阅读说明：本技术 利用谷氨酸棒状杆菌的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法 (Production method of 3' -fucosyllactose using corynebacterium glutamicum ) 是由 徐镇浩 郑相珉 李道行 全炯度 于 2018-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用野生型谷氨酸棒状杆菌菌株制造3’-岩藻糖基乳糖的方法,使用GRAS菌株即谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株,可以安全地生产3’-岩藻糖基乳糖,并且可以高浓度、高收率、高生产率生产3’-岩藻糖基乳糖。(The present invention relates to a method for producing 3 '-fucosyllactose using a wild-type Corynebacterium glutamicum strain, which can produce 3' -fucosyllactose safely and with high concentration, high yield and high productivity using a GRAS strain, i.e., a Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) strain.)

利用谷氨酸棒状杆菌的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法

技术领域

本发明涉及一种利用野生型谷氨酸棒状杆菌菌株从3’-岩藻糖基乳糖生产变异微生物以及葡萄糖、乳糖中制造岩藻糖基乳糖的方法，详细地，涉及一种利用将磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase,ManB)、GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase,ManC)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase,Gmd)、GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase,WcaG)、α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)和去除lacZ的变异lac操纵子引入棒状杆菌中的重组谷氨酸棒状杆菌生产3’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

人的母乳中具有200多种以上的具有各自不同结构的低聚糖(Human MilkOligosaccharide,HMO)，并且与其它哺乳类相比，其以相当高的浓度(5～15g/L)存在。这种HMO具有益生元(prebiotic)效果、病原菌肠内附着抑制效果以及免疫调节系统调节效果等婴幼儿必备的功能性。

另一方面，据报道在HMO中，3’-岩藻糖基乳糖是参与多种生物学活性的主要HMO。作为3’-岩藻糖基乳糖的生产方法，有直接从母乳提取的方法和通过化学或者酶方法合成的方法。但是，直接提取的方法存在母乳供求限制和生产率低的缺点，化学合成方法存在基质昂贵、异构体选择性(stereo-selectivity)和生产收率低以及有毒有机溶剂的使用等问题。并且，酶合成方法存在用作岩藻糖的供体(donor)的GDP-L-fucose非常昂贵，岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的提炼费用高的缺点。

因此，直接提取、化学或者酶生产方法目前还难以应用于岩藻糖基乳糖的大量生产。但是，利用微生物的生物工程生产方法可以通过简单的过程从廉价的基质中大量生产岩藻糖基乳糖，因此作为生产具有开发为健康功能性食品以及医药品原材料的可能性的3’-岩藻糖基乳糖的方法而备受关注。

另一方面，利用微生物生产3’-岩藻糖基乳糖的现有技术大部分是利用重组大肠杆菌的生产技术。用于实验的大肠杆菌实际上并不是病原菌，但消费者普遍认为是有害菌，并且细胞膜成分有可能起到内毒素作用，因此存在分离提炼费用高的缺点，从而，目前还难以将大肠杆菌用作生产食品以及医药品的原材料即3’-岩藻糖基乳糖的宿主细胞。

韩国授权专利第10-1544184号(授权日期：2015.08.21)涉及一种用于生产2’-岩藻糖基乳糖的变异微生物以及利用其的2’-岩藻糖基乳糖的制造方法，公开了一种引入或放大选自由引入lacZ变形或被去除的操纵子以及对FucT2或其变体进行编码的基因、对G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase)以及GSK(guanosine-inosine kinase)进行编码的基因组成的组中的一种以上的基因的变异微生物以及利用其制造2’-岩藻糖基乳糖的方法。

韩国授权专利第10-1648352号(授权日期：2016.08.09)涉及一种对岩藻糖代谢酶即岩藻糖异构酶(fucose isomerase,FucI)、墨角藻糖激酶(fuculose kinase,FucK)以及墨角藻糖1-磷酸醛缩酶(fuculose 1-phosphate aldolase,FucA)进行编码的基因中的任一种以上被破碎，并且保留“由对活性低于野生型β半乳糖苷酶的β半乳糖苷酶进行编码的lacZ基因、野生型lacY基因以及野生型lacA基因构成的lac操纵子”或“完全去除野生型lacZ基因并且仅由野生型lacY基因以及野生型lacA基因构成的lac操纵子”代替“野生型lac操纵子”的岩藻糖基乳糖生产用重组大肠杆菌以及利用其的岩藻糖基乳糖的生产方法，公开了一种可以高生产率生产2-或3-岩藻糖基乳糖的方法。

发明内容

技术课题

本发明的目的在于开发并提供作为生产食品以及医药品的原材料即岩藻糖基乳糖的宿主细胞，利用比大肠杆菌安全的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，且以高浓度、高收率、高生产率生产3’-岩藻糖基乳糖的方法。

解决课题的手段

本发明提供一种重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，转化为表达出α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)，转化为表达出GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)，转化为表达出GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)，转化为表达出乳糖渗透酶(lactose permease)，保留磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)以及GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)。

在本发明的重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，上述α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)优选使用由azoT基因加密的。此时，优选地，上述azoT基因可以由序列号5的核酸序列构成。

在本发明的重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，优选地，上述重组谷氨酸棒状杆菌转化为超表达出磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)，转化为超表达出GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphateguanylyltransferase)。

本发明提供一种3’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，在添加有乳糖的培养基中培养重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)转化为表达出α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)，转化为表达出GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)，转化为表达出GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)，转化为表达出乳糖渗透酶(lactose permease)，保留磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)以及GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)。

在本发明的3’-岩藻糖基乳糖生产方法中，优选地，上述培养基还包含葡萄糖。此时，更优选地，上述岩藻糖基乳糖的生产方法可以是附加供给葡萄糖或者乳糖的分批培养或者补料分批培养。

发明效果

根据本发明，通过使用GRAS菌株即谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株，可以生产3’-岩藻糖基乳糖，并且与常规大肠杆菌相比，可以安全地生产3’-岩藻糖基乳糖。并且，当利用本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株时，可以高浓度、高收率、高生产率生产3’-岩藻糖基乳糖。

附图说明

图1是为了从谷氨酸棒状杆菌菌株中生物合成GDP-L-fucose以及3’-岩藻糖基乳糖而引入的代谢途径的示意图。

图2是通过HPLC测量在谷氨酸棒状杆菌pVBCL+pEGWA(pEGW+azoT)中生产的3’-岩藻糖基乳糖的结果。

图3是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWA的烧瓶分批培养结果的图。当光密度(OD₆₀₀)达到约0.8时，添加IPTG和乳糖使得最终浓度分别达到1.0mM、10g/L(箭头)。图中的符号如下：●：干燥细胞重量，▲：葡萄糖，■：乳糖，▼：乳酸盐(lactate)，◆：3’-岩藻糖基乳糖。

图4是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的补料分批培养结果的图。在全部消耗完初期投入的40g/L葡萄糖之后，开始以连续式(continuousfeeding)方法供给葡萄糖，同时添加了IPTG和乳糖(箭头)。图中的符号如下：●：干燥细胞重量，▲：葡萄糖，■：乳糖，▼：乳酸盐，◆：3’-岩藻糖基乳糖。

具体实施方式

本发明提供一种重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，转化为表达出α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)，转化为表达出GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)，转化为表达出GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)，转化为表达出乳糖渗透酶(lactose permease)，保留磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)以及GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)。

本发明人之前通过韩国专利申请号第10-2016-0012803号(2016.02.02)申请过利用大肠杆菌的3’-岩藻糖基乳糖生产方法。但是，多次被指出将3’-岩藻糖基乳糖用作功能性食品添加剂时，由于大肠杆菌所具有的各种安全性问题，将其通过大肠杆菌来生产时存在一些问题。因此，本发明试图通过在食品安全上不存在问题的代替菌株来生产3’-岩藻糖基乳糖。

在本发明中，作为生产3’-岩藻糖基乳糖的宿主细胞，选择了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，与常规使用的大肠杆菌不同，该菌株不仅是被认定为GRAS(generally recognized as safe)的菌株，而且是不产生内毒素，并且广泛应用于作为食品添加剂的氨基酸以及核酸的产业性生产的菌株。因此，可以说谷氨酸棒状杆菌是适合生产食品以及医药品的原材料的菌株，具有可以打消消费者对于安全性方面的担忧的优点。

但是，大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的菌株本身的遗传特性不同，因此需要使用与应用于大肠杆菌的策略不同的策略。为了生产3’-岩藻糖基乳糖，大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌基本上都需要引入外来的α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)，但是，谷氨酸棒状杆菌除此之外还需进一步引入GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase,Gmd)、GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase，该酶还被称为“GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reductase”。并且，简称为“WcaG”，将对该酶进行加密的基因特别称为“WcaG”)、乳糖渗透酶(lactose permease,LacY)。即，大肠杆菌具有对GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase,Gmd)、GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase,WcaG)、乳糖渗透酶(lactose permease,LacY)进行加密的基因，但谷氨酸棒状杆菌菌株不具有加密上述酶的基因，因此需要将其从外部引入并表达出来。

此时，优选地，加密上述α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)的基因优选地使用源自巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的基因(azoT)。并且，对GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase,Gmd)、GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose-synthase,WcaG)以及乳糖渗透酶(lactose permease,LacY)进行加密的基因使用源自大肠杆菌的基因。

另一方面，优选地，本发明的重组谷氨酸棒状杆菌转化为超表达出磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)，转化为超表达出GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)。谷氨酸棒状杆菌本身可以保留对磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase,ManB)、GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase,ManC)进行加密的基因，并表达出来，因此无需非要引入加密该酶的基因，但是，为了大量生产，需要超表达该基因。因此，在本发明中，优选地，需要将谷氨酸棒状杆菌转化为能够超表达该两个酶。

另一方面，上述酶的作用可通过图1理解，因此省略其详细说明。然而，特别说明的是，乳糖渗透酶(lactose permease,LacY)是参与将存在于菌株外部的乳糖输送至菌株内部的酶。在以下本发明的实施例中，引入从大肠杆菌的Lac操纵子去除lacZ的lacYA基因后进行了实验，但是，在本发明中引入Lac操纵子的目的在于引入乳糖，因此仅引入lacY基因即可，而无需非要引入lacA基因。

另一方面，本发明中使用的术语“表达”是指对于本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株本身无法表达的酶，为了人为地表达，向菌株内引入外源基因实现表达，术语“超表达”是指本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株本身具有加密对应酶的基因，可以自行表达，但是，为了大量生产而增加其表达量，人为地增加对应酶的表达量，从而超表达。

另一方面，本发明人通过上述的转化策略，可以确认从谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中可以大量生产母乳低聚糖即3’-岩藻糖基乳糖。

另一方面，在本发明中，对上述α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)进行编码的基因最好使用被azoT基因加密的基因，优选地，上述azoT基因可以由序列号5的核酸序列构成。为了生产α-1,3-岩藻糖基乳糖，需要以GDP-L-岩藻糖和(GDP-L-fucose)和乳糖(lactose)基质进行α-1,3-岩藻糖基乳糖生产反应的α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)(参见图1)。该酶存在于多种微生物中，并且在本发明中，使用源自巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的基因(azoT)。当使用其他来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶时，3’-岩藻糖基乳糖的产量微不足道，但当使用azoT基因时，与使用其他来源相比，3’-岩藻糖基乳糖的产量明显提高。

另一方面，本发明提供一种3’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，在添加有乳糖的培养基中培养本发明的重组谷氨酸棒状杆菌。在利用本发明的重组谷氨酸棒状杆菌菌株时，可以高浓度、高收率、高生产率生产3’-岩藻糖基乳糖。

另一方面，在上述本发明的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法中，优选地，上述培养基还包含葡萄糖。通过将葡萄糖附加到培养基中，菌株的生长变得活跃，从而可以更高的生产率生产3’-岩藻糖基乳糖。

另一方面，上述本发明的3’-岩藻糖基乳糖的生产方法可以通过分批或者附加供给乳糖的补料分批培养来进行。关于分批或者补料分批培养的具体细节技术可以采用本领域公知技术，因此省略对其的记载。

另一方面，本发明的菌株谷氨酸棒状杆菌为了将3’-FL生产的基质即乳糖引入菌体内而引入了乳糖渗透酶(lactose permease)。即，为了利用谷氨酸棒状杆菌生产3’-FL，需要用能够将乳糖引入菌体内的乳糖渗透酶转化，而本发明的菌株是用该酶转化的。

但是，乳糖渗透酶通常在葡萄糖存在下受到“glucose repression(葡萄糖阻遏)”，从而抑制其活性。其结果，在葡萄糖存在下不发生乳糖的引入，最终无法生产3-FL。

但是，在本发明中用作生产3’-FL的宿主菌株的谷氨酸棒状杆菌中不发生“glucose repression(葡萄糖阻遏)”作用，因此即使在葡萄糖的存在下，也可以根据乳糖的引入来生产3’-FL，由此可使3’-FL的生产率最大化。

另一方面，通过本发明的以下实验确认了，利用本发明的谷氨酸棒状杆菌的3’-FL的生产方法以“nongrowth-associated product formation”的生产模式生产3’-FL。

代谢产物的生产与宿主菌株的生长无关地生产的“nongrowth-associatedproduct formation”不同时要求用于生产代谢产物的宿主菌株的生长，因此具有大量培养宿主菌株后，可通过投入基质在短时间内大量生产代谢产物的优点。并且，还可以重复使用培养中使用的宿主菌株，因此具有使生产率最大化的优点。因此，在本发明中，使用谷氨酸棒状杆菌组建的3’-FL生产方法是能够使3’-FL的生产最大化的方法。

下面，通过以下实施例更加详细说明本发明的内容。但是，本发明的保护范围并不仅仅限定于以下实施例，而甚至包括与其等同的技术思想的变形。

[实施例1：重组菌株以及质粒的制备]

克隆化利用了大肠杆菌(Escherichia coli TOP10)以制备质粒，利用了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032以生产3’-岩藻糖基乳糖(3’-fucosyllactose,3’-FL)。利用了表达从先前研究中开发的manB和manC以及lacYA基因簇的pVBCL表达用质粒。并且，为了在表达gmd和wcaG基因的pEGW表达用质粒中表达α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase(azoT))，组建了载体。此时，α-1,3-岩藻糖基转移酶(azoT)源自巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)ATCC 29145，利用Sac1的限制酶将α-1,3-岩藻糖基转移酶(azoT)***pEGW载体中。

另一方面，将上述使用的manB、manC、gmd、WcaG、lacYA以及α-1,3-岩藻糖基转移酶(azoT)的基因序列、菌株、质粒以及寡核苷酸示于下表1至3中。

[表1]

基因名	序列号
		manB	序列号1
manC	序列号2
		gmd-wcaG	序列号3
lacYA	序列号4
		azoT	序列号5

[表2]

[表3]

[实施例2：利用重组谷氨酸棒状杆菌的3’-岩藻糖基乳糖的生产]

(1)培养条件以及方法

种菌培养中使用了装有包含适当的抗生素(kanamycin 25μg/mL,tetracycline 5μg/mL)的5mL的BHI(Brain Heart Infusion)培养基的实验管，温度为30℃，搅拌速度维持在250rpm，培养了12小时。

在装有100mL((NH₄)₂SO₄ 20g/L，urea 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.25g/L，MOPS 42g/L，CaCl₂ 10mg/L，Biotin 0.2mg/L，Protocatechuic acid 30mg/L，FeSO₄7H20 10mg/L，MnSO₄H₂O 10mg/L，ZnSO₄7H₂O 1mg/L，CuSO₄ 0.2mg/L，NiCl₂6H₂O 0.02mg/L，pH7.0)的250ml烧瓶中，30℃下进行了分批培养。将搅拌速度维持在250rpm并进行了培养。分批培养时，在光密度(OD₆₀₀)达到0.8时，添加IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)、乳糖使得最终浓度分别达到1.0mM、10g/L。

用于高浓度细胞培养的补料分批培养在包括包含40g/L的葡萄糖以及适当的抗生素(kanamycin 25μg/mL,tetracycline 5μg/mL)的1.0L的最低培养基的2.5L容积的生物反应器(bioreactor,Kobiotech,Incheon,Korea)中实施。

在初期添加的葡萄糖完全耗尽后，以5.7g/L/h的速度，连续式(continuousfeeding)方法供给了包含800g/L的葡萄糖的进料溶液(feeding solution)。同时，为了引导tac启动子介导基因表达以生产3’-岩藻糖基乳糖，添加IPTG、乳糖使得最终浓度达到1.0mM、10g/L。

发酵过程中，如果培养基的pH低于设定点(set-point)，则自动供给28％NH₄OH，如果高于设定点，则添加2N HCl，以使pH维持在一定范围内(pH6.98～7.02)。使用pH电极(Mettler Toledo,USA)实时测量了培养基的pH。为了防止缺氧，搅拌速度以及通气速度分别维持在1000rpm以及2vvm。

(2)细胞以及代谢产物的浓度的决定

对光密度(optical density,OD)乘以事先测量的变换常数0.3来决定了干燥细胞重量。将样品适当稀释以使光密度调节在0.1～0.5之间的范围后，使用分光光度计(spectrophotometer,Ultrospec 2000,Amersham Pharmacia Biotech,USA)，在吸光度600nm下测量了光密度(OD)。

利用安装有“Carbohydrate Analysis column(Rezex ROA-organic acid,Phenomenex,USA)”以及“RI(refractive index)”检测仪的HPLC(high performanceliquid chromatography)(Agilent 1100LC,USA)测量了3’-岩藻糖基乳糖、乳糖、乳酸盐、葡萄糖以及醋酸的浓度。应用60℃下加热的层析柱，分析了稀释10倍的20μl的培养基。以0.6mL/min流速，以流动相使用了5mM的H₂SO₄溶液。

(3)通过分批培养生产3’岩藻糖基乳糖

为了确认3’-岩藻糖基乳糖生产性能以及发酵特征，将引入ManB、ManC、Gmd、WcaG,、azoT以及去除lacZ的lac操纵子(lacYA)的重组谷氨酸棒状杆菌分别在烧瓶中进行了分批培养。在光密度(OD₆₀₀)达到0.8时，添加IPTG、乳糖使得最终浓度分别达到1.0mM、10g/L。

烧瓶分批培养的结果，生产出390mg/L的3’-岩藻糖基乳糖，此时的2’-岩藻糖基乳糖相对于乳糖的收率为0.32mole 2’-岩藻糖基乳糖/mole乳糖，生产率为5.49mg/L/h(图3以及表4)。图2是通过HPLC测量在谷氨酸棒状杆菌pVBCL+pEGWA(pEGW+azoT)中生产的3’-岩藻糖基乳糖的结果。上述分批培养的结果记载于下表4中，图3是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWA的烧瓶分批培养结果的图。

[表4]

利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWA的烧瓶分批培养结果

(4)通过补料分批培养生产3’岩藻糖基乳糖

为了通过高浓度的细胞培养生产高浓度3’-岩藻糖基乳糖，利用引入pVBCL、pEGWA质粒的重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，在2.5L水平的发酵机中进行了补料分批培养。

从全部消耗完初期添加的40g/L的葡萄糖的时刻起，为了维持细胞生长，利用连续式(continuous feeding)方法，以5.7g/L/h的速度供给了进料溶液(feeding solution)。同时，为了引导3’-岩藻糖基乳糖的生产，添加了IPTG和乳糖。

实验结果，在发酵期间根本没有生成醋酸，通过葡萄糖的代谢，细胞最终达到干燥细胞重量48.9g/L。并且，最高3’-岩藻糖基乳糖的浓度为3.6g/L，相对于乳糖的生产收率为0.17mole 3’-岩藻糖基乳糖/mole乳糖，生产率为0.03g/L/h(图4以及表5)。

用于生产3’-岩藻糖基乳糖的补料分批培养的结果记载于下表5中，图4是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌pVBCL+pEGWA的补料分批培养结果的图。

[表5]

利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWA的烧瓶补料分批培养结果

<110> 首尔大学校产学协力团

<120> 用于生产3'-岩藻糖基乳糖的重组谷氨酸棒状杆菌以及由此生产3'-岩藻糖基乳糖的方法

<130> YP-18-055

<150> KR 10-2017-0051871

<151> 2017-04-21

<160> 7

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 1

atgcgtaccc gtgaatctgt cacggctgta attaaggcgt atgacgtccg tggtgttgtt 60

ggtgtcgata ttgatgctga tttcatttct gagactggcg ctgcctttgg tcggctcatg 120

cgtagtgagg gtgaaaccac cgttgctatt ggccatgaca tgcgtgattc ctcccctgaa 180

ttggccaagg cgtttgccga tggcgtgact gcacagggtt tggatgttgt tcatttggga 240

ctgacttcta ctgatgagct gtactttgcg tccggaacct tgaagtgtgc tggtgcgatg 300

tttactgcgt cgcataaccc cgctgagtac aacggcatca agttgtgtcg tgcgggtgct 360

cgtccggtcg gtcaggattc tggtttggcc aacatcattg atgatctggt tgagggtgtt 420

ccagcgtttg atggtgagtc aggttcggtt tctgagcagg atttgctgag cgcatatgcc 480

gagtacctca atgagcttgt tgatctgaag aacatccgcc cgttgaaggt tgctgtggat 540

gcggcaaacg gcatgggtgg gttcactgtc cctgaggtat tcaagggtct gccacttgat 600

gttgcgccac tgtattttga gcttgacggc aatttcccca accatgaggc caatcctctg 660

gagcctgcca acctggttga tttgcagaag tttaccgtag agaccggatc tgatatcggt 720

ttggcgttcg acggcgatgc ggatcgttgc ttcgtggtcg atgagaaggg ccagccagtc 780

agcccttcgg cgatctgtgc gatcgtagcg gagcgttact tggagaagct tccgggttcc 840

accatcatcc acaacctgat tacctctaag gctgtgcctg aggtgattgc tgaaaacggt 900

ggcactgcgg tgcgtactcg cgtgggtcac tccttcatca aggcgaagat ggcagagacc 960

ggtgcggcct ttggtggcga gcactctgcg cactactact tcactgagtt cttcaatgcg 1020

gactccggca ttttggctgc gatgcacgtg ctggctgcgc tgggaagcca ggaccagcca 1080

ctcagtgaga tgatggctag gtataaccgg tacgttgctt caggcgagtt gaactcccgt 1140

ttggctaatg cagaggcgca gcaagagcgc acccaggctg tgctcgatgc gttcgctgat 1200

cgcaccgagt ccgtggacac ccttgacggc gtgactgtgg aactcaagga cacctccgcg 1260

tggttcaacg tgcgtgcgtc caacaccgag ccgctgcttc gcctcaatgt tgaagctgca 1320

tcgaaggaag aagtcgatgc gttggtagcg gagattctag ggattatccg cgcataa 1377

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 2

atgactttaa ctgacaacag caaaaacgtt gatgctgtca tcttggtcgg tggcaaaggt 60

acccgactgc gccccctgac cgtcaatact ccaaagccaa tgctgccaac tgctggccac 120

ccattcttga cccacctttt ggcccgcatc aaggccgcag gcatcacaca cgtcgtgctg 180

ggaacgtcat tcaaagctga agtcttcgag gaatacttcg gagatggctc cgaaatgggc 240

ttggaaattg aatatgtcgt cgaggatcag cctttgggca ctggtggtgg catccgaaac 300

gtctacgaca agctgcgtca cgatactgcg attgtgttca acggcgatgt gctctccggt 360

gcggatctca acagcattct ggacacccac cgcgaaaagg acgcagatct gaccatgcat 420

ctcgtgcgcg tagctaaccc tcgtgcgttt ggttgcgtcc ccaccgatga ggatggtcgc 480

gtcagcgaat tccttgaaaa gaccgaagat ccaccaaccg atcagatcaa cgccggctgc 540

tacgtgttca agaaggaact catcgagcag atcccggcag gccgagcagt ttccgtcgag 600

cgcgaaacct tccctcagct gttggaagaa ggcaagcgag tcttcggcca cgtcgacgct 660

tcctactggc gcgacatggg caccccaagc gacttcgtcc gcggctcggc tgacctggtc 720

cgcggcattg cgtactcccc attgctcgaa ggcaaaacag gagagtcgct tgtcgacgcc 780

tccgccggcg ttcgcgacgg cgtcctgctg ctcggcggaa ccgtagtcgg ccgcggcact 840

gagatcggtg ccggctgccg cgttgacaac actgttattt tcgacggcgt caccattgaa 900

ccaggtgcgg tcattgaaaa ttccatcatt tcctcgggag cacgcatcgg tgctaatgcg 960

cacatctccg gttgcatcat tggcgagggc gcacaggttg gtgctcggtg tgaactcaac 1020

gcagggatgc gcgtcttccc aggcgttgtg atcccagaca gcggaattcg tttttcgtct 1080

gatcagtag 1089

<210> 3

<211> 2090

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> E.coli K-12 MG1655

<400> 3

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aagcatgagt aaacaacgag 1140

tttttattgc tggtcatcgc gggatggtcg gttccgccat caggcggcag ctcgaacagc 1200

gcggtgatgt ggaactggta ttacgcaccc gcgacgagct gaacctgctg gacagccgcg 1260

ccgtgcatga tttctttgcc agcgaacgta ttgaccaggt ctatctggcg gcggcgaaag 1320

tgggcggcat tgttgccaac aacacctatc cggcggattt catctaccag aacatgatga 1380

ttgagagcaa catcattcac gccgcgcatc agaacgacgt gaacaaactg ctgtttctcg 1440

gatcgtcctg catctacccg aaactggcaa aacagccgat ggcagaaagc gagttgttgc 1500

agggcacgct ggagccgact aacgagcctt atgctattgc caaaatcgcc gggatcaaac 1560

tgtgcgaatc atacaaccgc cagtacggac gcgattaccg ctcagtcatg ccgaccaacc 1620

tgtacgggcc acacgacaac ttccacccga gtaattcgca tgtgatccca gcattgctgc 1680

gtcgcttcca cgaggcgacg gcacagaatg cgccggacgt ggtggtatgg ggcagcggta 1740

caccgatgcg cgaatttctg cacgtcgatg atatggcggc ggcgagcatt catgtcatgg 1800

agctggcgca tgaagtctgg ctggagaaca cccagccgat gttgtcgcac attaacgtcg 1860

gcacgggcgt tgactgcact atccgcgagc tggcgcaaac catcgccaaa gtggtgggtt 1920

acaaaggccg ggtggttttt gatgccagca aaccggatgg cacgccgcgc aaactgctgg 1980

atgtgacgcg cctgcatcag cttggctggt atcacgaaat ctcactggaa gcggggcttg 2040

ccagcactta ccagtggttc cttgagaatc aagaccgctt tcgggggtaa 2090

<210> 4

<211> 3335

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> E.coli BL21star(DE3)

<400> 4

accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa 60

ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc 120

tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg 180

gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa 240

ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg 300

ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg 360

gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc 420

gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga tgccattgct 480

gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc 540

atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc 600

gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt 660

ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa 720

cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag 780

ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg cgcaatgcgc 840

gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg atacgacgat 900

accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg 960

ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc ggtgaagggc 1020

aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa 1080

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 1140

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 1200

ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 1260

atttcacaca ggaaacagct atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt 1320

tattcttttt cttttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc 1380

tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc 1440

tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca 1500

aatacctgct gtggattatt accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta 1560

tcttcgggcc actgttacaa tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc 1620

taggcttttg ttttaacgcc ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc 1680

gtcgcagtaa tttcgaattt ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt 1740

gtgcctcgat tgtcggcatc atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct 1800

ctggctgtgc actcatcctc gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt 1860

ctgccacggt tgccaatgcg gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac 1920

tggaactgtt cagacagcca aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct 1980

gcacctacga tgtttttgac caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg 2040

gtgaacaggg tacgcgggta tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct 2100

cgattatgtt ctttgcgcca ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc 2160

tggctggcac tattatgtct gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg 2220

aagtggttat tctgaaaacg ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct 2280

ttaaatatat taccagccag tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt 2340

tctgcttctt taagcaactg gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg 2400

aaagcatcgg tttccagggc gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct 2460

taatttccgt gttcacgctt agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga 2520

atgaagtcgc ttaagcaatc aatgtcggat gcggcgcgag cgccttatcc gaccaacata 2580

tcataacgga gtgatcgcat tgaacatgcc aatgaccgaa agaataagag caggcaagct 2640

atttaccgat atgtgcgaag gcttaccgga aaaaagactt cgtgggaaaa cgttaatgta 2700

tgagtttaat cactcgcatc catcagaagt tgaaaaaaga gaaagcctga ttaaagaaat 2760

gtttgccacg gtaggggaaa acgcctgggt agaaccgcct gtctatttct cttacggttc 2820

caacatccat ataggccgca atttttatgc aaatttcaat ttaaccattg tcgatgacta 2880

cacggtaaca atcggtgata acgtactgat tgcacccaac gttactcttt ccgttacggg 2940

acaccctgta caccatgaat tgagaaaaaa cggcgagatg tactcttttc cgataacgat 3000

tggcaataac gtctggatcg gaagtcatgt ggttattaat ccaggcgtca ccatcgggga 3060

taattctgtt attggcgcgg gtagtatcgt cacaaaagac attccaccaa acgtcgtggc 3120

ggctggcgtt ccttgtcggg ttattcgcga aataaacgac cgggataagc actattattt 3180

caaagattat aaagttgaat cgtcagttta aattataaaa attgcctgat acgctgcgct 3240

tatcaggcct acaagttcag cgatctacat tagccgcatc cggcatgaac aaagcgcagg 3300

aacaagcgtc gcatcatgcc tctttgaccc acagc 3335

<210> 5

<211> 978

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> Azospirillum brasilense ATCC 29145

<400> 5

atgctcgatc agcggacaag cgcgtttctt gaggaattcc tggcgaagcc gggcggcgat 60

cccgagcggc tcgaccgctt cctgctgcac ggcccgtacc gcggccggcg cggcggcaaa 120

ccgcggctga agctggcctt ccacgacttc tggccggagt tcgacaaggg cacgaacttc 180

ttcatcgaga tcctgtccag ccgcttcgac ctgtcggtgg tcgaggacga cagcgacctc 240

gccatcgtgt cggtcttcgg cgggcggcac cgcgaggcgc gcagccgccg caccctgttc 300

ttcaccgggg agaacgtgcg cccgccgttg gacggcttcg acatggcggt gtccttcgac 360

cgcgtcgacg acccgcgcca ttaccgcctg ccgctctacg tcatgcacgc ctacgagcac 420

atgcgggagg gggcggtgcc gcatttctgt tcgccggtcc tgccgccggt gccgccgacg 480

cgggcggcct tcgcggagcg cggcttctgc gccttcctct acaagaaccc gaacggggag 540

cgccgcaacc gcttcttccc ggtgctggac gggcggcggc gcgtcgattc ggtgggctgg 600

cacctgaaca acaccggcag cgtcgtcaag atgggctggc tgtcgaagat ccgcgtcttc 660

gaacgctacc gtttcgcctt cgccttcgag aacgccagcc atcccggcta tctgacggaa 720

aagatcctgg acgtcttcca ggccggggcg gtgccgctct attggggtga tcccgacctg 780

gagcgcgagg tggcggtcgg cagcttcatc gacgtgtcgc gcttcgccac ggacgaggag 840

gcggtggacc acatccttgc ggtggacgac gattacgacg cctattgcgc ccaccgcgcc 900

gtggcgccct tcctggggac ggaggagttt tatttcgacg cctaccgcct cgccgactgg 960

atcgagagcc ggctgtaa 978

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F_inf_sac1_azoT

<400> 6

gctttcgggg gtaagagctc aaggagatat acaatgctcg atcagcggac aagc 54

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R_inf_sac1_azoT

<400> 7

cggccagtga attcgagctc ttacagccgg ctctcgatcc 40