阅读说明：本技术 一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系统、应用和木聚糖酶的制备方法 (It is a kind of suitable for the recombinant expression carrier of Corynebacterium glutamicum, exogenous protein expression system, the preparation method of application and zytase ) 是由 刘秀霞 张伟 白仲虎 杨艳坤 于 2018-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,该表达载体适用于在谷氨酸棒杆菌中表达外源蛋白并具有较高的表达水平。一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,其特征在于：所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为?cspB启动子、信号肽为?cspB信号肽,所述?cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示,?cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明中的外源蛋白在表达过程中,在信号肽的引导下,表达的外源蛋白能分泌到胞外,不需要经过菌体破碎,分泌出的外源蛋白相对于胞内表达易于纯化；且无胞外蛋白酶,分泌出的外源蛋白在培养基中较为稳定。此外,本发明还提供了外源蛋白的外源蛋白表达系统、应用和外源蛋白的制备方法。(The present invention provides a kind of recombinant expression carrier suitable for Corynebacterium glutamicum, which is suitable for expressing foreign protein and expression with higher in corynebacterium glutamicum.A kind of recombinant expression carrier suitable for Corynebacterium glutamicum, it is characterized by: the promoter of foreign protein genes is cspB promoter in the recombinant expression carrier, signal peptide is cspB signal peptide, the nucleotide sequence of the cspB promoter is as shown in SEQ ID NO:3, and the nucleotide sequence of cspB signal peptide is as shown in SEQ ID NO:4.Foreign protein in the present invention is during expression, and under the guidance of signal peptide, the foreign protein of expression can be secreted into extracellular, needs not move through bacterial cell disruption, the foreign protein secreted out of is easy to purify relative to intracellular expression；And without extracellular protease, the foreign protein secreted out of is relatively stable in the medium.In addition, the present invention also provides the exogenous protein expression systems of foreign protein, the preparation method of application and foreign protein.)

一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系 统、应用和木聚糖酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系统、应用和木聚糖酶的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是一种高GC含量的革兰氏阳性菌，广泛用于工业规模生产氨基酸，如谷氨酸和有机酸等。近年来，除作为氨基酸的生产之外，谷氨酸棒杆菌还被用来作为外源蛋白表达宿主。已经成功用谷氨酸棒杆菌表达出的蛋白有Fab，scFv和vhh等。相对于常用来表达外源蛋白的大肠杆菌来说，由于谷氨酸棒杆菌是一种GRAS（Generally Recognized AsSafe）菌，无内毒素并且其细胞膜为单层，外源蛋白易于分泌到胞外，不需要经过破碎，而胞内表达需要破碎，纯化前处理成本较高；较少在胞外检测到蛋白酶存在，所以分泌到胞外的蛋白较为稳定。

因此，有必要对现有载体中的关键元件，例如外源蛋白基因相应的启动子、信号肽，进行设计，使得外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达并具有较高的表达水平。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，该表达载体适用于在谷氨酸棒杆菌中表达外源蛋白并具有较高的表达水平。

其技术方案是这样的，一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为∆cspB启动子、信号肽为∆cspB信号肽，所述∆cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，∆cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

进一步的，所述重组表达载体的外源蛋白基因下游添加有组氨酸标签。

进一步的，所述外源蛋白基因为木聚糖酶基因，所述重组表达载体的载体骨架为pxmj19质粒。

进一步的，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌转入有上述任一所述的重组表达载体。

本发明还提供了上述重组表达载体在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶的应用。

本发明还提供了木聚糖酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）获取木聚糖酶基因，所述的木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）在所述的木聚糖酶基因下游添加组氨酸标签，获得改造后的木聚糖酶基因；

（3）将改造后的木聚糖酶基因和∆cspB启动子和信号肽连接到载体pxmj19上，获得重组表达载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA，所述载体pxmj19的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述∆cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，∆cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

（4）将所述重组表达载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；

（5）培养所述重组菌，分泌表达木聚糖酶；

（6）木聚糖酶的纯化，包括：

a、将重组菌的培养物进行离心，获得含有木聚糖酶的上清；

b、将所述含有木聚糖酶的上清进行亲和层析，介质为镍柱，获得含有木聚糖酶的洗脱液；

c、将所述含有木聚糖酶的洗脱液进行脱盐，获得纯化的木聚糖酶溶液。

进一步的，所述重组表达载体的苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，步骤（6）中，亲和层析中用的平衡、上样的缓冲液A为：300 mMNaCl，20mMTris，pH 8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B为：300 mMNaCl，20 mMTris，250 mM咪唑，pH8.0的缓冲液。

近一点，步骤（6）中，所述脱盐的介质为脱盐柱。

本发明的有益效果如下：（1）以谷氨酸棒杆菌为代表的安全外源蛋白的表达宿主，相对于会产生内毒素和具有双层膜的宿主大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌不产内毒素，比较安全，单层细胞膜有利于外源蛋白分泌到胞外；（2）本发明中的外源蛋白在表达过程中，在信号肽的引导下，表达的外源蛋白能分泌到胞外，不需要经过菌体破碎，分泌出的外源蛋白相对于胞内表达易于纯化；且无胞外蛋白酶，分泌出的外源蛋白在培养基中较为稳定；（3）在外源蛋白的末端加有组氨酸标签，只需一步亲和层析纯化便可以得到较纯的外源蛋白，相对于大肠杆菌的胞内表达纯化较为简单。

生物保藏说明

拉丁学名：Corynebacterium glutamicum；

中文译名：谷氨酸棒杆菌

保藏单位全称：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年5月3日

保藏编号：CGMCC1.15647。

附图说明

图1为pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA载体结构图。

图2为pxmj19-cspB-cspA-xynA载体结构图。

图3为表达木聚糖酶的SDS-PAGE图，图中泳道1为蛋白Marker，泳道2为含有木聚糖酶上清，泳道3为纯化的流穿液上清，余下泳道为纯化的木聚糖酶。箭头所指为木聚糖酶蛋白条带。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下述实施例以木聚糖酶为目的蛋白，即外源蛋白，由于启动子和信号肽为分泌表达的关键元件，所以表达的目的蛋白不限于木聚糖酶，载体也不限于pxmj19。

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是自然界中广泛存在、含量仅次于纤维素的可再生多糖资源。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中关键的水解酶之一，是通过内切作用方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶类，其水解产物主要为还原糖木糖以及木二糖、木三塘等低聚木糖，还有少量***糖。

木聚糖酶在造纸业（酶法脱墨后的纸浆具有高白度、高自由度和低残留墨，减少减缓化学方法带来的环境污染，是一种环保的方法）、饲料工业（降解不能被消化的半纤维素，有利于可利用多糖的降解，增加动物饲料的利用率）和食品工业（小麦面粉改良，消除发酵过度危害，提高面团的加工机械性能，改善面包芯质地以及延缓老化等）等工业生产中都具有较大的应用价值。

质粒提取AxyPrep Plasmid Miniprep Kit和AxyPrep DNA胶回收试剂盒购自Axygen，EcoRV和EcoRI内切酶购自Thermo，同源重组试剂盒ClonExpress Ultra One StepCloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；镍柱为1 ml His-Tag，购自Roche；脱盐柱为G25脱盐柱，购自加莱克。木聚糖酶检测试剂盒endo-XYLANASE ASSAY PROCEDURE购自Megazyme公司；pxmj19购自普如汀生物技术（北京）有限公司。

实施例1木聚糖酶的重组表达载体

木聚糖酶的重组表达载体，重组表达载体中木聚糖酶基因的启动子为∆cspB启动子、木聚糖酶基因的信号肽为∆cspB信号肽，∆cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，∆cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，重组表达载体的木聚糖酶基因下游添加有组氨酸标签，重组表达载体的载体骨架为pxmj19质粒，该重组载体命名为pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。重组载体命名为pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA的制备参见实施例3的步骤（1）。

实施例2 木聚糖酶的外源蛋白表达系统

木聚糖酶的外源蛋白表达系统，宿主菌为谷氨酸棒杆菌，载体为实施例1的重组载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA。

实施例3木聚糖酶的制备

（1）载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA的制备。

在24孔板中加入2ml的LB培养基，加入1ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；

将带有pxmj19载体的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中，在37℃，230rpm的条件下培养12h，以扩增pxmj19质粒；

根据Axygen质粒小提试剂盒的说明书提取pxmj19质粒；

以引物xynA上和xynA下从Puc-19-xynA（由苏州鸿讯生物科技有限公司合成）载体上扩增出xynA基因（序列号为：AL939125.1）；以引物PS2上和PS2下从谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647基因组中扩增出∆cspB启动子和∆cspB信号肽（∆cspB启动子和∆cspB信号肽并由苏州鸿讯生物科技有限公司测序），以引物BA上和BA下从Puc-BA载体上扩增出cspB启动子和cspA信号肽，所用的引物如下：

xynA上：gccgagagcacgctcggcgc

xynA下：acagccaagctgaattctcagtggtggtggtggtggtgggtgcgggtccagcgttggttg

PS2上：cccactaccgagatatccttgaataataattgcaccgcacaggtgatacat

PS2下：cgagcgtgctctcggcagtggtttcctgagcgaatgctg

BA上：cccactaccgagatatcgatatccaaattcctgtgaattag

BA下：cgagcgtgctctcggctgccgttgccacaggtg

PCR条件如下：

95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 7min。

根据胶回收回收试剂盒说明书回收PCR产物，并以EcoRI和EcoRV酶切pxmj19载体，按试剂盒说明书通过同源重组法将xynA基因和∆cspB启动子和∆cspB信号肽连接到经EcoRI和EcoRV酶切的pxmj19载体上，得到pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA重组载体，其结构如图1所示；同样将xynA基因和cspB启动子和cspA信号肽连接到经EcoRI和EcoRV酶切的pxmj19载体上，得到pxmj19-cspB-cspA-xynA，其结构如图2所示，cspB-cspA来自于文献“谷氨酸棒杆菌细胞壁蛋白CspB和PBP1a的双突变能提高抗体Fab片段的分泌表达量（MatsudaY, Itaya H, Kitahara Y, et al. Double mutation of cell wall proteins CspB andPBP1a increases secretion of the antibody Fab fragment from Corynebacteriumglutamicum. Microb Cell Fact, 2014, 13. ）”。

（2）构建重组菌

将构建好的pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA和pxmj19-cspB-cspA-xynA载体转入大肠杆菌DH5α中，从扩大培养的大肠杆菌中提取得到大量的质粒，通过电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中，在LBHIS恢复培养基（酵母粉：5 g，蛋白胨：10 g，NaCl：10 g，脑心浸出液：37 g，山梨醇：182 g，溶于2 L的单蒸水中）中30 ℃培养。

（3）培养重组菌，分泌表达木聚糖酶

将长出的转化子转接到装有30ml BHI（37.5 g脑心浸出液溶于1 L的单蒸水中）培养基的250ml的三角瓶中进行培养，培养条件为30℃，230rpm培养48h。

（4）木聚糖酶的纯化

a、通过离心法收集重组菌培养物上清，条件为转速12000rpm，4℃离心5min，收集含有木聚糖酶的上清；

b、取40ml的上清用镍柱进行纯化，仪器为AKTA蛋白纯化仪，纯化的条件为：A液（20mM的Tris，300mM NaCl，pH8.0），B液（A液中带有250mM的咪唑，pH8.0）。首先用A液冲平衡镍柱，将过滤后的上清上样至用A液平衡好的镍柱，继续用A液平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积；用125mM的B液洗脱，收集洗脱的洗脱液，每管收集0.7ml，c、用脱盐柱对收集的洗脱液脱盐后收集，获得纯化的木聚糖酶容易，-20℃保存。

脱盐用的缓冲液为50mM的PBS缓冲液，pH为7.0。

实施例4 木聚糖酶的鉴定

（1）SDS-PAGE鉴定

取10ul的上清及纯化洗脱液进行SDS-PAGE，以检测蛋白的条带大小及纯化的纯度，结果如图3所示，相对于流穿液，带有重组木聚糖酶载体的上清条带会多出一条约48kD的条带，且纯化结果也会有单一的条带，如图2所示，泳道1为蛋白Marker，泳道2为含有木聚糖酶的上清，泳道3为流穿液，其余泳道为纯化的木聚糖酶。

（2）木聚糖酶活性的测定

操作步骤（按照木聚糖酶检测试剂盒进行）：

1、将0.05 mL XylX6试剂分别加入到试管的底部，并在40℃水浴锅孵育3 min；

2、将稀释过的酶液在40℃水浴锅孵育3 min；

3、在含有XylX6试剂的试管中，加入0.05 mL的木聚糖酶稀释液，混合均匀，40℃孵育10min；

4、加入1.5 mL的终止液，混合均匀；

5、对照组为将1.5 mL的终止液加入到0.05 mL预热的XylX6试剂中，40℃孵育10 min后，然后加0.05 mL的稀释的酶；

6、测400 nm下实验组和对照组反应液的吸光度。

一个酶活力单位定义为为上述测定条件下，每分钟水解XylX6底物释放1 umol 4-nitrophenol所需的酶量。

测得的结果为带有重组表达载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA的谷氨酸棒杆菌木聚糖酶产量为596.7 U/mL。而带有pxmj19-cspB-cspA-xynA个谷氨酸棒杆菌产木聚糖酶量为486.6 U/mL。本文中的∆cspB-∆cspB-xynA组合分泌出的木聚糖酶的产量相较于cspB-cspA-xynA组合提升了20%。

上述实验鉴定结果表明通过本发明的上述制备方法能够成功制备具有活性的木聚糖酶，并且具有较高的表达水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 木聚糖酶的重组表达载体、表达系统、应用和木聚糖酶的生产方法

<130> 2018

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gccgagagca cgctcggcgc cgcggcggcg cagagcggcc gctacttcgg caccgccatc 60

gcctcgggca ggctgagcga ctcgacgtac acgtcgatcg cgggccgtga gttcaacatg 120

gtgacggccg agaacgagat gaagatcgac gccaccgaac cgcagcgggg ccagttcaac 180

ttcagctccg ccgaccgcgt ctacaactgg gcggtgcaga acggcaagca ggtgcgcggc 240

cacaccctgg cctggcactc ccagcagccc ggctggatgc agagcctcag cggcagcgcg 300

ctgcgccagg cgatgatcga ccacatcaac ggcgtgatgg cccactacaa gggcaagatc 360

gtccagtggg acgtcgtgaa cgaggccttc gccgacggca gttcgggagc gcggcgggac 420

tccaacctgc aacgcagcgg caacgactgg atcgaggtcg ccttccgcac cgcgcgcgcc 480

gccgacccgt ccgccaagct ctgctacaac gactacaacg tcgagaactg gacctgggcc 540

aagacccagg ccatgtacaa catggtgcgg gacttcaagc agcgcggcgt gccgatcgac 600

tgcgtcggct tccagtcgca cttcaacagc ggcagcccct acaacagcaa cttccgcacc 660

acactgcaga acttcgccgc cctcggcgtc gacgtggcca tcaccgagct ggacatccag 720

ggcgccccgg cctcgaccta cgccaacgtg accaacgact gcctggccgt ctcgcgctgc 780

ctcggcatca ccgtctgggg tgtgcgcgac agcgactcct ggcggtcgga gcagacgccg 840

ttgctgttca acaacgacgg cagcaagaag gccgcgtaca ccgccgtcct cgacgcactc 900

aacggcggcg actcctcgga gccccccgcg gacgggggac agatcaaggg cgtcggttcg 960

ggccgctgcc tcgacgtgcc cgacgccagc acctccgacg gcacccagct ccagctgtgg 1020

gactgccaca gcggcaccaa ccagcagtgg gccgccactg acgcgggcga gctcagggtc 1080

tacggcgaca agtgcctgga cgccgcaggc accggcaacg gctccaaggt ccagatctac 1140

agctgctggg gcggcgacaa ccagaagtgg cgcctcaact ccgacgggtc cgtcgtcggc 1200

gtccagtccg gcctctgcct cgacgccgtc gggaacggca cggccaacgg caccctgatc 1260

cagctgtaca cctgctccaa cggcagcaac caacgctgga cccgcacctg a 1311

<210> 2

<211> 6601

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 60

cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120

cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180

gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240

catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300

ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360

gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420

ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480

tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 660

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 720

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 780

tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 840

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 900

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140

cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 1680

agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 1740

ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 1800

tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 1860

actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 1920

ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 1980

aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 2040

agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 2100

cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 2160

gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 2220

gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 2280

gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 2340

cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 2400

ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 2460

cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 2520

ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 2580

ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 2640

gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 2700

aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 2760

catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 2820

agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 2880

taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 2940

gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc 3000

accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 3060

tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 3120

gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 3180

actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac 3240

aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg 3300

gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt 3360

gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg 3420

ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc 3480

cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 3540

aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 3600

aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660

acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720

gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 3780

tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt 3840

gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca 3900

acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc 3960

gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa 4020

cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt 4080

atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat 4140

ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg 4200

cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact 4260

atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 4320

ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 4380

gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 4440

tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 4500

tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 4560

acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 4620

cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 4680

ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 4740

tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 4800

gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 4860

tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 4920

ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 4980

tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040

gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 5100

gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 5160

tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 5220

atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 5280

ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 5880

gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 6120

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 6180

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240

tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300

cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 6360

cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420

tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480

ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 6540

atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600

t 6601

<210> 3

<211> 493

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

ataattgcac cgcacaggtg atacatactt acctcctcaa gtagtccgag gttaagtgtg 60

ttttaggtga acaaatttca gtttcaggta gaaaactttc gacccgcttc agagtttcta 120

ttagtaaatc tgacaccact tgattaaatg gtctaccccc gaattggggg atgggttatt 180

ttttgctatg aacgtagttt tggtgcatat gacctgcgtt tataaagaaa tataaacgtg 240

atcagatcga tataaaagaa acagtttgta ctcaggtttg aagctttttc ttcgattcgc 300

ctggcaagaa tctcaattgt cgcttacagt ttttctcaac gacaggctgc taagctgcta 360

gttcggtggc ctagtgagtg gcgtttactt gaatgaaaag taatcccatg tcgtgatcag 420

ccaatttggg ttgtgtcaaa gcaattcaaa ggtttcatct ttcgatatcc tattcaagga 480

gaccctcgcc tct 493

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

atgtttaaca atcgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggac ttgttgttcc agcattcgct caggaaacca ct 102

<210> 5

<211> 7291

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gaattcagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat 60

cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 120

cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 180

ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 240

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 300

ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 360

ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 420

gcgtttctac aaactctttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 480

gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 540

acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 600

cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 660

catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 720

tccaatgatg agcacttttg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 780

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 840

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 900

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 960

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 1020

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 1080

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 1140

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 1200

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 1260

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 1320

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 1380

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 1440

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 1500

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1560

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttggggtg 1620

ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg ctggaggatc atccagccat tcggggtcgt 1680

tcactggttc ccctttctga tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg 1740

ggggttgctg atttttgcga gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat 1800

gaaacactag ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct 1860

agggcttgca tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg 1920

tgctcaatgc actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt 1980

gggttagaca ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa 2040

cgcggcgatc atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc 2100

ctcacgtagt gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc 2160

ttctagtgct tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc 2220

ttcttgtagt tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt 2280

tcctgcgata tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg 2340

cagtgctcct gttactagtc gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc 2400

acatgcagtc atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag 2460

ggggcggagc caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga 2520

gcaccggggc acctagtcgc ggataccccc cctaggtatc ggacacgtaa ccctcccatg 2580

tcgatgcaaa tctttaacat tgagtacggg taagctggca cgcatagcca agctaggcgg 2640

ccaccaaaca ccactaaaaa ttaatagtcc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac 2700

caactcatat gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact 2760

agctaagaca acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc gcacaacatc 2820

gggtctaggt aacactgagt aacactgaaa tagaagtgaa cacctctaag gaaccgcagg 2880

tcaatgaggg ttctaaggtc actcgcgcta gggcgtggcg taggcaaaac gtcatgtaca 2940

agatcaccaa tagtaaggct ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg 3000

cggtgtcctg gtcgtctaac ggtgcttcgc agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc 3060

gctgggggtc acctctggct gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta 3120

ttgctactaa gaatcacttg gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc 3180

gacacaaccg ctcacagtca tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt 3240

cgatggtgaa aacatctcag tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct 3300

atagtgacta tgaggtcaca gactcttggg cgaacggttg gcacttgcac cgcaacatgc 3360

tgttgttctt ggatcgtcca ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt 3420

tttcccgctg gtctgctggt gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg 3480

gggtcaaact tgatcaggtg tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc 3540

tcgctaaggg catgtctcag gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt 3600

cgtacacgcc gtttcagatg ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata 3660

tggacgctgt tttggtggct cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt 3720

cgtcctggtc acgtggggct aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac gctgatgtac 3780

gtcgtgaaat ggaagaagaa ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg 3840

aatcaacccg cgttgctgtt gctttggtga agcccgatga ttggaaactg attcagtctg 3900

atttcgcggt taggcagtac gttctcgatt gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg 3960

cgcaacgtgt cgctaatgag gtgctggcaa gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga 4020

tcgttatgga tgatgtggac ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc 4080

gtgatctgaa tgcggcggtg ttcgcgggta atgagcagac tattcttcgc acccactaaa 4140

agcggcataa accccgttcg atattttgtg cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc 4200

aaactatgat gggtcttgtt gttggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca 4260

tagaaggcgg cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc 4320

atttcgaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 4380

agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat 4440

gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg 4500

tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 4560

tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 4620

ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 4680

cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 4740

aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 4800

ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 4860

tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 4920

tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 4980

caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 5040

tcgtcgaagc tcggcggatt tgtcctactc aagctgatcc gacaaaatcc acacattatc 5100

ccaggtgtcc ggatcggtca aatacgctgc cagctcatag accgtatcca aagcatccgg 5160

ggctgatccc cggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat 5220

tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgtgg tttgccccag 5280

caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 5340

atcgtcgtat cccactaccg agatatcata attgcaccgc acaggtgata catacttacc 5400

tcctcaagta gtccgaggtt aagtgtgttt taggtgaaca aatttcagtt tcaggtagaa 5460

aactttcgac ccgcttcaga gtttctatta gtaaatctga caccacttga ttaaatggtc 5520

tacccccgaa ttgggggatg ggttattttt tgctatgaac gtagttttgg tgcatatgac 5580

ctgcgtttat aaagaaatat aaacgtgatc agatcgatat aaaagaaaca gtttgtactc 5640

aggtttgaag ctttttcttc gattcgcctg gcaagaatct caattgtcgc ttacagtttt 5700

tctcaacgac aggctgctaa gctgctagtt cggtggccta gtgagtggcg tttacttgaa 5760

tgaaaagtaa tcccatgtcg tgatcagcca atttgggttg tgtcaaagca attcaaaggt 5820

ttcatctttc gatatcctat tcaaggagac cctcgcctct atgtttaaca atcgtatccg 5880

cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca gcttccggac ttgttgttcc 5940

agcattcgct caggaaacca ctgccgagag cacgctcggc gccgcggcgg cgcagagcgg 6000

ccgctacttc ggcaccgcca tcgcctcggg caggctgagc gactcgacgt acacgtcgat 6060

cgcgggccgt gagttcaaca tggtgacggc cgagaacgag atgaagatcg acgccaccga 6120

accgcagcgg ggccagttca acttcagctc cgccgaccgc gtctacaact gggcggtgca 6180

gaacggcaag caggtgcgcg gccacaccct ggcctggcac tcccagcagc ccggctggat 6240

gcagagcctc agcggcagcg cgctgcgcca ggcgatgatc gaccacatca acggcgtgat 6300

ggcccactac aagggcaaga tcgtccagtg ggacgtcgtg aacgaggcct tcgccgacgg 6360

cagttcggga gcgcggcggg actccaacct gcaacgcagc ggcaacgact ggatcgaggt 6420

cgccttccgc accgcgcgcg ccgccgaccc gtccgccaag ctctgctaca acgactacaa 6480

cgtcgagaac tggacctggg ccaagaccca ggccatgtac aacatggtgc gggacttcaa 6540

gcagcgcggc gtgccgatcg actgcgtcgg cttccagtcg cacttcaaca gcggcagccc 6600

ctacaacagc aacttccgca ccacactgca gaacttcgcc gccctcggcg tcgacgtggc 6660

catcaccgag ctggacatcc agggcgcccc ggcctcgacc tacgccaacg tgaccaacga 6720

ctgcctggcc gtctcgcgct gcctcggcat caccgtctgg ggtgtgcgcg acagcgactc 6780

ctggcggtcg gagcagacgc cgttgctgtt caacaacgac ggcagcaaga aggccgcgta 6840

caccgccgtc ctcgacgcac tcaacggcgg cgactcctcg gagccccccg cggacggggg 6900

acagatcaag ggcgtcggtt cgggccgctg cctcgacgtg cccgacgcca gcacctccga 6960

cggcacccag ctccagctgt gggactgcca cagcggcacc aaccagcagt gggccgccac 7020

tgacgcgggc gagctcaggg tctacggcga caagtgcctg gacgccgcag gcaccggcaa 7080

cggctccaag gtccagatct acagctgctg gggcggcgac aaccagaagt ggcgcctcaa 7140

ctccgacggg tccgtcgtcg gcgtccagtc cggcctctgc ctcgacgccg tcgggaacgg 7200

cacggccaac ggcaccctga tccagctgta cacctgctcc aacggcagca accaacgctg 7260

gacccgcacc caccaccacc accaccactg a 7291