一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体、表达系统和应用

文档序号：1751428 发布日期：2019-11-29 浏览：39次 >En<

阅读说明：本技术 一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体、表达系统和应用 (A kind of recombinant vector, expression system and application suitable for Corynebacterium glutamicum secreting, expressing zytase ) 是由刘秀霞张伟白仲虎杨艳坤刘春立于 2019-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体,其能实现于谷氨酸棒杆菌高分泌表达木聚糖酶。一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体,其特征在于：重组载体包括可操作性连接的序列原件：AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列、SD序列、cspB信号肽和木聚糖酶基因,AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列和SD序列连接构成的片段其序列如SEQ ID NO.1所示,cspB信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示。AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列、SD序列、cspB信号肽和木聚糖酶基因构成双顺反子结构,能够实现木聚糖酶于谷氨酸棒杆菌的高分泌表达,酶活达到486.2 U/ml。(The present invention provides a kind of recombinant vector suitable for Corynebacterium glutamicum secreting, expressing zytase, it is able to achieve in Corynebacterium glutamicum hypersecretion expressed xylanase.A kind of recombinant vector suitable for Corynebacterium glutamicum secreting, expressing zytase, it is characterized by: recombinant vector includes the sequence original part of operability connection: AH6 promoter, 5 ' UTR and its preceding 38bp sequence, SD sequence, cspB signal peptide and xylanase gene, its sequence of segment that AH6 promoter, 5 ' UTR and its preceding 38bp sequence and SD sequence connect and compose is as shown in SEQ ID NO.1, and the sequence of cspB signal peptide is as shown in SEQ ID NO.2.AH6 promoter, 5 ' UTR and its preceding 38bp sequence, SD sequence, cspB signal peptide and xylanase gene constitute bicistronic construct, and the hypersecretion that can be realized zytase in Corynebacterium glutamicum is expressed, and enzyme activity reaches 486.2 U/ml.)

技术领域

本发明涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体、表达系统和应用。

背景技术

木聚糖酶是一种能够催化木聚糖生成低聚木糖或木寡糖的一类酶的总称，其切割部位为底物的β-1，4糖苷键。木聚糖酶属于重要的工业酶类，在食品及造纸等行业有较大的应用价值。

谷氨酸棒杆菌除作为氨基酸和有机酸生产之外，还是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主。相对于大肠杆菌表达宿主，谷氨酸棒杆菌表达体系具有如下优势：无内毒素，较为安全；可溶性分泌表达，表达的外源蛋白能够分泌到胞外，纯化较为容易。在利用谷氨酸棒杆菌进行氨基酸生产的过程中积累了大量发酵技术和经验，可为外源蛋白的大规模生产提供基础和借鉴。

基于上述原因，我们提出利用谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶，一方面可以实现分泌表达，另一方面又可以免于内毒素引起的应用上的限制。但现有载体无法实现木聚糖酶于谷氨酸棒杆菌分泌表达。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体，其能实现于谷氨酸棒杆菌高分泌表达木聚糖酶。

其技术方案是这样的，一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体，其特征在于：所述重组载体包括可操作性连接的序列原件：AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列、SD序列、cspB信号肽和木聚糖酶基因，AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列和SD序列连接构成的片段其序列如SEQ ID NO.1所示，cspB信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述木聚糖酶为木聚糖酶xynA，所述木聚糖酶xynA基因如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述木聚糖酶基因的下游连接有组氨酸标签。

进一步的，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种木聚糖酶的表达系统，所述表达系统包括谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒杆菌转化有上述重组载体。

本发明还提供了上述重组载体在制备木聚糖酶中的应用。

本发明还提供了上述表达系统在制备木聚糖酶中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：培养菌体、收集菌体培养液和纯化。

更进一步的，所述收集菌体培养液采用离心方式，条件为转速12000 rpm，4℃离心5 min，收集上清。

更进一步的，所述纯化采用镍柱进行亲和层析，然后采用脱盐柱脱盐，亲和层析中用于平衡、上样的缓冲液A为：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B为：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。

本发明的重组载体中，AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列、SD序列、cspB信号肽和木聚糖酶基因构成双顺反子结构，能够实现木聚糖酶于谷氨酸棒杆菌的高分泌表达，酶活达到486.2 U/ml。

附图说明

图1为载体pXMJ19-AH6-SD-cspB-xynA的结构图。

图2为载体pXMJ19-AH6-SD-0949-xynA的结构图。

图3为表达木聚糖酶的SDS-PAGE图，其中泳道M为蛋白Marker，泳道1为野生型培养物上清，泳道2为带有pXMJ19空质粒的培养物上清，泳道3为带有pXMJ19-AH6-0949-xynA的培养物上清，泳道4为带有pXMJ19-AH6-cspB-xynA的培养物上清，泳道5为纯化的木聚糖酶，箭头所指为木聚糖酶蛋白条带。

图4为表达木聚糖酶的Western-blot图，其中，泳道1为带有pXMJ19-AH6-SD-0949-xynA的培养物上清，泳道2为带有pXMJ19-AH6-SD-cspB-xynA的培养物上清，泳道3为纯化的木聚糖酶。

具体实施方式

谷氨酸棒杆菌，保藏编号为CGMCC1.15647，保藏日期为2016年3月，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏方式为公开寄存，本领域技术人员均能获取。

大肠杆菌DH5α均购自中国高校微生物资源数据平台。

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen，XhoI和EcoRI酶、T4连接酶购自Thermo；

带有pXMJ19-AH6-SD-cspB的大肠杆菌DH5α、带有pXMJ19-AH6-SD-0949的大肠杆菌DH5α购自苏州泓迅生物科技股份有限公司。

实施例1

一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体pXMJ19-AH6-SD-cspB-xynA，所述重组载体包括可操作性连接的序列原件：AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列、SD序列、cspB信号肽和木聚糖酶基因，AH6启动子、5’UTR及其前38bp序列和SD序列连接构成的片段其序列如SEQ ID NO.1所示，cspB信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示，所述木聚糖酶为木聚糖酶xynA，所述木聚糖酶xynA基因如SEQ ID NO.3所示（基因编号为：GenBank:AL939125.1），所述木聚糖酶基因的下游连接有组氨酸标签，所述重组载体的序列如SEQ IDNO.4所示。

实施例2

上述重组载体pXMJ19-AH6-SD-cspB-xynA和含该重组载体的谷氨酸棒杆菌转化体AH6-SD-cspB-xynA的制备方法如下：

1）在无菌的50 ml离心管中加入3 ml的LB培养基，加入1.5 ul的34 mg/ml的氯霉素抗生素；

2）挑取带有pXMJ19-AH6-SD-cspB的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中，在37℃，230rpm条件下培养12 h，以扩增上述质粒pXMJ19-AH6-SD-cspB，pXMJ19-AH6-SD-cspB的序列如SEQ ID NO.5所示；

3）根据Axygen质粒提取试剂盒的说明书提取pXMJ19-AH6-cspB质粒；

4）以引物xynAF和xynAR从PUC-xynA载体上扩增出木聚糖酶基因，PUC-xynA载体由，所用的引物如下：

xynAF：ccgctcgaggccgagagcacgctcggcg

xynAR：ccggaattctcagtggtggtggtggtggtgggtgcgggtccagcgttggttg

PCR条件如下：

95℃ 4min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 7min。

5）回收PCR产物并以XhoI和EcoRI酶切，用T4 DNA连接酶连接到同样经过XhoI和EcoRI酶切的AH6-cspB载体上，别得到pXMJ19-AH6-cspB-xynA；

6）将构建好的载体转入大肠杆菌进行扩增，得到大量质粒，提取后，用电转化的方法转入到谷氨酸棒杆菌，获得谷氨酸棒杆菌转化体AH6-SD-cspB-xynA，在LBHIS恢复培养基（酵母粉：5 g，蛋白胨：10 g，NaCl：10 g，脑心浸出液：37 g，山梨醇：182 g，溶于2 L的单蒸水中）30℃培养。

采用上述方法制备对照载体pXMJ19-AH6-SD-0949-xynA和对照谷氨酸棒杆菌转化体AH6-SD-0949-xynA、谷氨酸棒杆菌转化体pXMJ19（空质粒），载体pXMJ19-AH6-cspB-xynA、载体pXMJ19-AH6-SD-0949-xynA结构分别如图1、图2所示，pXMJ19-AH6-SD-0949的序列如SEQ ID NO.6所示，pXMJ19-AH6-SD-0949-xynA序列如SEQ ID NO.7所示，其中，信号肽0949为现有技术中公开的介导外分泌效果较佳的信号肽，出自Watanabe, K., Teramoto, H.,Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. 2013.SigB的失活对木聚糖酶分泌表达蛋白的影响.ApplMicrobiolBiotechnol, 97(11), 4917-26.（Watanabe, K., Teramoto, H., Suzuki,N., Inui, M., Yukawa, H. 2013. Influence of SigB inactivation onCorynebacterium glutamicum protein secretion. Appl Microbiol Biotechnol, 97(11), 4917-26.）。

实施例3

木聚糖酶的制备和鉴定

1）将长出的转化体转接到装有50 ml培养基的250 ml的三角瓶中进行培养，培养条件为30℃,230 rpm培养48 h。

2）用离心的方法收集培养物上清，条件为转速12000 rpm，4℃离心5 min，收集上清；

取30 ml的上清用镍柱进行纯化，所用的仪器为AKTA蛋白纯化仪，纯化试剂：缓冲液A为：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B 为：300mM NaCl，250mM咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。首先用A液冲平衡镍柱，将过滤后的上清上样至用A液平衡好的镍柱，继续用A液平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积；用125mM的B液洗脱，收集洗脱的洗脱液，每管收集0.7ml，c、用脱盐柱对收集的洗脱液脱盐后收集，获得纯化的木聚糖酶容易，-20℃保存。

2）脱盐用的缓冲液为50 mM的PBS缓冲液，pH7.4。

3）木聚糖酶的鉴定：

a、 SDS-PAGE鉴定

将10 ul培养物上清及纯化洗脱液进行SDS-PAGE，以检测蛋白的表达量和纯化的纯度，结果如图3所示，其中泳道M为蛋白Marker，泳道1为野生型（谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647）培养物上清，泳道2为带有pXMJ19空质粒的培养物上清，泳道3为带有pXMJ19-AH6-0949-xynA的培养物上清，泳道4为带有pXMJ19-AH6-cspB-xynA的培养物上清，泳道5为纯化的木聚糖酶，箭头所指为木聚糖酶蛋白条带。

b、 Western blot鉴定

在SDS-PAGE之后，不进行染色，切下胶之后，在电转仪中将蛋白转印到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，用PBST洗3次，每次10 min，用HRP-conjugated anti-His抗体按1:10000倍进行孵育1 h后，用PBST洗3次，每次10 min，加显色液，在成像仪中拍照。结果如图4所示，泳道1为带有pXMJ19-AH6-0949-xynA的培养物上清，泳道2为带有pXMJ19-AH6-cspB-xynA的培养物上清，泳道3为纯化的木聚糖酶。

c、木聚糖酶活性的鉴定

1、将0.05 mL XylX6试剂分别加入到试管的底部，并在40℃水浴锅孵育3 min。

2、将稀释过的酶液在40℃水浴锅孵育3 min。

3、在含有XylX6试剂的试管中，加入0.05 mL的木聚糖酶稀释液，混合均匀，40℃孵育10 min；

4、加入1.5 mL的终止液，混合均匀。

5、对照组为将1.5 mL的终止液加入到0.05 mL预热的XylX6试剂中，40℃孵育10min后，然后加0.05 mL的稀释的酶。

6、测400 nm下实验组和对照组反应液的吸光度。

一个酶活力单位定义为为上述测定条件下，每分钟水解XylX6底物释放20 nmol4-nitrophenol所需的酶量。

测得的酶活结果为，在带有pXMJ19-AH6-0949-xynA的培养物上清中检测不到木聚糖酶活性，SDS-PAGE和Western blot也不能在上清中检测到；而在带有pXMJ19-AH6-cspB-xynA培养物上清中检测到的酶活为486.2 U/ml，在SDS-PAGE和Western blot中也能检测到木聚糖酶条带。说明本实施例的重组载体pXMJ19-AH6-SD-cspB-xynA能够实现木聚糖酶于谷氨酸棒杆菌的分泌表达，并且具有较高的表达量。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种适用于谷氨酸棒杆菌分泌表达木聚糖酶的重组载体、表达系统和应用

<130> 2019

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 236

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

agatcttcga gctcaagaag gaactgagag gtatcaagga tgccggcatc taagtcagct 60

tgctcactta aagcttcgaa ataagccctt aaactctcat tcttttgtta gacttgttca 120

ctaattacag acatccaggg gcttagattt ttaacccctg tcataagttt ttgggaaggt 180

cacatgagcg agaattacag caagattgtc gttggcactg aaaaggagga caacta 236

<210> 2

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

atgtttaaca atcgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggac ttgttgttcc agcattcgct caggaaacca ct 102

<210> 3

<211> 1311

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gccgagagca cgctcggcgc cgcggcggcg cagagcggcc gctacttcgg caccgccatc 60

gcctcgggca ggctgagcga ctcgacgtac acgtcgatcg cgggccgtga gttcaacatg 120

gtgacggccg agaacgagat gaagatcgac gccaccgaac cgcagcgggg ccagttcaac 180

ttcagctccg ccgaccgcgt ctacaactgg gcggtgcaga acggcaagca ggtgcgcggc 240

cacaccctgg cctggcactc ccagcagccc ggctggatgc agagcctcag cggcagcgcg 300

ctgcgccagg cgatgatcga ccacatcaac ggcgtgatgg cccactacaa gggcaagatc 360

gtccagtggg acgtcgtgaa cgaggccttc gccgacggca gttcgggagc gcggcgggac 420

tccaacctgc aacgcagcgg caacgactgg atcgaggtcg ccttccgcac cgcgcgcgcc 480

gccgacccgt ccgccaagct ctgctacaac gactacaacg tcgagaactg gacctgggcc 540

aagacccagg ccatgtacaa catggtgcgg gacttcaagc agcgcggcgt gccgatcgac 600

tgcgtcggct tccagtcgca cttcaacagc ggcagcccct acaacagcaa cttccgcacc 660

acactgcaga acttcgccgc cctcggcgtc gacgtggcca tcaccgagct ggacatccag 720

ggcgccccgg cctcgaccta cgccaacgtg accaacgact gcctggccgt ctcgcgctgc 780

ctcggcatca ccgtctgggg tgtgcgcgac agcgactcct ggcggtcgga gcagacgccg 840

ttgctgttca acaacgacgg cagcaagaag gccgcgtaca ccgccgtcct cgacgcactc 900

aacggcggcg actcctcgga gccccccgcg gacgggggac agatcaaggg cgtcggttcg 960

ggccgctgcc tcgacgtgcc cgacgccagc acctccgacg gcacccagct ccagctgtgg 1020

gactgccaca gcggcaccaa ccagcagtgg gccgccactg acgcgggcga gctcagggtc 1080

tacggcgaca agtgcctgga cgccgcaggc accggcaacg gctccaaggt ccagatctac 1140

agctgctggg gcggcgacaa ccagaagtgg cgcctcaact ccgacgggtc cgtcgtcggc 1200

gtccagtccg gcctctgcct cgacgccgtc gggaacggca cggccaacgg caccctgatc 1260

cagctgtaca cctgctccaa cggcagcaac caacgctgga cccgcacctg a 1311

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<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

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cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 120

cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 180

ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 240

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 300

ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 360

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gcgtttctac aaactctttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 480

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cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 660

catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 720

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ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 1020

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 1080

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 1140

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 1200

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 1260

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 1320

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 1380

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 1440

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 1500

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1560

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttggggtg 1620

ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg ctggaggatc atccagccat tcggggtcgt 1680

tcactggttc ccctttctga tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg 1740

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gaaacactag ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct 1860

agggcttgca tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg 1920

tgctcaatgc actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt 1980

gggttagaca ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa 2040

cgcggcgatc atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc 2100

ctcacgtagt gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc 2160

ttctagtgct tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc 2220

ttcttgtagt tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt 2280

tcctgcgata tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg 2340

cagtgctcct gttactagtc gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc 2400

acatgcagtc atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag 2460

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agatcaccaa tagtaaggct ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg 3000

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cgatggtgaa aacatctcag tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct 3300

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tgttgttctt ggatcgtcca ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt 3420

tttcccgctg gtctgctggt gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg 3480

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tcgctaaggg catgtctcag gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt 3600

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aatcaacccg cgttgctgtt gctttggtga agcccgatga ttggaaactg attcagtctg 3900

atttcgcggt taggcagtac gttctcgatt gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg 3960

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tcgttatgga tgatgtggac ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc 4080

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ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 4680

cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 4740

aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 4800

ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 4860

tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 4920

tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 4980

caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 5040

tcgtcgaagc tcggcggatt tgtcctactc aagctgatcc gacaaaatcc acacattatc 5100

ccaggtgtcc ggatcggtca aatacgctgc cagctcatag accgtatcca aagcatccgg 5160

ggctgatccc cggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat 5220

tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgtgg tttgccccag 5280

caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 5340

atcgtcgtat cccactaccg agatatcaga tcttcgagct caagaaggaa ctgagaggta 5400

tcaaggatgc cggcatctaa gtcagcttgc tcacttaaag cttcgaaata agcccttaaa 5460

ctctcattct tttgttagac ttgttcacta attacagaca tccaggggct tagattttta 5520

acccctgtca taagtttttg ggaaggtcac atgagcgaga attacagcaa gattgtcgtt 5580

ggcactgaaa aggaggacaa ctaatgttta acaatcgtat ccgcactgca gctctcgctg 5640

gtgcaatcgc aatctccacc gcagcttccg gacttgttgt tccagcattc gctcaggaaa 5700

ccactctcga ggccgagagc acgctcggcg ccgcggcggc gcagagcggc cgctacttcg 5760

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aggtgcgcgg ccacaccctg gcctggcact cccagcagcc cggctggatg cagagcctca 6000

gcggcagcgc gctgcgccag gcgatgatcg accacatcaa cggcgtgatg gcccactaca 6060

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tgccgatcga ctgcgtcggc ttccagtcgc acttcaacag cggcagcccc tacaacagca 6360

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tggacatcca gggcgccccg gcctcgacct acgccaacgt gaccaacgac tgcctggccg 6480

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tcgacgcact caacggcggc gactcctcgg agccccccgc ggacggggga cagatcaagg 6660

gcgtcggttc gggccgctgc ctcgacgtgc ccgacgccag cacctccgac ggcacccagc 6720

tccagctgtg ggactgccac agcggcacca accagcagtg ggccgccact gacgcgggcg 6780

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tccagatcta cagctgctgg ggcggcgaca accagaagtg gcgcctcaac tccgacgggt 6900

ccgtcgtcgg cgtccagtcc ggcctctgcc tcgacgccgt cgggaacggc acggccaacg 6960

gcaccctgat ccagctgtac acctgctcca acggcagcaa ccaacgctgg acccgcaccc 7020

accaccacca ccaccactga 7040

<210> 5

<211> 6137

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5