胞并延长SCID淋巴瘤小鼠的存活率；或者
(i)执行上述所有功能。
在特定的实施方案中，衍生自小鼠并由小鼠定义的两种抗体包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)和它们的互补决定区(CDR)，其总结于下表：
具体实施方式
通常，本发明提供特异性结合PD-L1的小鼠抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本发明提供了小鼠抗体或抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1，并且包含由SEQ ID NO：1、3、5和7组成的核酸序列。
另一方面，本发明提供了小鼠抗体或抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1，并且包含由SEQ ID NO：2、4、6和8组成的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了小鼠抗体或抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1，并且包含选自SEQ ID NO：9-11(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)及其变体；和/或选自SEQ ID NO：12-14(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)或其变体。
另一方面，本发明提供了小鼠抗体或抗原结合片段，其特异性结合人PD-L1，并且包含选自SEQ ID NO：15-17(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)的重链可变区(H-CVR)及其变体；和/或选自SEQ ID NO：18-20(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)的轻链可变区(L-CVR)或其变体。
优选地，本发明的小鼠抗PD-L1抗体选自Q106和Q107。
在优选的实施方案中，本发明提供了抗PD-L1抗体或抗原结合片段，其被要求保护为小鼠抗体或片段。
在其他优选的实施方案中，本发明提供了小鼠抗体或片段，其包含进一步含有小鼠IgG或其具有重链FR区的变体的重链可变区(H-CVR)。
在其他优选的实施方案中，本发明提供了小鼠抗体或片段，其进一步含有小鼠IgGκ或其具有轻链恒定区的变体。
在优选的实施方案中，本发明提供了小鼠抗体或片段，其包含进一步含有小鼠λ链或其具有轻链FR区的变体的轻链可变区(L-CVR)。
在优选的实施方案中，本发明提供了抗PD-L1抗体或抗原结合片段，其包含嵌合抗体或片段。
在其他优选的实施方案中，本发明提供嵌合抗体或片段，其进一步含有小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG4和/或具有重链FR区的变体。
在一方面，本发明的特征在于分离的抗体，其特异性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体包含以下可变区(CDR)：H-CDR-1、H-CDR2和H-CDR3。在一些实施方案中，抗体还包含以下重链结构域框架区(FR)：FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4。
在一些实施方案中，抗体还包含以下CDR：CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗体还包含以下轻链可变域框架区(FR)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4。
在一些实施方案中，抗体包含(a)具有至少95％序列相同性的VH序列；(b)具有至少95％序列相同性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
另一方面，本发明的特征在于分离的抗体，其与任何一种现有抗体竞争结合PD-L1。另一方面，本发明的特征在于分离的抗体，其与任何一种现有抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，任何一种现有抗体可以是特异性结合PD-L1的抗体片段。
在一些实施方案中，抗体片段选自Fab、单链可变片段(scFv)、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和双抗体。
另一方面，本发明提供了分离的核酸或DNA分子，其编码本文所述的任何抗体。
另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸组合物，其包含抗PD-L1抗体轻链的多核苷酸或多核苷酸的功能片段，以及抗PD-L1抗体重链的多核苷酸或其功能片段。
另一方面，本发明的特征在于抗PD-L1抗体的双特异性分子或其抗原结合片段的双特异性分子。本发明的抗体或抗原结合部分可以衍生化或连接另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或配体受体)，以产生至少两种不同的双特异性结合分子结合位点或靶分子。事实上，本发明的抗体可以衍生化或连接多于一种的其他功能分子上，以产生多于两种不同的结合位点和/或靶分子结合多特异性分子；这些多特异性分子也旨在如本文所用。
在一些特定实施方案中，根据本发明的抗PD-L1抗体或其功能片段阻断相互作用，和/或与PD-1和PD-L2和/或PD-L1和CD80相互作用。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗PD-L1抗体或功能片段在制备用于增强T细胞免疫应答的药物中的用途。在一些实施方案中，增强的免疫应答包括增强T细胞增殖。
在一些特定实施方案中，其中PD-L1抗体通过补体依赖性细胞毒性(CDC)执行细胞溶解活性诱导肿瘤细胞杀伤。
在一些特定实施方案中，其中PD-L1抗体通过具有增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而表现出抗肿瘤活性。
在一些特定实施方案中，其中PD-L1抗体通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进一步杀伤NSG骨髓瘤小鼠中的肿瘤细胞并提高其存活率。
在一些特定实施方案中，其中PD-L1抗体与化疗药物lenalidomide联合，进一步杀伤SCID骨髓瘤小鼠中的骨髓瘤细胞并提高其存活率。
另一方面，本发明提供了根据本发明的抗PD-L1抗体或功能片段用于治疗或预防癌症(最优选骨髓瘤和淋巴瘤)或感染性疾病的药物的用途。
本发明进一步提供了根据本发明的PD-L1抗体或功能片段来治疗和预防PD-L1介导的疾病或病症的方法，或包含其药物组合物的联合疗法；优选地，其中所述疾病是癌症，最优选骨髓瘤、淋巴瘤；和乳腺癌、***癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肾癌，黑素瘤、非小细胞肺癌。
实施例
本发明提供了结合PD-L1的新型抗体。通过使用这种新型抗PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1途径，本发明的抗体可用于例如癌症治疗。
提供以下实施例以进一步解释和说明一些目前优选的实施方案，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例-1：抗PD-L1小鼠抗体的产生
通过杂交瘤技术产生抗PD-L1小鼠单克隆抗体。简而言之，编码人PD-L1的DNA序列在人293T细胞与小鼠IgG1的Fc区的C末端一起表达。用完全弗氏佐剂乳化的纯化的PD-L1抗原免疫Balb/c小鼠，然后用一系列不完全弗氏佐剂乳化的PD-L1抗原加强。使用包被的PD-L1抗原，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选表达抗体的融合细胞。进一步选择产生具有最高特异性的抗体的所有ELISA阳性克隆。最后选择两种抗-PD-L1单克隆抗体，命名为Q106和Q107，并通过体外细胞培养方法在无血清培养基中进一步生产，随后通过蛋白A亲和层析纯化。
实施例-2：通过ELISA筛选抗PD-L1小鼠抗体
通过间接ELISA测定测量针对重组人PD-L1的抗PD-L1抗体的筛选。将96孔Falcon3912聚氯乙烯微量滴定板(Becton Dickinson Inc，Oxnard，CA)用100μL重组人PD-L1-Fc在4℃包被过夜。将板用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次，然后用含有4％BSA的PBS封闭以防止非特异性结合。将100μL杂交瘤上清液加入到每个孔中并在室温孵育2小时。将孔用PBST洗涤三次，并加入100μL HPR-缀合的山羊抗小鼠二抗(Biolegend，cat#405306)，并在室温进一步孵育2小时。洗涤后，向每个孔中加入邻苯二胺二盐酸盐(OPD)过氧化物酶底物，并将板在室温孵育20分钟。使用0.36N H2SO4终止反应，并通过ELISA板读仪(VersaMax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)在490nm的波长读取光密度。将装有抗PD-L1血清的孔用作阳性对照。总共获得45个阳性克隆，并通过有限稀释克隆来连续传代。将该步骤重复三次以获得稳定的单个杂交瘤。结果显示，具有最高滴度的两个阳性克隆Q106和Q107可以稳定地分泌针对人PD-L1的单克隆抗体。
实施例-3：抗PD-L1抗体的特异性
该实施例显示了本发明的抗PD-L1抗体对人PD-L1的特异性。另外，它显示了两种抗体Q106和Q107对在293T转染的细胞的细胞膜上表达的人PD-L1的亲和性(图1A)。人PD-L1稳定地转染到293T细胞中。收获细胞并以每孔150,000个细胞接种在96孔板中用于结合测定。PD-L1抗体Q106、Q107或同种型抗体对照从10μg/ml开始以三倍系列稀释滴定，并在冰上与50μl体积的细胞结合25分钟。洗涤细胞，然后用20μg/ml抗小鼠IgG PE(BD Biosciences)在冰上检测25分钟。
所有样品均在Miltenyi Biotech MACSQuant上运行，并使用Tree Star提供的
流式细胞术分析还显示PD-L1抗体Q106和Q107在野生型和PD-L1敲低套细胞淋巴瘤细胞系Granta519(图1B)和多发性骨髓瘤细胞系U266(图1C)中的特异性。
实施例-4：抗PD-L1抗体在不同癌细胞系中的细胞表面结合
将亲和纯化的实施例1中的Q106和Q107抗体与荧光染料PE(Invitrogen)缀合。将人骨髓瘤、乳腺癌和***癌细胞系维持在补充有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)的RPMI-1640培养基(Fisher Scientific，Herndon，VA)中。将细胞离心并用PBS洗涤，然后用PE缀合的Q106和Q107抗体分别染色，在冰上孵育30分钟，并在分析前洗涤3次。用FACSCantoll(Becton Dickinson)收集流式细胞术数据，并用FlowJo V.9.1软件(TreeStar)分析。在FACS分析中Q106和Q107PD-L1抗体均可与人骨髓瘤细胞系(ARH-77和U266)、乳腺癌细胞系(MB-231和MCF-7)和***癌细胞系(PC-3和LN3)的细胞PD-L1蛋白结合(图2)。
实施例-5：抗PD-L1抗体体外增强T细胞增殖
使用磁性细胞分选(Miltenyi Biotec)从健康供体的PBMC中纯化同种异体CD3+、CD4+和CD8+T细胞。用5(6)-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE；5μM；Invitrogen)在37℃标记CD3+T细胞10分钟。洗涤后，将T细胞(5×104/100μL/孔)接种入96孔U形底组织培养板(Corning Glassworks)并与辐照的MM细胞系ARH-77在37℃在5％CO2中在补充有10％合并的人血清的Aim-V培养基(T细胞培养基)中共培养6-10天。流式细胞术分析用于检测CFSE的稀释。抗PD-L1抗体Q106和Q107可以在CFSE稀释测定中显著增加CD3+(图3A)、CD4+(图3B)和CD8+(图3C)T细胞增殖。
实施例-6：通过抗PD-L1抗体增强CTL体外杀伤活性
A.产生肿瘤反应性同种异体抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞系
将同种异体CD3+T细胞与经辐照的ARH-77在T细胞培养基中共培养。共培养7天后，收获CD3+T细胞并用新辐照的上述肿瘤细胞再刺激。向培养物中补充含有重组IL-2(10IU/ml)、IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)(R&D Systems)的新鲜T细胞培养基。每周通过流式细胞术监测CD3+CD8+T细胞的频率。在体外再刺激至少4次重复循环后，产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)-细胞系，并命名为CTL-ARH-77。将CTL细胞系在含有重组IL-2(10IU/ml)、IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)的T细胞培养基中扩增2周，并进行功能测试。
B.细胞毒性测定
进行标准4小时51Cr释放测定以测量T细胞系与靶细胞(包括ARH-77、U266、ARP-1、K562、B细胞、PBMC和从多发性骨髓瘤患者分离的原发性肿瘤细胞)的细胞溶解活性。为了确定细胞溶解活性是否受到主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子的限制，靶细胞用20μg/ml针对HLA-ABC的抗体(SerotecLtd)、针对HLA-DR的抗体(Immunotech)或针对对照IgG的抗体(eBioscience)预处理。
如上所述产生来自HLA-A*0201+健康血液供体的ARH-77-反应性CTL-细胞系。如图4A所示，在CFSE稀释测定中应用Q106抗体时，肿瘤反应性CD8+T细胞在CTL细胞系中的百分比增加。接下来，检查ARH-77CTL细胞系的细胞溶解活性。数据显示，CTL细胞不仅杀伤了刺激性ARH-77细胞系，还杀伤了HLA-A*0201+U266和原代MM细胞(患者1和2)。在HLA-A*0201～ARP-1、ARK和原代MM细胞(患者3和4)或K562细胞上完全没有观察到杀伤(图4B)，表明NK细胞不负责杀伤。此外，从HLA-A*0201+供体和MM患者纯化的正常同种异体(到T细胞)PBMC和B细胞用作靶细胞以证明CTL细胞是否对正常细胞有细胞溶解性。如图4B所示，尽管T细胞是同种异体抗原特异性的，但未观察到针对正常B细胞或PBMC的杀伤。
更重要的是，当MM传代细胞系或MM原代细胞分别用抗PD-L1抗体Q106和Q107预孵育时，这些细胞对杀伤更敏感(图4B；P<0.05至P<0.01)。
实施例-7：由抗PD-L1抗体诱导的通过ADCC杀伤的肿瘤细胞。
通过51-铬(51-Cr)释放测定测量ADCC。在ADCC测定，来自正常志愿者的纯化的PBMC用作效应细胞。将靶细胞(1×106)与200μCi的51-Cr在37℃孵育1小时，同时以15分钟间隔温和重悬沉淀。洗涤后，将细胞以10,000个细胞/孔接种在不同PBMC浓度的96孔U形底板中。然后加入终浓度为5至20μg/ml的抗体溶液。抗PD-L1抗体Q106和Q107以及小鼠IgG1(BioLegend)用作测试组和同种型对照。然后将细胞在37℃孵育4小时，并使用Gamma计数器分析释放的51-Cr。测定在不添加抗体和PBMC的情况下从靶细胞的自发释放，以及在不添加抗体和PBMC的情况下用6％TritonX-100测定从靶细胞的最大释放。以[(样品中的计数-自发释放)/(最大计数-自发释放)]*100％计算细胞毒性百分比。所有实验一式三份进行。数据显示抗PD-L1抗体Q106和Q107诱导的ADCC杀伤血液肿瘤细胞(图5A)和实体癌细胞(图5B)。
实施例-8：由抗PD-L1抗体诱导的通过CDC杀伤的肿瘤细胞
如实施例7中所示，通过51-铬(51-Cr)释放测定测量CDC。在CDC测定中，使用豚鼠血清(Sigma-Aldrich)作为补体来源。将靶细胞(1×106)与200μCi的51-Cr在37℃孵育1小时，同时以15分钟间隔温和重悬沉淀。洗涤后，将细胞以10,000个细胞/孔接种在不同豚鼠血清浓度的96孔U形底板中。然后加入终浓度为5至20μg/ml的抗体溶液。抗PD-L1抗体Q106和Q107以及小鼠IgG1(BioLegend)用作测试组和同种型对照。然后将细胞在37℃孵育4小时，并使用Gamma计数器分析释放的51-Cr。测定在不添加抗体和豚鼠血清的情况下从靶细胞的自发释放，以及在不添加抗体和豚鼠血清的情况下用6％TritonX-100测定从靶细胞的最大释放。以[(样品中的计数-自发释放)/(最大计数-自发释放)]*100％计算细胞毒性百分比。所有实验一式三份进行。数据显示抗PD-L1抗体Q106和Q107诱导的CDC杀伤血液肿瘤细胞(图6A)和实体癌细胞(图6B)。
实施例-9：NSG骨髓瘤小鼠模型中PD-L1抗体的免疫疗法
现在明显的是，许多肿瘤利用PD-1配体的表达作为减弱抗肿瘤T细胞应答的手段。已经表征了几种人类癌症在肿瘤和肿瘤浸润性白细胞上表达的PD-L1水平升高，并且这种升高的PD-L1表达通常与更差的预后相关。小鼠肿瘤模型显示肿瘤内PD-L1表达的类似增加，并证明PD-1/PD-L1途径在抑制肿瘤免疫中的作用。
在这里，我们提出了一个实验，证明阻断PD-L1对NSG小鼠生长的多发性骨髓瘤U266的影响(图7A和7B)。通过流式细胞术评估这些细胞在其细胞表面上表达PD-L1但不表达PD-L2。在第0天，用1百万U266细胞静脉内接种小鼠。在第14天(当在发光图像中观察到肿瘤时)，用10mg/kg的PD-L1抗体(Q106)治疗处理10只小鼠/组，以3x/周持续研究。在该研究中，小鼠IgG用作对照。在晚期干预中阻断PD-L1作为预防肿瘤生长的单一药剂疗法是非常有效的。相反，对照IgG未显示出抑制肿瘤生长的迹象。这些结果证明了PD-1/PD-L1轴在抑制抗肿瘤免疫应答中的独特作用，并支持用阻断PD-L1与PD-1和B7.1相互作用的抗体治疗人类癌症的可能性。
U266NSG肿瘤模型：有条理地，在第0天，将40只小鼠静脉内接种100微升含1百万U266-荧光素酶细胞的PBS。肿瘤接种后每周在IVIS成像系统中拍摄图像。约2-3周后，将具有相似尺寸肿瘤的40只小鼠中的30只募集到如下列出的3个处理组之一。通过每周拍摄图像来测量肿瘤。由于肿瘤体积不同，未被招募到下面处理组的小鼠被安乐死：
第1组：PBS对照，IP，100μL，3x/周；
第2组：IgG对照，10mg/kg IP，100μL，3x/周；
第3组：抗PD-L1抗体Q106，10mg/kg IP，100μL，3x/周。
实施例-10：PD-L1抗体与lenalidomide在SCID骨髓瘤小鼠模型中的联合免疫疗法。
显示了接受不同处理的小鼠的生物发光图像(图8A)、肿瘤负荷(图8B)和存活(图8C)。显示了进行的两个独立实验的代表性结果。误差棒＝SEM。与小鼠IgG对照相比，*P<0.05。
在第0天，将60只SCID小鼠皮下接种100微升含2百万个U266-荧光素酶骨髓瘤细胞的PBS加基质胶。允许小鼠生长肿瘤。称重小鼠并以2x/周测量直至第15天(当肿瘤体积在100-200mm3之间时)。在第15天，在肿瘤测量后，将小鼠招募到以下4个处理组之一。由于肿瘤体积不同，未被招募到下面的处理组中的小鼠被安乐死。
第1组：IgG对照，10mg/kg IP，100μL，3x/周×5，n＝10；
第2组：抗PD-L1抗体Q106，10mg/kg IP，100μL，3x/周×5，n＝10；
组3：Lenalidomide，10mg/kg IP，100μL，持续5天，休息2天，持续3周，n＝10；
第4组：抗PD-L1抗体Q106+Lenalidomide，n＝10。
测量肿瘤，拍摄发光图像，小鼠称重2X/周。表现出体重减轻>15％的动物每天称重，并且如果它们失去>20％体重则实施安乐死。当肿瘤体积超过3,000mm3时，小鼠将被安乐死，或者如果肿瘤不形成，则在3个月后对小鼠实施安乐死。
该研究表明抗PD-L1抗体Q106与Lenalidomide阻断的联合免疫疗法比单独使用PD-L1抗体或Lenalidomide化疗更有效(图8A-C)。
其他实施方案
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开明确地整体通过援引加入。
表1 EC50总结
mAbs
在FACS中的EC<sub>50</sub>(nM)
Q106
0.3
Q107
0.5
表2 VH、VL及其CDR结构域的DNA和氨基酸序列
V<sub>H</sub>/V<sub>L</sub>/CDR
Q106的序列ID
Q10711的序列ID
V<sub>H</sub>DNA
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:5
V<sub>H</sub>AA
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:6
V<sub>L</sub>DNA
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:7
V<sub>L</sub>AA
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:8
H-CDR1AA
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:15
H-CDR2AA
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:16
H-CDR3AA
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:17
L-CDR1AA
SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:18
L-CDR2AA
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:19
L-CDR3AA
SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:20
参考保藏生物材料
不适用于此申请。
序列表自由文本
参见序列表文件-RUNSHIN
专利文献
PTL1：WO2013173223A1
PTL2：WO2007005874A2
PTL3：WO2010077634A1
PTL4：WO2011066342A2
PTL5：WO2011066389A1
PTL6：WO2014100079A1
PTL7：US8217149
非专利文献
NPL1：NPL1:Julie R.Brahmer,Scott S.Tykodi,Laura Q.M.Chow,Safety andActivity of Anti-PD-L1Antibody in Patients with Advanced Cancer N Engl JMed.2012；366(26):2455-65.
NPL2：Webster RM.The immune checkpoint inhibitors:where are we now？NatRev Drug Discov.2014；13(12):883—4.
NPL3：Keir ME,Butte MJ,Freeman GJ,Sharpe AH.PD-1and its ligands intolerance and immunity.Annu Rev lmmunol.2008；26:677-704.
NPL4：Velcheti V,Schalper KA,Carvajal DE,et al.Programmed deathligand-1expression in non-small cell lung cancer.Lab Invest.2014；94:107-16.
NPL5：Christophe Massard,Michael S.Gordon,Sunil Sharma,Safety andEfficacy of Durvalumab(MEDI4736),an Anti-Programmed Cell Death Ligand-1ImmuneCheckpoint Inhibitor,in Patients With Advanced Urothelial Bladder Cancer,JClin Oncol,2016,34,9761.
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附图说明
参考以下附图可以更全面地理解本发明。
图1A
流式细胞术分析显示抗PD-L1抗体Q106和Q107在野生型和表达PD-L1的293T细胞系中的结合特异性。
图1B
流式细胞术分析显示抗PD-L1抗体Q106和Q107在野生型和PD-L1敲低套细胞淋巴瘤细胞系中的结合特异性。
图1C
流式细胞术分析显示抗PD-L1抗体Q106和Q107在野生型和PD-L1敲低多发性骨髓瘤细胞系中的细胞表面结合特异性。
图2
流式细胞术分析显示抗PD-L1抗体Q106和Q107在不同癌细胞系的细胞结合。
图3A
抗PD-L1抗体Q106和Q107在CFSE稀释测定中增加CD3+T细胞增殖。
图3B
抗PD-L1抗体Q106和Q107在CFSE稀释测定中增加CD4+T细胞增殖。
图3C
抗-PD-L1抗体Q106和Q107在CFSE稀释测定中增加CD8+T细胞增殖。
图4A
抗PD-L1抗体Q106在CFSE稀释测定中增强CTL细胞增殖。
图4B
抗PD-L1抗体Q106和Q107在51Cr细胞毒性测定中通过增强的CTL杀伤癌细胞。
图5A
抗PD-L1抗体Q106和Q107通过诱导的ADCC杀伤血液肿瘤细胞。
图5B
抗PD-L1抗体Q106和Q107通过诱导的ADCC杀伤实体癌细胞。
图6A
抗PD-L1抗体Q106和Q107通过诱导的CDC杀伤血液肿瘤细胞。
图6B
抗PD-L1抗体Q106和Q107通过诱导的CDC杀伤实体癌细胞。
图7A
PD-L1抗体Q106在NSG骨髓瘤小鼠模型中的免疫疗法。
图7B
PD-L1抗体Q106在NSG骨髓瘤小鼠模型的免疫疗法的存活曲线。
图8A
PD-L1抗体Q106与lenalidomide在SCID骨髓瘤小鼠模型中的联合免疫疗法。
图8B
PD-L1抗体Q106与lenalidomide的联合免疫疗法抑制SCID骨髓瘤小鼠模型中的肿瘤生长。
图8C
PD-L1抗体Q106与lenalidomide的联合免疫疗法提高了SCID骨髓瘤小鼠模型的存活率。
序列表
<110> 湘潭腾华生物科技有限公司
张英
<120> 抗程序性死亡配体1 (PD-L1)抗体及其治疗用途
<130> DL1Q2017PCT
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